JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

Transgenik Kemirgen Deneyi sayısallaştırabilmek Erkek Germ Hücre Mutant Frekans

Published: August 06, 2014
doi:
10.3791/51576
, , , , , ,
1Environmental Health Science and Research Bureau, Health Canada,Environmental Health Centre

Summary

De novo mutations in the male germline may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Here we describe a protocol for the use of a transgenic rodent model for quantifying mutations in male germ cells induced by environmental agents.

Abstract

De novo mutations arise mostly in the male germline and may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Traditional methods for assessing the induction of germ cell mutations require the use of large numbers of animals, making them impractical. As such, germ cell mutagenicity is rarely assessed during chemical testing and risk assessment. Herein, we describe an in vivo male germ cell mutation assay using a transgenic rodent model that is based on a recently approved Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD) test guideline. This method uses an in vitro positive selection assay to measure in vivo mutations induced in a transgenic λgt10 vector bearing a reporter gene directly in the germ cells of exposed males. We further describe how the detection of mutations in the transgene recovered from germ cells can be used to characterize the stage-specific sensitivity of the various spermatogenic cell types to mutagen exposure by controlling three experimental parameters: the duration of exposure (administration time), the time between exposure and sample collection (sampling time), and the cell population collected for analysis. Because a large number of germ cells can be assayed from a single male, this method has superior sensitivity compared with traditional methods, requires fewer animals and therefore much less time and resources.

Introduction

Germlin sporadik DNA mutasyonları azaltılmış üreme başarısına yol açabilir ve, miras varsa, yavrular 1-3 kansere genetik hastalık veya artan yatkınlık neden olabilir. Deliller de novo mutasyonlar büyük bir kısmı baba germlinlerinden 4 miras olduğunu gösteriyor ve yavrularda mutasyonların sayısının olumlu anlayışının 5 zamanında baba yaşı ile ilişkili olduğunu. Erkek mutasyonlar daha yüksek oranda cinsiyetler arasındaki gametogenezde sırasında yaş farkı bir sonucu olduğuna inanılıyor, kadın germline'a 2 oogenic hücre bölünmeleri sayısı ile karşılaştırıldığında Spermatogenik hücre bölünmeleri daha fazla sayıda ve DNA ilerici bir düşüş Erkeklerde yaş ile verimliliği onarın. Tüm bu faktörler erkek Germlin 6 çoğaltma hatalarını artan bir olasılık katkıda bulunur. Ancak, baba maruz kalma etkisi Enviro içinnovo mutasyonlar frekansına nmental faktörler hala bilinmemektedir. Bununla birlikte, çevresel etkenlere, çok sayıda kemirgenlerde 7 germ hücreli mutasyonu sağlamak bilinir, ve bu maddelerin bir kısmı, aynı zamanda, insan eşey hattı 8 etkileyebilir montaj kanıt vardır. Bu endişelere rağmen, kimyasal rutin düzenleyici amaçlarla somatik hücrelerinde mutasyona uyarabilme özellikleri açısından test edilir ve genellikle somatik testleri mikrop hattı korumak için yeterli olduğu varsayılmaktadır. Bu nedenle, kimyasal nadiren germ hücre mutasyon indükleme kabiliyetleri bakımından değerlendirilir.

Bir nedeni germ hücre mütagenliği test edilmesi büyük ölçüde düzenleyici karar verme sürecinde ihmal edilmiştir pratik metodolojileri bir eksikliğidir. Böyle baskın 9 ölümcül ve belirli odağı 10 testler gibi geleneksel kemirgen-tabanlı yöntemler, embriyolar veya çocuklarında mutant fenotipleri puanlama tarafından germ hücre mutasyon oranları tahminmaruz anne. Bu deneyler, istatistiksel olarak anlamlı sonuçlar elde etmek için hayvan, zaman ve kaynak çok sayıda kullanılmasını gerektirir.

Germ hücreli mutasyona ölçülmesi için birkaç modern yöntemler son zamanlarda ortaya çıkmış olsa da, birçok onların pratiklik, verimlilik, ve biyolojik alaka açısından eksiklikleri muzdarip. Örneğin, genişletilmiş basit tandem repeat (ESTR) loci uzunluğu mutasyon tekrar tek bir molekülün PCR yaklaşımı 15 kullanılarak erkek germ hücreleri belirlenebilir. Bununla birlikte, bu yöntemin yürütülmesi teknik olarak zor ve zahmetli olabilir ve nokta mutasyonları, farklı olarak, yüksek ölçüde kararsız ESTR lokusların tekrar uzunluğu değişikliklerin, biyolojik, sağlık ve önemi belirsiz 16 kalır. Kalıtsal mutasyonlar 4,17 sorununa uygulandığında Modern tüm genom dizileme teknolojileri biyolojik olarak anlamlı bir veri zenginliği sağlayabilir, ancak yüksek maliyet, yüksek hata oranları, ilgili doğrulama gereklimutasyonları teyit ve biyoinformatik zorluklar hala bir düzenleyici test kapasitesi 18 bu seçeneğin rutin uygulama sınırlamak için.

Burada, transgenik erkek farelerin tohum hücreleri içinde doğrudan uyarılmış mutasyonlar miktarının belirlenmesi için pratik bir yöntem tarif eder. Bu protokol, kromozom 3 19 (Şekil 1) her iki kopya entegre bir Escherichia coli LacZ raportör geni ihtiva eden bir rekombinant faj λgt10 vektörünün çok sayıda birleştirilmiş kopyaları içeren transjenik MutaMouse modeli tarif edilmiştir.

Bu protokol ayrıca aynı ilkeler (BigBlue fare ve sıçan, veya lacZ'dir plazmid fare, vb.) Ya da biraz farklı raportör genler (gtp delta fare ve sıçan dayalı diğer transgenik kemirgen (TGR) modelleri alakalı, TGR modelleri Lambert et gözden ark. 20). Bu yöntem, son zamanlarda piyasaya tarif tgr mutasyon deneyine dayanmaktadırve OECD Test Klavuzu 21 revize ve biz nedeniyle spermatogenez eşsiz özelliklerinden erkek Germlin mutasyonların değerlendirmesini karşılamak için gerekli özel hususlar üzerine koyuyoruz. Kısaca, tahlil öncesi lezyonlar mutasyon mutasyonu kararlı içine sabit bir örnekleme zaman takip eden bir mutajenik madde ile transgenik erkek farelere verilmesi, ışığa maruz bırakılır. Seçilen örnekleme zamanda, fareler öldürülür ve germ hücreleri kauda epididimis ya da seminifer tüp ya da toplanmıştır. Aşağıda tartışıldığı gibi, spermatogenez farklı aşamalarında mutajenik etkileri maruziyet ve örnek toplama arasındaki zamanı seçerek belirlenebilir. Hücre başına λ faj genomunun birden çok kopyasını içeren transgenik uçları, germ hücre genomik DNA izole edilmiştir ve daha sonra bir E. enfekte etmek için kullanılır bulaşıcı λ fag parçacıklarını oluşturmak boş λ faj kapsidleri halinde paketlenmekte coli konakçı. Enfekte edilmiş bakteriler selec yetiştirilmektedirvahşi tip lacZ barındıran hücrelerden lacZ mutasyona uğramış bir kopyası olan bir vektör içeren hücreler ayırabilir tive ortam. Erkek germline maruziyetin mutajenik etkisi (Lambert et al. Bölgesindeki 20, Şekil 2) kontrol ve tedavi edilen fareler arasındaki mutan transgenlerin frekansı karşılaştırılarak belirlenir. Germ hücre sayıda gerekli hayvan sayısını azaltırken, geleneksel yöntemlere göre, bu deney, üstün hassasiyet sağlayan, tek bir fare test edilebilir. Hiçbir özel ekipman veya eğitim gereklidir çünkü bu deney, en modern toksikoloji / moleküler biyoloji laboratuvarlarında germ hücre mutasyonu testi için pratik ve etkili bir seçenek sağlar.

TGR germ hücre mutasyonu tahlil etkin uygulanması için bir temel gereksinim spermatojenik döngüsü (Şekil 3) bir anlayıştır. St ilerleme fare germ hücrelerinde zamanıSonunda spermatogonium spermatositler, spermatidler, ve seminifer tübüllerde em hücreleri (yani. spermatogenez) yaklaşık 49 gündür epididimde sperm olgun. Mutasyon Bu döngüsünün çeşitli aşamalarında meydana gelebilir ve genellikle bileşik özgüdür edebilirsiniz. Erkek germ hücreleri mutajenesise özellikle önemlidir iki temel özellikleri erken mayoz sırasında DNA sentezinin bırakma ve geç post-mayoz sırasında DNA onarım kapasitesi 6 ilerleyici kaybı, bir indüksiyon ve tespiti için gerekli olan iki süreçler çoğu mutasyonlar.

Çünkü Spermatogenezisin bu eşsiz özellikleri, TGR germ hücre mutasyonu tahlil yürütülmesi için üç kritik deneysel değişkenler vardır: (1) test bileşiği uygulama zamanı; (2) numune alma süresi; ve (3) ile germ hücre popülasyonunun seçimi analizi (Şekil 3 ve Tablo 1) için toplayın. Uygulama süresi olan experimeUzun hedef hücreler, test bileşiklerine maruz şeklini belirler ntal değişken. Uygulama süresinin uzunluğu, aynı zamanda belirli bir hücre tipi veya spermatogenez fazlarına maruz hedeflemek için kullanılabilir. Örneğin, tek bir uygulama için uygun şekilde belirli bir hücre tipine bağlı akut maruz kalma etkilerini belirlemek için kullanılabilir. Benzer şekilde, Etki sadece meiotically bölünmesi sperm hücrelerine hedefleyen ya da mitotik 2 hafta yönetim süresi ve uygun bir örnekleme süresi kullanılarak spermatogonium bölünmesi, örneğin bütün bir spermatojenik faza odaklanabilir. Kronik ve alt kronik uygulanması kez test bileşiği yeterli farmakokinetik dağılımını sağlamak, ya da 28 günlük uygulama süresi, OECD testi önerilen örneğin zayıf mutajenler mutasyonların yeterli bir birikimi (izin vermek için, uzun süre maruz kalma etkilerini değerlendirmek için kullanılır kılavuz).

Numune alma zamanı belirlemek için kritik bir değişken olduğunu hangispermatogenez faz hedef hücrelerin maruz kalma sırasında vardı. Örnekleme süresi ne kadar zaman dikte, ve bu nedenle ne kadar fazla spermatojenik döngüsü boyunca, hücrelerin maruz kaldıktan sonra geçer. Örneğin, kök hücre spermatogonyumlarda etkilerini araştırmak için, bir örnekleme zaman> 49 gün> 42 gün tam olarak olgunlaşmış sperm toplamak gerekirse, veya tüm hücreler toplandı için yeterli zaman vardı emin olmak için, seminifer tübüllerin gelen immatür germ hücreleri toplamak eğer maruz gelişir hücreleri kaynaklanıyor. Bu, en az 70 günlük bir örnekleme süresi spermatogenez sonraki aşamalarında maruz kalan hücrelerin ortadan kaldırılması için, bir toksik madde farmakokinetik: dağıtılmak için yeterli zamanı sağlamak için doğru sap hücresi etkisini göstermek için tercih edilir, ve hesaba dikkat etmek önemlidir yüksek mutajenik bileşiklerin 22 maruz kaldıktan sonra ~ 6 hafta oluşabilir geçici kısırlık dönemi. Benzer şekilde, 21 günlük bir örnekleme süresi sperm colle sağlayacakkauda epididimden cted sadece maruz kalma son gününde mayoz tamamlamış olurdu.

Germ hücreleri, KES epididimden veya seminifer tüp çeşitli spermatojenik hücre tiplerinin bir karışımı gibi olgun sperm toplanabilir. Olgun spermlerin doğruluğunda sperm herhangi bir deney dizaynı oluşturulduğu spermatogenez hücre tipi ya da faz ile tespit edilmesini mümkün kılar, ~ 3 gün boyunca cauda kalır. Böylece, kauda sperm izinlerin analizi çok sahne özgü mutasyon etkileri soruşturma hedeflemiştir. Öte yandan, seminifer tüp toplanan hücre süspansiyonları, farklı gelişim safhalarında farklı germ hücre tiplerinin bir karışımını içerir ve bu şekilde mutasyon kökenli olan spermatojenik fazın düşük çözünürlüğe sahiptir. Buna ek olarak, seminifer tüp geri kazanılan hücre süspansiyonları, bir spermatositler ardından spermatidlerin aşırı temsilini, VER içeren eğilimiy birkaç spermatogonia ve kök hücreler (bu oranlar Şekil 3'te mezun beyaz çubuklar tarafından temsil edilmektedir). Ayrıca, seminifer tüp hazırlanır süspansiyonlar da farklı somatik hücre içerebilir. Pek çok hücre tipinin mevcut olduğu için nedenle, mutasyonel etkileri hedef olmayan çeşitli hücreler tarafından etkilenebilir. Ancak, seminifer tübüllerin numune toplama aynı anda birden fazla germ hücre tiplerini ve somatik mutasyon için standart OECD test protokolüne germ hücre analizi kolay entegrasyon taranması için ekonomik bir seçenek sunuyor.

Araştırmacı, uygulama süresi, örnekleme zamanında ve toplanan hücre popülasyonunun ihtiyaçlarına bağlı olarak, önce belirtildiği gibi çeşitli hücre tiplerinde ve spermatogenez farklı aşamalarında ne etkilerinin sorgulamak için ayarlanabilir. Dikkatli Bu değişkenleri seçerek, deney, ya da daha genel bir düzenleyici test için hedeflenen mekanik çalışmalar için tasarlanabiliramaçları ing.

Deneyde yeterlilik elde etmek için, 70 günlük bir örnekleme zaman pozitif kontrol olarak, ardından / kg N-etil-N-nitroso 100 mg (TRK) akut oral uygulama kullanımını tavsiye edilir. Kauda sperm analizi böylece genellikle TRK bu son derece mutajenik dozu takiben kontroller üzerindeki mutant frekansı (MF), 4-5 kat artış sergileyen spermatogoniyal kök hücreleri (Şekil 3), hedefliyor. Bu nedenle daha kısa örnekleme zamanları için uygun bir kontrol bir doz olabilir, bu doz sterilite 6 hafta maruz kaldıktan indüklediği bilinmektedir olduğu not edilmelidir. Bu doz, aynı zamanda en çok somatik dokulardaki 20 MF tespit edilebilir bir artış üretecektir. Aşağıda sunulan sonuçlar temsili için ve 100 mg / kg dahil olmak üzere, üç TRK dozları kullanılarak akut 70 maruz rejimi aşağıdaki üretilmiştir.

Protocol

Hayvancılık, bakım ve kullanım ile ilgili tüm protokoller Sağlık Kanada'nın hayvan bakım komitesi tarafından onaylanmıştır. 1. Hayvan Sergilenmeler Rasgele seçilen yönetim kez uygun bir maruziyet yolu ile test bileşiğinin ve ilgili kontrol ile grupları ve tedavi grupları (dk grup başına = 5) .Treat fareleri kontrol etmek (8-12 haftalık) transgenik erkek fareleri dağıtmak. Ilgi spermatojenik hücre tipi (Şekil 3) göre uygun örnekleme zamanı seçin. Örnekleme süresinden sonra, izofloran anestezisi altında, servikal dislokasyon (veya uygun başka bir yöntemle) fareler euthanize. Dikkatle kauda epididimis karın veya skrotum bir kesiden testisler çizin ve kesip. (Şekil 4, epididim koleksiyonu ayrıntılı bir video görebilirsiniz Duselis ve ark. 24 görüntülemek için). Seminifer tübül analiz Alternatif olarak, eğer testisler toplamaks hücreleri. Daha sonra kullanılmak üzere -80 ° C'de, sıvı azot ve mağaza dondurun. 2. İzolasyon ve Sindirim Kauda Sperm Buz üzerinde kauda epididimiti Defrost. Petri çözülmüş kauda aktarın ve iyice bir neşter veya jilet ile kıyma. Petri kabı oda sıcaklığı ile D-PBS içinde 700 ul ilave edin. Çizim ve D-PBS sperm (yaklaşık 10 kat) ile bulutlu olana kadar süspansiyon bırakarak cauda gelen geniş çaplı bir 1000 ul pipet, serbest sperm kullanma. NOT: Geniş çaplı bir pipet hazırlamak için plastik bir pipet ucundan 2-3 mm kesti. Yeni bir 1.5 ml'lik bir tüp içine, paslanmaz çelik bir ağ filtre içerisinden filtre süspansiyonu. D-PBS ilave bir 700 ul ile Petri yıkayıp ağ filtre içerisinden aynı bir 1.5 ml'lik tübe transfer. Buz üzerinde tüp yerleştirmek, örgü çıkarın. Tekrar kalan numuneler için 2,1-2,3 adımları. 3 dakika boyunca 11.000 xg samplesat Spin. Dikkatle decant süpernatant. Pelet rahatsız kaçının. 1.0 ml soğuk 1x tuzlu sodyum sitrat (SSC) ekleyin. Vorteks kadar pelet tamamen yeniden süspansiyon haline getirilir. Bu bazen vorteks birkaç tur alacaktır. % 10 SDS 15 ul ekleyin. Ters çevirme / olmayan sperm hücrelerin bozulması için 30 saniye boyunca kuvvetli bir şekilde çalkalanır. Çok hafifçe sallanması vasat bozulmasına neden olur ve topak, takip eden basamakta uygun oluşturmayacaktır. 2 dakika boyunca 11.000 xg'de Spin. Gevşek, "kabarık" pelet yetersiz olması nedeniyle adım 2.7 sallayarak somatik hücre eksik bozulması göstergesidir. Bu durumda, sadece tekrar örnek sallamak, ve sıkı bir pelet oluşana dek respin. Dikkatlice süpernatant süzün. Pelet rahatsız kaçının. Kısaca tekrar dönmeye ve 200 ul pipet kalan süpernatant kaldırmak. Pelet yeniden süspanse kadar 940 ul 0.2x soğuk SSC ve vorteks ekleyin. Bu pelet yeniden suspande edilmesi için çok zor olabilir ve vorteks birkaç tur alabilir. S Bazen kümeleriperma kaçınılmazdır. 120 ul β-merkaptoetanol, 100 ul% 10 SDS, 20 ul 0.5 M EDTA, pH 8, ve 20 ul proteinaz K (60 mg / ml taze olarak hazırlanır) eklenir. İyice karıştırın ve 37 ° C'de dönme gecede sindirmek. Fenol / kloroform ekstraksiyonu ile devam edin. Kauda sperm DNA 3. Fenol / kloroform ekstraksiyonu Not: geç faz spermatidler ve olgun sperm nükleer DNA protamin ile kompleks oluşturur ve daha çok somatik hücre DNA ile karşılaştırıldığında yoğunlaştırılan olduğundan, geleneksel nükleik asit izolasyon yöntemleri mutasyon deney çalışması için yeterli verim ve saflıkta DNA oluşturmaz verimli. Saldırgan bir sindirimden sonra birden fazla fenol-kloroform ekstraksiyonu ve serbest (15 ila yöntemlere göre) sperm DNA saflaştırmak için gereklidir. Aktarım, sperm hücresi, bir 15 ml polipropilen tüpe özet. Kloroform karışımı: fenol 2 ml ilave edilir (1: 1). 22 rpm'de tüp döndürme3 dakika karıştırıldı. 10 dakika boyunca 1600 x g'de santrifüje ve yeni bir 15 ml'lik tüpe bulanık bir arayüz katmanı ile birlikte sulu bir üst tabaka aktarın. Tekrar 3.1.2 ve 3.1.3 3x, fakat sırasıyla 3 dakika, 4 dakika ve 6 dakika için döndürme kez değiştirme adımları tekrarlayın. Final tekrarı üzerine, "bulanık" arayüz katmanının herhangi aktarılmasını önlemek. Izoamil alkol (24: 1) 4. Ekstraksiyon işleminden sonra, 3M NaAc, pH 5.2 1 'e göre sulu bir özütünün ml kloroform ve 2 ml 70 ul ekle. 12 dakika boyunca 22 rpm'de tüp döndürün. 10 dakika boyunca 1600 x g'de santrifüje ve yeni bir 15 ml'lik tüpe sulu bir üst tabaka aktarın. Mutlak etanol, 2 hacim eklenmesi ve hafif hafif sallanarak hafifçe yan tüpün döndürülmesi ile DNA'nın çökeltilmesi. Isı ile sızdırmaz mera pipet ucu üzerine biriktirme ile DNA'nın toplanması. 5 dakika boyunca% 70 etanol ve kuru hava içinde bir pipet ucu ile dönen DNA durulayın. 100 ul Üç – ekstre edildikten sonra, 40 DNA çökeltinin çözünmesis-EDTA tamponu, pH 4 ° C 'de 8 saklayın. DNA lacZ mutasyon çalışması devam etmeden önce iki gün arasında, en az 4 ° C'de çözünmeye bırakılır. Çözünürlük sorunları karşılaşılırsa, DNA, başka bir kullanım öncesi 15 dakika boyunca 65 ° C 'de eritilebilir. Bir 260 ° bir spektrofotometre ile DNA konsantrasyonu belirlemek ve çözünmüş DNA konsantrasyonu, 200-2.000 ng / ml arasında olmasını sağlamak. Seminiferous Pipet gelen germ hücrelerinin 4. İzolasyon ve Sindirim Donmuş ise, buz üzerinde (yaklaşık 1 saat) testis defrost. Transfer buzlu cam plaka testis. Forseps bir çift testis bir ucunu tutun. Testisin diğer ucunda, forseps başka bir çift veya diseksiyon makas (Şekil 5A) kullanarak epitel kapsül bir delik delmek. Delik yoluyla seminifer tübüller sıkın ve epitel kapsül (Şekil 5B) atın. Birdd decapsulated seminifer tübüllerde oda sıcaklığı D-PBS 500 ul. Açılı bir doku silindiri, böylece bir uç 5-10 ° (Şekil 5C) yaklaşık bir açıyla plaka ile temas halinde olan (silikon kauçuk sıkıca serbest dönen bir 5 mm çapında paslanmaz çelik boru, ya da benzer cihazı üzerine yerleştirilir). Herhangi bir basınç uygulamaksızın, nazik bir yassı kadar tübüller üzerinde ileri ve geri hareket silindiri ve D-PBS Serbest bırakılan hücreler (yaklaşık 5-10x) ile bulanık hale gelir. Bir kaç defa daha tübüllerden üzerinde D-PBS başka 500 ul ekleyin ve yavaşça tübüller üzerinde rulo. Aktarılıyor müstakil tübüllerinin miktarını (Şekil 5D) en aza indirirken 1.5 ml mikrofuge'de tüp hücre süspansiyonu aktarın. Tekrarlayın, gerekirse daha hücreleri toplamak için 4,5-4,6 adımları. Herhangi bir kaza toplanan tübülleri tüpün dibine çökme eğilimi için 2 dk – 1 izin verin. Bir fr D-PBS Transferiyerleşmiş tübüller (D-PBS yaklaşık 100 ul) geride bırakarak 1.5 ml tüp ESH. Bu süspansiyonun Küçük bir alikot hücre popülasyonunun kompozisyonunun bir mikroskop (faz-kontrast) altında kontrol edilebilir. 30 saniye boyunca 11.000 xg'de hücreleri aşağı Spin. Dikkatle pelet bozmadan süpernatant süzün. Gerekirse hücre topağı, bu noktada, -80 ° C'de dondurulmuş olabilir. Gerekirse hücreleri çözülme. Liziz tamponu, 5 ml, 15 ml polipropilen tüp ve tekrar süspansiyon hücrelere transfer (10 mM Tris pH 7.6, 10 mM EDTA, 100 mM NaCI, 1 mg / ml proteinaz K,% 1 SDS). Gece boyunca rotasyonu ile kuluçka makinesi içinde 37 ° C'de Digest. Fenol / kloroform ekstraksiyonu ile devam edin. Tübül Seminiferous germ hücrelerinde DNA 5. Fenol / kloroform ile ekstraksiyon NOT: Daha az agresif ekstraksiyon bu hücre tiplerinin henüz n yoluyla ilerleme değil çünkü, seminifer tübüller germ hücre DNA izole etmek için kullanılıruclear yoğuşma. Karışım, kloroform (1: 1) ile gece boyunca seminifer tübül hücre sindirim fenol 5 ml ilave edilir. 20 dakika boyunca 22 rpm'de tüp döndürün. 10 dakika boyunca 1600 x g'de santrifüje ve yeni bir 15 ml'lik tüpe, "bulanık" arabirim katmanı kaçınarak, sulu bir üst tabaka aktarın. 5 ml başına Sulu ekstraktı 5 M NaCI, 100 ul (genellikle 5 mi elde edilir) Izoamilalkol: kloroform 5 ml ekleyin (24: 1). 12 dakika boyunca 22 rpm'de tüp döndürün. 10 dakika boyunca 1600 x g'de santrifüje ve yeni bir 15 ml'lik tüpe sulu bir üst tabaka aktarın. Mutlak etanol, 2 hacim ekleme ve yavaşça döner ve tüpler ters çevrilerek DNA'nın çökeltilmesi. Bir kapalı kapalı mera pipet ucuna biriktirme tarafından DNA toplamak. 5 dakika boyunca% 70 etanol ve kuru hava içinde bir pipet ucu ile dönen DNA durulayın. 40-100 | il Tris-EDTA tamponu, pH 4 ° C 'de 8 Store DNA çözülür. DNA, iki minimum 4 ° C'de çözünmeye bırakılırgün lacZ mutasyon tahlile geçmeden önce (adım 3.9). Çözünürlük sorunları karşılaşılırsa, DNA, başka bir kullanım öncesi 15 dakika boyunca 65 ° C 'de eritilebilir. Bir 260 ° bir spektrofotometre ile DNA konsantrasyonu belirlemek ve konsantrasyon, 200 ve 2000 ng / ml arasında olmasını sağlamak. 6. LacZ mutasyon Deneyi Bakteriyel veya fungal kontaminasyon paketleme verimliliği, hem de plak büyümesi ve puanlama engelleyebilir. Bu ambalaj, reaksiyon, ana kültürü ve büyüme ortamı kirlenmesini önlemek için uygun aseptik önlemler kullanarak, lacZ analizini gerçekleştirmek için kritiktir. Gün Tahlil önce: Alt Agar ve Gecelik Kültür hazırlayın Sekiz plakaları Her bir numune başına gerekmektedir ağar 8 ml altını içeren (4 tabak titreye saymak, 4 tabak mutantlar skor) (yani., 64 ml numune başına). Alt agar her ikisi için de aynıdırmutant ve titre sayısı plakalar. Numune sayısı işlenen için yeterli alt agar hazırlayın. Aseptik olarak 90 mm Petri tabaklarda (tabak başına 8 mi) içine dökün ve Ağarı katılaştırmak için bir olanak sağlar. NOT: Alt agar plakaları önceden 1 hafta kadar hazırlanabilir. 50 ml'lik bir tüp içinde 10 mi LB suyu,% 20 maltoz çözeltisine, 100 ul, 25 ul, ampisilin (20 mg / ml) ve 20 ul, kanamisin (5 mg / ml) ilave edilmektedir. E ile inoküle E. coli (lacZ – / galE -) 25 ve 240 rpm'de çalkalanarak 37 ° C'de gece boyunca büyür. Gün 1: Alt-kültür hücreleri, Taze LB'de, (herhangi bir antibiyotik) 'de bir gece boyunca kültür 100 seyreltme: 1 hazırlanması Alt-kültür hücreleri. Alt-kültür 8 ml bir hacmi örnek başına gereklidir. OD 600 = 1 kadar, yaklaşık 3.5 saat boyunca 240 rpm'de çalkalanarak 37 ° C'de inkübe edilir. OD 600 = 1, 10, 15 ° C'de 1300 x g'de bölme hücre 50 ml tüpler içinde düzgün bir şekilde süspansiyon ve santrifüjmin. Süpernatantı ve (örneğin,., Numune başına 4 mi) LB 10 mM MgSO 4 içeren orijinal hacminin yarısına hücreleri yeniden askıya. [Adımı 6.2.4.3] ihtiyaç kadar bir kenara hücreleri koyun. Gün 1: Lambda faj DNA Parçacıklar Ambalaj 30 ° C su banyosu Isınma. Geniş çaplı bir 10 ul pipet, 1.5 ml'lik bir tüpe transfer 4 ul DNA kullanılarak ölçülür. Not: Bu adım hazırlama süresini azaltmak için önceden bir gün ya da daha fazla gerçekleştirilebilir. Bir faj ambalaj özü kiti ilk tüp (kırmızı) (her 2 numuneler için 1 tüp) ısıtın. Kısaca tüpün dibinde özü toplamak için dönerler. DNA örneği için, birinci boru ikinci ambalaj ekstresi 4.8 ul aktarın ve pipet ucu ile yumuşak bir şekilde karıştırma ile karıştırılır. Kısaca tüplerindeki numuneleri aşağı doğru döndürün. 30 ° C su banyosunda 1.5 saat süreyle inkübe edin. Ikinci (mavi) ambalaj özü tüp (~ 15 örnekler için 1 tüp) ısıtın. Kısaca altındaki özü toplamak için dönmeyetüp. DNA örneği ikinci tüpten ambalaj ekstresi 4.8 ul aktarın ve yumuşak bir şekilde karıştırma ile karıştırılır. Kısaca tüplerindeki numuneleri aşağı doğru döndürün. 30 ° C su banyosu içinde ek bir 1.5 saat boyunca kuluçkalayın. 500 ul SM tamponu içinde faj parçacıkları yeniden askıya ve 20 rpm'de 30 dakika boyunca döndürülerek karıştırılır. Tüplerin dibinde örnekleri toplamak için 30 saniye boyunca 11.000 xg, kısaca vorteks örnekleri ve santrifüj döndürdükten sonra. Faj parçacıkları enfeksiyon [adım 6.2.4] için hazırız. 1. Gün: En Agar hazırlayın Titre plakaları ve bir mutasyon seçimi plakaları ayrı ayrı üst agar hazırlayın. Her numune 4 titre tabak ve 4 mutant plakaları gerektirir. Her bir plaka 8 mi üst ağarı gerektirir. Sadece ağar bir mutasyon seçimi üst seçici maddesine fenil-β-D-galaktopiranosid (P-Gal) ekleyin. Her iki üst Agarların önceden (deney günü) hazırlayın ve her iki üst jelöz için MgSO 4 eklemeden önce 50 ° C 'de muhafaza ve PGark seçimi agar mutantrepresor. 1. Gün: faj ve Kaplama ile bulaşıyor Hücreleri Numune başına iki adet 50 ml tüpler Etiket: numune başına 1 "mutant" tüp ve örnek başına 1 "titre" tüp Numune başına 4 "mutant" levhaları ve numune başına 4 "titre" plakaları: numune başına agarlar Etiket 8 Kısım her bir tüpe [6.2.1.2 ikinci aşama] yeniden süspansiyon haline getirilmiş hücreler 2 mi. Için "Mutan" 50 ml tüp (ihtiva eden hücreler) [6.2.2.8 ikinci aşama] faj partiküllerinin 500 ul ilave edin. , Yavaşça karıştırın ve faj partikülleri, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca hücrelerini enfekte etmek için izin verir. 30 dakika sonra, kısa bir süre için girdap hücreleri enfekte edilmiş ve (hücresi içeren) için uygun olan, 50 ml "titre" tüp üzere enfekte olmuş hücreler 15 ul transfer. Plaka titre örnek, sıcak (50 ° C) "titre" üst agar içeren (NOT P-Gal) için "titre" 50 ml tüp 30 ml ekleyin. Hemen distrib4 "titre" plakalar arasında ute ağar / hücre karışımı (~ plaka başına 8 mi) hazırlandı. Üst agar pipetler serin ve hava kabarcıkları tanıtmak için çalışmaz o kadar hızlı çalışın. Yanındaki "mutant" örnekleri Plate. P-Gal "mutant seçimi" üst agar eklenir emin olun. Sıcak "mutant seçimi" agar içeren (P-Gal) için "mutant" 50 ml tüp 30 ml ekleyin. Hemen (~ plaka başına 8 ml) içinde 4 "Mutan" plakalar arasında, agar / hücre karışımı dağıtın. Plakalar daha sonra (~ 15 dakika) ters kuvvetlendirmek ve gece boyunca 37 ° C'de inkübe izin verin. 2. Gün: Sayma Plaketler Gece boyunca inkübasyondan sonra, mutant ve titre plakaları üzerinde plakların sayısını. Istilanın sayıda için, toplam sayısını tahmin etmek için plakanın sadece bir kısmını sayısı (örneğin,. Genellikle ¼ titre plakasının 100-200 arasında plaklar olacaktır). 100 istilanın az zaman cou plaka başına sayılmalıdırbitiş levhasının bir bölümünü nting. Hücre ul başına plak oluşturucu birim (pfus) sayısını hesaplayın. Bu kaplama hücrelerinin hacminin (15 ul) ile "titre" plakaları üzerinde bakteri sayısını bölünmesi ile yapılır. / Ul "Mutan" plakaları (pfus / ml * üzerine kaplanmıştır enfekte olmuş hücrelerin toplam hacmi pfus sayısını tahmin etmek pfus sayısını kullanarak [2 mi hücreler + 0.5ml faj partikülleri – titre plakaları 15 ul] ). "Titre 'plakaları tespit enfekte olan hücrelerin toplam hacmi pfus tahmini toplam sayısına göre 4" Mutan "plakaları üzerinde sayıldı mutant plakların toplam sayısına bölünmesiyle MF tahmin. Bu MutaMouse germ hücreleri için, OECD kriteri hayvan olmak ekran başına 125,000 ila 300,000 mutant olmayan pfus miktarı minimum olarak kendiliğinden lacZ MF, kontrol grubunda 3 x, 10'dan -5, mertebesinde olduğu zamanGüvenilir bir temel sinyal elde etmek için mutasyon için ed. Diğer transjenik modelleri pfus daha fazla sayıda gerekli olacaktır ki bu durumda daha düşük spontan MF sahip olabilir. Bir istatistiksel güç testi istenen çözünürlüğü elde etmek için gerekli pfus ve hayvanların asgari sayısını belirlemek amacıyla yapılabilir. Birden çok kez tekrarlanmış olan veriler, bu en az bir PFU gereksinimi karşılamak için toplanmış önemli ölçüde farklı mutant frekansları üretmek yok edilebilir. 7. İstatistik Analiz için deneysel birim faredir. Bu testte üretilen veriler genellikle normal dağılım değildir. Bu nedenle, verilerin dağılımı özelliğine göre istatistiksel analizi için bir yöntem seçin. Not: Uygun bir veri dönüştürme Observa aralığı boyunca yanıtın varyans eşitlemek için uygulandığı takdirde standart parametre analizi (örn., ANOVA) kullanılabiliryon. Poisson veya binom regresyon analizleri genellikle daha uygundur. Parametrik olmayan analizi de kullanılabilir. Rutin genel lineer model prosedürü kullanılarak Poisson regresyon modeli kullanır (yani. Proc GENMOD) Lemieux ve arkadaşları tarafından tarif edildiği gibi 26 SAS olarak v.9.2 (SAS Institute, Cary, NC).

Representative Results

Hayvan başına 200.000 plakların ortalama plak sayımı ile, biz genellikle bizim kontrol gruplarında 1,7 x 10 -5 bir standart sapma ile yaklaşık 2,8 x 10 -5 erkek germ hücreleri ortalama arka plan MF gözlemlemek (bağımsız sekiz verilere dayalı deneyler). N = 5 hayvan ile plak sayısı, arka plan düzeyi ve varyans, doz gruplarının her gücü> 0.8 MF 2 kat artış ile tespit etmek için yeterlidir. Sonuçlar, tipik olarak Tablo 2 ve Şekil 6, tek bir 0 akut oral doz, 25, 50 maruz MutaMouse erkeklerin KES sperm (grup başına n = 5) için temsili sonuçlar göstermektedir. Tablo veya grafik biçiminde bildirilmiştir, ve 100 mg / kg'dan 70 gün örnekleme zamanı ile takip ettiği N-etil-N-nitroso (TRK). Bu 70 günlük süre maruz kalma sırasında spermatogoniumların hücreleri, sperm meydana gelen mutasyon olaylar ölçümü (bakınız Şekil 3 izin verir). Mutant ve titre plakaları üzerinde tipik yoğunluklar, plak, Şekil 7 'de gösterilmiştir. Tablo 2 ve Şekil 6'da gösterildiği gibi, akut TRK maruz spermatogoniumların MF bir doza bağlı olarak belirgin bir artış uyarmıştır. Düşük doz 2,6 x 10 -5 bir başlangıç ​​MF kontroller üzerinde önemli bir 2.6 kat artış, uyarılmış. En fazla indüksiyon kontroller üzerinde bir 4.4 kat artış ortaya yüksek dozda meydana geldi. Seminifer tübül germ hücreleri üzerinde yapılan bu tayinin bir örneği, Douglas ve ark. 27 MF / kg TRK 50 mg 5 günlük tekrar intraperitonal enjeksiyonu takiben çeşitli zaman aralıklarında borucuk tohum hücreleri içinde tespit edilmiştir bulunabilir. Bu çalışmada, erkek seminifer, hücrelerde mutant frekansları tedaviden sonra 15 güne kadar artmış ve daha sonra sabit kalmıştır. ExpoEmin rejimi Toplanan doku Toplanan hücre tipi (hedef hücre) Maruz başında hedef hücrenin Aşama Aşama pozlama sırasında geçti Akut + 70 Kauda Olgun sperm Kök hücre Kök hücre 14 + 21 Kauda Olgun sperm Spermatogonia Spermatid 14 +35 Kauda Olgun sperm Kök hücre Spermatosit 28 ± 3 Kauda Olgun sperm Spermatosit Spermatosit Spermatid Olgun sperm Tübüller Kök hücre Kök hücre Kök hücre Spermatogonia Spermatogonia Spermatogonia Spermatosit Spermatosit Spermatid Spermatid 28 ± 49 Kauda Olgun sperm Kök cel Kök hücre Tübüller Kök hücre Spermatogonia Spermatosit Spermatid Kök hücre Kök hücre Çeşitli deneysel tasarımlar ile transgenik kemirgen mutasyon deneyi ile hedeflenen Tablo 1. Hücre tipleri ve spermatogenez aşamaları. Doz grubu Hayvan # Mutant PFU Toplam PFU MF (x10 -5) Ort MF (x 10 -5) Kat değişiklik p-değeri Kontrol 1 5 180.245 2.8 2.6 1.0 – 2 4 137835 2.9 3 11 385.672 2.9 4 2 431.396 0.5 5 6 152413 3.9 25 mg / kg 6 17 162353 10.5 6,9 2.6 0.0002 7 14 150094 9.3 8 4 154401 2.6 9 9 154401 5.8 10 12 196.978 6.1 50 mg / kg 11 17 155727 10.9 9.3 3.6 <0.0001 12 11 135.847 8.1 13 25 193499 12.9 14 12 133859 </ Td> 9.0 15 14 252.807 5.5 100 mg / kg 16 26 170.968 15.2 11.5 4.4 <0.0001 17 28 234.584 11,9 18 10 145.289 6,9 19 35 292.236 12.0 20 22 190848 11.5 Tablo 2. transgenik erkek m kauda sperminin acZ mutant frekansıonlar spermatogonial kök hücreler (= 1 gün uygulama zamanı, örnekleme süresi = 70 gün) iken buz TRK için akut maruz. PFU plak oluşturma birimi, MF = mutant frekansı =. Şekil 1. λgt10 faj yapısının şematik bir temsili. Şekil 2. transgenik kemirgen germ hücre mutasyonu tahlil bir taslak. Şekil 3. fare, spermatogenez ve hücre tipleri ve PHA şematik bir diyagramıÇeşitli deneysel tasarımları ile transgenik kemirgen mutasyon analizi ile hedeflenen ES NOT.:. dereceli beyaz çubuklar seminifer tüp hazırlanan hücre süspansiyonları içinde mevcut hücre tipleri (örneğin, Spermatidler> spermatositler> spermatogonia '> kök hücreler) göreceli oranını temsil eder , lütfen Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız. Fare kauda epididimde 4. Koleksiyonu Şekil. A)) skrotum. B'ye doğru karında bir kesi olun yavaşça testisler ve epididim dışarı çekmek için yağ yastığı çekin) epididim yağ yastığı. C tanımlayın. D) bulun ve kauda epididimiti kesip. <p clakeep-together.within-page = "her zaman">: fo ss = "jove_content" Seminifer tübüller germ hücrelerinin süspansiyon 5. hazırlanması Şekil. A) Bir kesi 5-10 ° açıyla seminifer tübüllerin kapsülün. C) bir doku rulo hafifçe tübüllerden üzerinden geçirilir dışarı sıkılmış seminifer tübüller. B) açığa testis epitel kapsül yapılır . D içinde ihtiva edilen tohum hücrelerine) germ hücre süspansiyonu daha fazla işlenmek üzere toplanır bırakın. MutaMouse sperm, lacZ, mutant frekans Şekil 6 grafiksel gösterimi (n = 5) TRK için kök hücreleri gibi akut maruz bırakılmıştır. AdetÜçgen bir hayvanın MF temsil eder. * p <0.05 Poisson regresyon analizi ile belirlenmiştir. Plaklar ile transgenik bir kemirgen mutasyon çalışması Şekil 7'de Örnek agar plakaları E. bir çim kurdu coli konakçı bakteri. A) "mutant" plakaları bazen bazı levhalar sıfır plaklar. B) "titre" plakalar plakların yüzlerce olabilir olacak özellikle kontrol doz gruplarında oklarla işaretlenmiş çok az plaklar (), sahip olacaktır.

Discussion

Geleneksel yöntemlerle karşılaştırıldığında, TGR germ hücre mutasyonu tahlil vivo germ hücre mutasyonlarının uyarılmış nicel daha hızlı, daha ekonomik ve daha duyarlı bir araç sağlar. Yavrular hayvan sayısı aksine, doğrudan sperm transgen MF değerlendirerek, tek bir zaman ve bileşik germline gen mutasyonu değerlendirmek için gerekli kaynak önemli ölçüde azalır. Duyarlılık açısından, biz doz grubu başına sadece 5 hayvanları kullanılarak 25 mg / kg TRK maruz aşağıdaki spermatogonium kök hücre MF önemli bir 2.6 katlık bir artış tespit başardık. Buna karşılık, belirli odağı tahlil kullanarak bu aynı dozda MF herhangi önemli bir değişiklik> maruz kalan grupta 3.000 fareler ve> 500.000 kontrol fareleri 28 algılayamadı.

Hem mekanik ve düzenleyici araştırmalar için uygun olması ek olarak, bu yöntem, somatik ve germ mutasyonlarına arasındaki karşılaştırmalı çalışmalar için bir fırsat sağlaroranları. Son kanıtlar, somatik mutasyon için gerekli olandan daha bazı maddeler için germ hücre mutasyonlar daha düşük bir konsantrasyonda neden olabileceğini düşündürmektedir. Örneğin, N-hydroxymethylacrylamide uzun süre maruz kalma, gıda kanserojen akrilamidin 12 bir metaboliti, kırmızı kan hücreleri mikronükleus frekansı, somatik hücre sitogenetik hasar 13 geleneksel bir ölçü etkilemeden farelerde baskın öldürücü germ hücre mutasyonların sıklığı artar. Ayrıca, kan mikronukleus frekansı 14 artış yok dozlarda sperm tandem tekrar DNA loci hem ana akış ve yan tütün dumanı nedenleri yüksek mutasyon frekansları farelerin maruz kalma. Bu bulgular somatik genotoksisite testleri her zaman mikrop koruyucu varsayıma meydan ve germ hücre mutasyonu sıklığını ölçmek için daha verimli ve maliyet-etkin yöntemlerle talebi güçlendirmek. Ancak, tercihli germ hücreli mutajen için kanıt hala zayıf, Büyük ölçüde somatik ve germ hücre dokularında mutasyon oranlarını karşılaştırarak için kullanılabilir veri eksikliği. TGR mutasyon deneyi paralel test ve aynı transgenini kullanarak birden dokularda oluşturulan mutasyon oranları karşılaştırılmasına olanak sağlar. Nitekim, karşılaştırmalı mutasyon tercihli germ hücreli etkileri olasılığını çevreleyen veri boşlukları doldurmak yardımcı olacağını TGR testi kullanılarak test.

Düzenleyici test için somatik ve germ hücre mutasyon aynı anda değerlendirmesi aynı zamanda gerekli hayvan sayısını azaltarak verimliliğini artıracaktır. Somatik mutasyon OECD rehber üç gün örnekleme zamanı (+ 3 28) tarafından takip 28 günlük yönetim süresini önerir. Spermatogenez spermatosit ve spermatid fazlarında (Şekil 3) sırasında çoğunlukla maruz kalan hücrelerini hedefleyen beri kauda sperm analizi, bu zaman noktasında duyarlılığı zayıf sunabilir. Bu aşamada hücreler DNA sentezlemek ve giderek DNA onarımı 6 kapasitelerini kaybetmezler </ Sup>. Ayrıca, bu zaman noktasında örnekleme KES sperm spermatogonia ve kök hücreleri meydana gelen mutasyonları tespit etmek için başarısız olur. Böylece, 28 + 3 tasarımı entegrasyon için, OECD rehber seminifer tübüllerde germ hücreleri toplamak önerir. Bu karışık bir popülasyon, DNA sentezi ve kök hücreleri dahil olmak üzere tamir yetkin hücre tipleri, türetilen hücreleri içerir ve spermatojenik fazların çoğunluğu boyunca maruz kalır. Ancak, bu hücrelerin karışık doğası nedeniyle, seminifer tübüller hücre analiz aşaması özel bilgi vermez. Ayrıca, hedef olmayan hücrelerin varlığı görülmektedir MF etkileyebilecekleri endişe vardır dolayı (örneğin, DNA onarımı eksik germ hücrelerinde mutasyona uğramış bir germ hücre sinyalinin mutasyona uğramış somatik hücrelerin kirlenmesi ya da seyreltme için yanlış pozitif tohum hücresi bir mutajen çağrıları) . Şu anda sonuçlandırmak için yeterli veri olup olmadığını 28 + 3 teklif aynı duyarlılık ve özgünlüğü bir de seminifer tübüller hücrelerden sonuçlarsonraki zaman noktalarında s kauda sperm. Laboratuvarımız şu anda bu noktayı ele almak için çeşitli örnekleme zamanları sonra toplanan seminifer tübüller hücreleri ve kauda sperm uyarılan MFS karşılaştırıyor. Biz, OECD kriteri bu da germ hücre analizi için uygun karaciğer gibi yavaş bölünmesi dokular için 28 günlük bir alternatif bir örnekleme süresi göstermektedir unutmayın. Bununla birlikte, mevcut veriler hala yetersiz olduğunu ve somatik hücre ve düzenleyici test için TGR mutasyon deneyi kullanılarak germ hücrelerinin eşzamanlı analizi için tek bir deneysel tasarım tavsiye edemiyoruz.

Unutulmamalıdır Bu deneyde bir özelliği mutasyon olayları, murin olmayan transgenin değerlendirilir olmasıdır. Ancak, transgen endojen genlerin 20 benzer bir şekilde çevresel mutajen yanıt önermek için yeterli kanıt yoktur. İlave olarak, bağımsız bir mutasyon olayları, kesin kaynakların zordurgidermek sonuçlar genel (bir mutasyon sıklığı aksine) bir mutant frekansı olarak rapor edilir. Sonuçlar DNA dizilimi yolu ile (transgen mutantların gözlenen frekansına katkıda bulunduğu tek bir mutasyona uğramış hücrenin, yani. Bölünmesi ve çoğalması) klonal genişleme için düzeltilirse, gerçek Mutasyon frekansı çözülebilir. Bu zaman ve analiz maliyeti anlamlı ölçüde fazlalaştırır rağmen mutant transgenlerin dizilenmesi, lacZ mutasyonları temsil ederler ve klonal genişleme etkinlikleri türetilebilir mutantlann tespit edilmesi için gerçekleştirilebilir. Daha kısa (294 3021 bp'lik bp'lik lacZ v, Şekil 1) ve 29 sırası daha kolay λ CII geni, bir varyantını: lacZ genine ek olarak, theλgt10 transgenik vektör, alternatif bir sıcaklık bağımlı mutasyon raportör genini barındırmaktadır. Dizilenmesine de mutatio ilişkin bilgi temin bağlı mutasyon spektrumunun analiz edilmesini sağlarSöz konusu bileşiğin nal mekanizması. Klonal genişleme uç bir örnek "jackpot" mutasyon oluşumu (yani., Transgen bir dramatik yükseltilmiş MF katkıda bir organın gelişiminin çok erken bir aşamada mutasyonlar, bazen yüzlerce arka plan daha fazla binlerce kat). "Jackpot" mutasyonu ile hayvanlar ya da dokuları analiz çıkarılmalıdır.

Tanımladığımız deney, (20 gözden geçirilmiştir) 'e benzer bir mutasyon raportör vektörü barındıran her biri BigBlue fare ve sıçan ve lacZ plazmid fare gibi diğer tgr modeller için geniş çapta uygulanabilir. Benzer yöntemler kullanmaktadırlar bugüne kadar yapılmış germ hücre çalışmalarında büyük çoğunluğu bu TRK ve (30 gözden) radyasyon gibi neredeyse sadece üzerinde iyi karakterize mutajen odaklanmıştır. Bu tgr deneyi için OECD Test kılavuzun yayınlanması ile birlikte, bu deney olacağı beklenmektedirkimyasal tarama ve düzenleyici değerlendirme için giderek daha popüler. Bir düzenleyici test pilin içine TGR germ hücre mutasyonu tahlil Ortaklığın germ hücreleri 11 mutasyon indüksiyon verimli değerlendirmesini izin vererek, mevcut boşluğu dolduracak. Ayrıca, bu deney, aynı genetik uç noktalarında çevresel faktörler tarafından mutasyon indüklenmesine somatik hücreleri ve tohum hücreleri göreceli hassasiyetleri karşılaştırmak için uygun bir araç temin, hemen hemen herhangi bir dokuda MF ölçmek için kullanılabilir.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This research was funded by the Canadian Regulatory System for Biotechnology (CRSB) and Chemicals Management Plan (CMP) initiatives.

Materials

Name of Reagent/Material Company Catalog Number Comments
MutaMouse Covance –
E.coli (lacZ–/galE–) Covance – See reference 25 in manuscript
Chloroform Caledon 3001-2-40
Dulbecco's phosphate-buffered saline (D-PBS) Gibco 14190-250
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), 0.5M, pH 8 Sigma-Aldrich 03690 FLUKA
Isoamyl alcohol Caledon 2/10/7900
Lennon LB broth base Invitrogen 12780-029
Stainless steel mesh filter Sigma-Aldrich S3770
Transpack packaging extract Agilent Technologies 200220
β-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148
Ethyl alcohol, anhydrous (EtOH) Commercial Alcohols –
Ampicilin Gibco 11593-027 prepare 20 mg/ml in dH2O
Kanamycin Gibco 11815-024 prepare 5 mg/ml in dH2O
Phenol Invitrogen 15509-097 Saturate in 0.1 M Tris-HCl as per manufacturers direction
Phenyl-β-D-galactopyranoside (P-Gal) Sigma-Aldrich P6501 dissolve 3 g per 10 ml of dimethylformamide
Proteinase K Invitrogen 25530-031 prepare 60 mg/ml solution dH2O just before use, 20 µl per sample
Sodium acetate (NaAc) Fisher Scientific BP333-500 prepare 3M solutution, pH 5.2
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma-Aldrich L4390 prepare 10% solution in dH2O
1 M MgSO4 24.6 g MgSO4·7H2O per 100 ml dH2O, autoclave, store at room temperature up to 1 year
20% maltose solution 20.0 g maltose, 24.6 g MgSO4·7H2O, per 100 ml dH2O, filter sterilize, sore at 4ᵒC up to 6 months
Bottom agar Prepare 64 ml per sample (8 pitri plates per sample X  8 ml per plate): 5.0 g LB base, 6.4 g NaCl, 7.5 g agar, per 1L dH2O. Autoclave and cool to 50ᵒC before pouring into Petri plates
LB Broth 5.0 g LB base, 6.4 g NaCl per 1L dH2O. Autoclave and cool
Saline sodium citrate (SSC) 150 mM NaCl, 15 mM trisodium citrate, pH 7.0 
SM Buffer 5.8 g NaCl, 2.0 g MgSO4·7H2O, 50 ml 1 M Tris-HCl (pH 7.5), 5.0 ml of gelatin (2% w/v), per 1L dH2O, autoclave, store at room temperature up to 1 year
TE buffer 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8
Top agar, mutant plates Prepare 32 ml per sample (4 mutant plates per sample X 8 ml per plate): 5.0 g LB base, 6.4 g NaCl, 7.5 g agar, per 1L dH2O. Autoclave and cool to 50ᵒC. Add MgSO4 to 10 mM
Top agar, titre plates Prepare 32 ml per sample (4 mutant plates per sample X 8 ml per plate): 5.0 g LB base, 6.4 g NaCl, 7.5 g agar, per 1L H2O. Autoclave and cool to 50ᵒC. Add MgSO4 to 10 mM and P-Gal to 3 g/L
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ahmadi, A., Ng, S. C. Fertilizing ability of DNA-damaged spermatozoa. J. Exp. Zool. 284 (6), 696-704 (1999).
  2. Crow, J. F. The origins, patterns and implications of human spontaneous mutation. Nat. Rev. Genet. 1 (1), 40-47 (2000).
  3. Nelson, K., Holmes, L. B. Malformations due to presumed spontaneous mutations in newborn infants. N. Engl. J. Med. 320 (1), 19-23 (1989).
  4. Kong, A., et al. Rate of de novo mutations and the importance of father’s age to disease risk. Nature. 488 (7412), 471-475 (2012).
  5. Michaelson, J. J., et al. Whole-genome sequencing in autism identifies hot spots for de novo germline mutation. Cell. 151 (7), 1431-1442 (2012).
  6. Marchetti, F., Wyrobek, A. J. DNA repair decline during mouse spermiogenesis results in the accumulation of heritable DNA damage. DNA Repair (Amst). 7 (4), 572-581 (2008).
  7. Marchetti, F., Wyrobek, A. J. Mechanisms and consequences of paternally-transmitted chromosomal abnormalities. Birth Defects Res. C. Embryo. Today. 75 (2), 112-129 (2005).
  8. Demarini, D. M. Declaring the existence of human germ-cell mutagens. Environ. Mol. Mutagen. 53 (3), 166-172 (2012).
  9. Epstein, S. S. Use of the dominant-lethal test to detect genetic activity of environmental chemicals. Environ. Health. Perspect. 6, 23-26 (1973).
  10. Russell, W. L. X-ray-induced mutations in mice. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 16, 327-336 (1951).
  11. Singer, T. M., Yauk, C. L. Germ cell mutagens: Risk assessment challenges in the 21st century. Environ. Mol. Mutagen. 51 (8-9), 919-928 (2010).
  12. Tareke, E., Rydberg, P., Karlsson, P., Eriksson, S., Tornqvist, M. Acrylamide: A cooking carcinogen. Chem. Res. Toxicol. 13 (6), 517-522 (2000).
  13. Witt, K. L., et al. Mouse bone marrow micronucleus test results do not predict the germ cell mutagenicity of N-hydroxymethylacrylamide in the mouse dominant lethal assay. Environ. Mol. Mutagen. 41 (2), 111-120 (2003).
  14. Marchetti, F., Rowan-Carroll, A., Williams, A., Polyzos, A., Berndt-Weis, M. L., Yauk, C. L. Sidestream tobacco smoke is a male germ cell mutagen. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (31), 12811-12814 (2011).
  15. Yauk, C. L., Dubrova, Y. E., Grant, G. R., Jeffreys, A. J. A novel single molecule analysis of spontaneous and radiation-induced mutation at a mouse tandem repeat locus. Mutat. Res. 500 (1-2), 147-156 (2002).
  16. Niwa, O. Indirect mechanisms of genomic instability and the biological significance of mutations at tandem repeat loci. Mutat. Res. 598 (1-2), 61-72 (2006).
  17. Campbell, C. D., et al. Estimating the human mutation rate using autozygosity in a founder population. Nat. Genet. 44 (11), 1277-1281 (2012).
  18. Beal, M. A., Glenn, T. C., Somers, C. M. Whole genome sequencing for quantifying germline mutation frequency in humans and model species: Cautious optimism. Mutat. Res. 750 (2), 96-106 (2012).
  19. Shwed, P. S., Crosthwait, J., Douglas, G. R., Seligy, V. L. Characterisation of MutaMouse lambdagt10-lacZ transgene: Evidence for in vivo rearrangements. Mutagenesis. 25 (6), 609-616 (2010).
  20. Lambert, I. B., Singer, T. M., Boucher, S. E., Douglas, G. R. Detailed review of transgenic rodent mutation assays. Mutat. Res. 590 (1-3), 1-280 (2005).
  21. OECD. . OECD Guideline for the testing of chemicals: Transgenic rodent somatic and germ cell gene mutation assays. , (2011).
  22. Rodriguez, M., Panda, B. B., Ficsor, G. Testes weight reflect ethylnitrosourea induced histopathology in mice. Toxicol. Lett. 17 (1-2), 77-80 (1983).
  23. Russell, L. B. Effects of male germ-cell stage on the frequency, nature, and spectrum of induced specific-locus mutations in the mouse. Genetica. 122 (1), 25-36 (2004).
  24. Duselis, A. R., Vrana, P. B. Harvesting sperm and artificial insemination of mice. J. Vis. Exp. (3), 184 (2007).
  25. Gossen, J. A., Molijn, A. C., Douglas, G. R., Vijg, J. Application of galactose-sensitive E. coli strains as selective hosts for LacZ- plasmids. Nucleic Acids Res. 20 (12), 3254 (1992).
  26. Lemieux, C. L., et al. Simultaneous measurement of benzo[a]pyrene-induced pig-a and lacZ mutations, micronuclei and DNA adducts in muta mouse. Environ. Mol. Mutagen. 52 (9), 756-765 (2011).
  27. Douglas, G. R., Jiao, J., Gingerich, J. D., Gossen, J. A., Soper, L. M. Temporal and molecular characteristics of mutations induced by ethylnitrosourea in germ cells isolated from seminiferous tubules and in spermatozoa of lacZ transgenic mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92 (16), 7485-7489 (1995).
  28. Russell, W. L., Hunsicker, P. R., Raymer, G. D., Steele, M. H., Stelzner, K. F., Thompson, H. M. Dose–response curve for ethylnitrosourea-induced specific-locus mutations in mouse spermatogonia. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79 (11), 3589-3591 (1982).
  29. Swiger, R. R., Cosentino, L., Shima, N., Bielas, J. H., Cruz-Munoz, W., Heddle, J. A. The cII locus in the MutaMouse system. Environ. Mol. Mutagen. 34 (2-3), 201-207 (1999).
  30. Singer, T. M., Lambert, I. B., Williams, A., Douglas, G. R., Yauk, C. L. Detection of induced male germline mutation: Correlations and comparisons between traditional germline mutation assays, transgenic rodent assays and expanded simple tandem repeat instability assays. Mutat. Res. 598 (1-2), 164-193 (2006).

Tags

Transgenic Rodent AssayMale Germ CellMutant FrequencyDe Novo MutationsGerm Cell MutagenicityIn Vivo AssayOECD Test GuidelineTransgenic VectorReporter GeneSpermatogenic Cell TypesMutagen ExposureCell PopulationSensitivityAnimal Usage

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
O’Brien, J. M., Beal, M. A., Gingerich, J. D., Soper, L., Douglas, G. R., Yauk, C. L., Marchetti, F. Transgenic Rodent Assay for Quantifying Male Germ Cell Mutant Frequency. J. Vis. Exp. (90), e51576, doi:10.3791/51576 (2014).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image