המהונדס מכרסמים Assay עבור תדר Mutant תאי ניבט זכר כימות
Summary
De novo mutations in the male germline may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Here we describe a protocol for the use of a transgenic rodent model for quantifying mutations in male germ cells induced by environmental agents.
Abstract
De novo mutations arise mostly in the male germline and may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Traditional methods for assessing the induction of germ cell mutations require the use of large numbers of animals, making them impractical. As such, germ cell mutagenicity is rarely assessed during chemical testing and risk assessment. Herein, we describe an in vivo male germ cell mutation assay using a transgenic rodent model that is based on a recently approved Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD) test guideline. This method uses an in vitro positive selection assay to measure in vivo mutations induced in a transgenic λgt10 vector bearing a reporter gene directly in the germ cells of exposed males. We further describe how the detection of mutations in the transgene recovered from germ cells can be used to characterize the stage-specific sensitivity of the various spermatogenic cell types to mutagen exposure by controlling three experimental parameters: the duration of exposure (administration time), the time between exposure and sample collection (sampling time), and the cell population collected for analysis. Because a large number of germ cells can be assayed from a single male, this method has superior sensitivity compared with traditional methods, requires fewer animals and therefore much less time and resources.
Introduction
מוטציות בדנ"א סדירות בתאי המין יכולים להוביל להצלחה ברבייה מופחתת, ואם ירשו, עלול לגרום למחלה גנטית או נטייה מוגברת לסרטן אצל צאצאיהם 1-3. ראיות משמעותיות מוכיחות כי חלק גדול ממוטציות דה נובו בירושה מתאי המין מצד אבי 4, וכי מספר המוטציות בצאצאים מתואם חיובי עם גיל אב בעת ההפריה 5. השיעור גבוה יותר של מוטציות זכר הוא האמין להיות תוצאה של ההבדל בגיל בgametogenesis בין המינים, בהגדלת מספר חלוקות תא זרע ראשוניות בהשוואה למספר חלוקות תא oogenic בנקבה בתאי המין 2, וירידה הדרגתית בדנ"א לתקן יעילות עם גיל אצל גברים. כל הגורמים הללו תורמים להסתברות מוגברת של טעויות שכפול בתאי המין הזכריים 6. עם זאת, ההשפעה של חשיפה אבהית לEnviroגורמי nmental בתדירות של מוטציות דה נובו נשאר לא ברורים. עם זאת, מספר גדול של גורמים סביבתיים ידוע כדי לגרום למוטציות תאי נבט במכרסמים 7, ויש ראיות גוברים שחלק מהסוכנים אלה יכול להשפיע גם על תאי המין האנושיים 8. למרות חששות אלה, כימיקלים נבדקים באופן שיגרתי ביכולתם לגרום למוטציות בתאים סומטיים למטרות תקינות והמקובל להניח שבדיקות סומטי יש בם כדי להגן על תאי המין. לכן, כימיקלים רק לעתים רחוקות העריכו ביכולתם לגרום למוטציות תאי נבט.
בדיקות המוטגניות תאי נבט אחת סיבות הושמטו במידה רבה מתהליך קבלת החלטות רגולטוריות הוא חוסר מתודולוגיות מעשיות. שיטות מסורתיות המבוסס על מכרסמים, כגון קטלני 9 וספציפיות לוקוס 10 בדיקות הדומיננטיות, להעריך שיעורי מוטציה תא חיידק על ידי הבקיע פנוטיפים מוטציה בעוברים או צאצאים שלהורים נחשפו. מבחני אלו דורשים שימוש במספר גדול מאוד של בעלי חיים, זמן ומשאבים כדי לרכוש תוצאות משמעותיות מבחינה סטטיסטית.
למרות מספר שיטות המודרניות לכימות מוטציה תא החיידק צמחו לאחרונה, רבים סובלים חסרונות במונחים של פרקטיות שלהם, יעילות, ואת הרלוונטיות ביולוגיות. לדוגמא, לחזור על מוטציות אורך בחוזרים בד בבד פשוט לוקוסים מורחבים (Estr) ניתן לכמת בתאי נבט גבריים תוך שימוש בגישה PCR מולקולה בודדת 15. עם זאת, ביצוע של שיטה זו יכול להיות מאתגר מבחינה טכנית ומייגע, ושלא כמו מוטציות נקודה, המשמעות הביולוגית ובריאותם של שינויים באורך חוזר של לוקוסי Estr מאוד לא יציבים תישאר 16 לא ברורים. טכנולוגיות רצף הגנום כולו מודרניות יכולות לספק שפע של נתונים משמעותיים מבחינה ביולוגית כאשר חלים על הבעיה של מוטציות תורשתיות 4,17, אבל העלות הגבוהה, שיעורי שגיאה גבוהים, האימות הקשורים נדרשותכדי לאשר את המוטציות, ואתגרים ביואינפורמטיקה עדיין להגביל את היישום השגרתי של אפשרות זו ביכולת בדיקת רגולציה 18.
בזאת, אנו מתארים שיטה מעשית לכימות מוטציות הנגרמות באופן ישיר בתאי הנבט של עכברי זכרים מהונדסים. פרוטוקול זה מתואר למודל MutaMouse המהונדס, שבו יש עותקים בשרשור מרובים של וקטור הפאג λgt10 רקומביננטי המכיל גן כתב Escherichia coli lacZ שולב שני העותקים של כרומוזום 3 19 (איור 1).
פרוטוקול זה הוא רלוונטי גם למכרסמים מהונדסים דגמים אחרים (TGR) המבוססים על אותם העקרונות (BigBlue עכבר וחולדה, או עכבר פלסמיד lacZ, וכו '.) או גני כתב מעט שונים (עכבר דלתא GPT ועכברוש, מודלים TGR נסקרו בet למברט אל. 20). שיטה זו מבוססת על assay המוטציה TGR המתואר שבפורסם לאחרונהומתוקן קו מנחה מבחן OECD 21 ואנו לפרט על השיקולים המיוחדים הנדרשים כדי להתאים הערכה של מוטציות בתאי המין הגבריים בגלל המאפיינים הייחודיים של יצירת תאי זרע. בקצרה, assay כרוך בחשיפת עכברים הטרנסגניים זכר לחומר mutagenic, ואחריו זמן דגימה שבו נגעים טרום מוטאציות קבועות למוטציות יציבים. בזמן הדגימה נבחר, עכברים מורדמים ותאי נבט נאספים משתי יותרת האשך cauda או אבוביות זרע. כפי שנראה להלן, השפעות mutagenic בשלבים שונים של יצירת תאי זרע ניתן לקבוע על ידי בחירת הזמן בין החשיפה ואיסוף דגימה. מוסיף מהונדס, הכוללים מספר עותקים של הגנום הפאג λ לכל תא, מבודדים מהדנ"א הגנומי תא חיידק וארוז לתוך capsids הריק λ הפאג יצירת חלקיקי הפאג λ זיהומיות המשמשים לאחר מכן להדביק E. מארח coli. החיידקים הנגועים גדלים על אין תמיכה בבחירהתקשורת מופרזת שיכול להבחין בין תאים המכילים וקטור עם העתק שעבר מוטציה של lacZ מתאי מחסה lacZ wild-type. השפעת mutagenic של חשיפה בתאי המין הזכרי נקבעת על ידי השוואת התדירות של transgenes מוטציה בין שליטה ועכברים שטופלו (איור 2, שנסקר בלמברט et al. 20). מספר גדול של תאי נבט יכול להיות assayed מעכבר אחת, נותן רגישות מעולה assay זה על פני שיטות מסורתיות, תוך צמצום מספר בעלי החיים הדרושים. ובגלל שאין ציוד או הכשרה מיוחד נדרש, assay זה מספק אפשרות מעשית ויעילה לבדיקת המוטציה של תא הנבט ברוב מעבדות ביולוגיה המודרניות טוקסיקולוגיה / מולקולריות.
דרישה הכרחית אחת ליישום האפקטיבי של assay המוטציה של תא הנבט TGR היא הבנה של מחזור הזרע הראשוני (איור 3). הזמן לתאי נבט עכבר כדי להתקדם מstתאים אותם באבוביות הזרע לspermatogonia, spermatocytes, spermatids, ולבסוף להתבגר זרע ביותרת האשך (כלומר. יצירת תאי זרע) היא כ 49 ימים. מוטציה יכולה להתרחש בשלבים שונים של המחזור הזה והוא לעתים קרובות ספציפי מתחם. שתי תכונות עיקריות שהם רלוונטיים במיוחד לmutagenesis בתאי נבט גבריים הן הפסקת סינתזת DNA במהלך מיוזה המוקדמת, והאובדן ההדרגתי של יכולת תיקון DNA 6 בהודעה מיוזה-המאוחרת, שני תהליכים הנדרשים לאינדוקציה והקיבוע של רוב המוטציות.
בגלל המאפיינים הייחודיים אלה של יצירת תאי זרע, יש שלושה משתנים ניסיוניים קריטיים להתנהלות של assay המוטציה של תא הנבט TGR: (1) זמן ממשל מתחם בדיקה; זמן הדגימה (2); ו (3) הבחירה של אוכלוסיית תאי נבט לאסוף לניתוח (איור 3 ולוח 1). זמן מנהל הוא experimeמשתנה פתיחות opening סגירות closures שקובעת כמה תאי יעד ארוכים נחשפים לתרכובות הבדיקה. גם אורכו של זמן הממשל יכול לשמש יעד חשיפות לסוגי תאים ספציפיים או שלבים של יצירת תאי זרע. לדוגמא, ממשל יום אחד יכול לשמש כדי לקבוע את ההשפעות של חשיפה אקוטית לסוג תא מסוים אחד. בדומה לכך, חשיפה יכולה להיות ממוקדת לשלב זרע ראשוני כל, למשל על ידי פגיעת spermatocytes רק חלוקת meiotically, או mitotically חלוקת spermatogonia באמצעות זמן ממשל 2 בשבוע וזמן דגימה מתאים. פעמים כרוניות ותת כרוניות ממשל משמשות כדי להעריך את ההשפעות של חשיפה לטווח ארוכה, על מנת להבטיח הפצה הפרמקוקינטי מספקת של מתחם הבדיקה, או לאפשר להצטברות מספקת של מוטציות מחומרי גורמי מוטציות חלשות (לדוגמא זמן ממשל 28 יום מומלץ במבחן OECD קו מנחה).
זמן דגימה הוא משתנה הקריטי לקביעה שבשלב של יצירת תאי זרע תאי המטרה היו בעת החשיפה. זמן הדגימה מכתיב כמה זמן, ולכן איך התקדם הרבה יותר במחזור הזרע הראשוני, תאים עוברים דרך לאחר החשיפה. לדוגמא, כדי לחקור תופעות בspermatogonia תאי גזע, זמן דגימה> 49 ימים נדרשים אם איסוף זרע הבשיל באופן מלא, או> 42 ימים אם איסוף תאי נבט לא בוגרים מאבוביות הזרע, על מנת להבטיח כי יש לו את כל התאים שנאספו מספיק זמן כדי לפתח מנחשף נובע תאים. חשוב לציין כי זמן דגימה של לפחות 70 ימים יהיה עדיף להפגין השפעת תאי גזע אמיתית כדי לספק מספיק זמן להפצה הפרמקוקינטי של toxicant, לחיסול התאים שנחשפו בשלבים מאוחר יותר של יצירת תאי זרע, ולתת דין וחשבון ל תקופה של עקרות זמניות שעלולים להתרחש ~ 6 שבועות לאחר חשיפה לתרכובות mutagenic מאוד 22. באופן דומה, זמן דגימה של 21 ימים יבטיח כי Colle הזרעcted מיותרת אשך cauda היה רק השלים מיוזה ביום האחרון של חשיפה.
ניתן לאסוף תאי נבט כזרע בוגר מיותרת אשך cauda, או כתערובת של סוגי תאי זרע ראשוניים שונים מאבוביות הזרע. זרע למבוגרים להישאר בcauda ל~ 3 ימים, כך שניתן לקבוע ברמת דיוק יחסי סוג התא או שלב של יצירת תאי זרע שממנו הזרע מקורו לכל עיצוב ניסיוני נתון. לפיכך, ניתוח של היתרי זרע cauda ממוקד חקירות של השפעות מוטציה בשלב מסוים. מצד השני, השעיות תא שנאספו מאבוביות הזרע מכילות תערובת של סוגי תאי נבט שונים בשלבים שונים של פיתוח, ובכך להציע רזולוציה עניות יותר של שלב הזרע הראשוני שבמוטציות מקורו. בנוסף, השעיות תא התאוששו מאבוביות הזרע נוטות להכיל ייצוג יתר של spermatids, ואחריו spermatocytes, וverכמה spermatogonia y ותאי גזע (פרופורציות אלה מיוצגות על ידי פסים לבנים סיימו באיור 3). יתר על כן, השעיות הוכנו מאבוביות הזרע עשויות להכיל גם תאים סומטיים שונים. כך, משום שסוגי תאים רבים כל כך נמצאים, יכולות להיות מושפעות השפעות מוטאציות על ידי מגוון רחב של תאים שאינם יעד. עם זאת, איסוף דגימות מאבוביות זרע מציע אפשרות חסכונית לבו זמנית הקרנת סוגים שונים של תא הנבט, ושילוב קל של ניתוח תא חיידק לפרוטוקול בדיקת OECD הסטנדרטי למוטציה סומטיים.
לחזור ולהדגיש, בהתאם לצרכים של החוקר, זמן ממשל, זמן דגימה ואוכלוסיית תאים שנאספו יכול להיות מותאם לחקור את ההשפעות של חשיפה בסוגי תאים שונים ובשלבים שונים של תהליך יצור תאי זרע. על ידי הבחירה בזהירות משתנה אלה, יכולים להיות מתוכננים ניסויים למחקרים מכניסטית ממוקדים, או לבדיקת רגולציה כללית יותרing מטרות.
כדי להשיג בקיאות בassay, אנו ממליצים על השימוש בנטילה דרך פה חריף של 100 מ"ג / קילוגרם N-אתיל-N-nitrosourea (ENU), ואחריו 70 יום זמן דגימת בקרה חיובית כ. ניתוח של זרע cauda כך מטרות תאי גזע spermatogonial (איור 3), אשר בדרך כלל מציגים עלייה של פי 4-5 בתדירות מוטציה (MF) על הפקדים הבאים מינון mutagenic הזה מאוד של ENU. יש לציין כי מינון זה ידוע לגרום 6 שבועות עקרות לפרסם חשיפה, ובכך זה לא יכול להיות מנת שליטה מתאימה לזמני דגימה קצרים יותר. מינון זה יהיה גם לייצר גידול לזיהוי בMF ברוב הרקמות סומטיות 20. תוצאות הנציג המובאות להלן נוצרו בעקבות משטר חשיפה אקוטי +70 באמצעות שלוש מנות של ENU עד וכולל 100 מ"ג / קילוגרם.
Protocol
Representative Results
Discussion
בהשוואה לשיטות מסורתיות, assay המוטציה של תא הנבט TGR מספק אמצעי מהיר יותר, חסכוני יותר, ורגיש יותר לכימות מושרה במוטציות תאי נבט vivo. על ידי הערכת transgene MF ישירות בזרע, בניגוד לצאצאים, מספר בעלי החיים, זמן ומשאבים הדרושים להערכת המוטגניות בתאי המין של כל תרכובת אחת מצטמצמים באופן משמעותי. במונחים של רגישות, שהיינו מסוגלים לזהות גידול משמעותי 2.6 לקפל בתאי גזע spermatogonia MF בעקבות חשיפה לENU / קילוגרם 25 מ"ג רק באמצעות 5 חיות לכל קבוצת מינון. בניגוד לכך, assay המוקד הספציפי לא היה מסוגל לזהות כל שינוי משמעותי בMF באותו מינון זה באמצעות> 3,000 עכברים בקבוצה החשופה ו> 500,000 עכברי שליטה 28.
בנוסף להתאמתה לשתי חקירות מכניסטית ורגולציה, שיטה זו מספקת הזדמנות למחקרים השוואתיים בין גופני וmutati שורת הנבטעל שיעורים. הראיות אחרונות עולה כי לכמה סוכני מוטציות תאי נבט יכולות להיגרם בריכוז נמוך מהנדרש למוטציה סומטיים. לדוגמא, חשיפה ממושכת לN-hydroxymethylacrylamide, מטבוליט של acrylamide קרצינוגן מזון 12, מגבירה את תדירות מוטציות תאי נבט קטלניות דומיננטיות בעכברים מבלי להשפיע על תדירות הגרעינון בתאי דם אדומים, מידה מסורתית של תא סומטי נזק ציטוגנטית 13. בנוסף, חשיפה של עכברים לשני תדרי המוטציה גורם עשן טבק הזרם המרכזי והעקיף גבוהים בלוקוסי DNA חוזרים טנדם בזרע במינונים שלא להגדיל את תדירות הגרעינון דם 14. ממצאים אלה קוראים תיגר על ההנחה שבדיקות genotoxicity סומטי היא תמיד הגנה של תאי המין, ולחזק את הביקוש לאמצעים יותר יעיל וחסכוניים לכמת תדירות מוטציה של תא נבט. עם זאת, הראיות לגורמי מוטציות תאי נבט מועדפים היא עדיין חלשות, בעיקר בשל המחסור בנתונים זמינים להשוואת שיעורי מוטציה ברקמות תא סומטי וניבטו. Assay המוטציה TGR מאפשר בדיקה והשוואה של שיעורי מוטציה מושרה ברקמות מרובות משתמשים באותו transgene מקבילים. לפיכך, מוטציה השוואתית בדיקה באמצעות assay TGR יעזור למלא פערי נתונים המקיפים את האפשרות של תופעות תא חיידק מועדפים.
הערכה בו זמנית של מוטציה תא סומטי וניבט לבדיקת רגולציה תהיה גם לשפר את היעילות על ידי הקטנת מספר בעלי החיים הדרושים. הקו המנחה OECD למוטציה סומטיים ממליץ זמן ממשל 28 יום, ואחריו זמן של שלושה ימים דגימה (28 + 3). ניתוח של זרע cauda עשוי להציע רגישות עניים בנקודה זו בזמן, שכן הוא מתמקד בתאים שנחשפו בעיקר בשלבי spermatocyte וspermatid יצירת תאי הזרע (איור 3). תאים בשלבים אלה אינם לסנתז DNA ובהדרגה לאבד את היכולת שלהם לתיקון DNA 6 </ Sup>. יתר על כן, זרע cauda הדגימה בנקודה זו בזמן לא יצליח לזהות מוטציות המתרחשות בתאי spermatogonia וגזע. לפיכך, להשתלבות בעיצוב 28 + 3, הקו המנחה OECD ממליץ איסוף תאי נבט מאבוביות הזרע. אוכלוסייה מעורבת זה מכילה תאים שמקורם בסינתזה של DNA וסוגי תאי תיקון מיומן, הכוללים תאי גזע, ונחשפות על פני רוב שלבי זרע ראשוניים. עם זאת, בשל האופי המעורב של תאים אלה, ניתוח תא אבוביות זרע אינו מספק מידע שלב ספציפי. יתר על כן, קיים חשש שנוכחותם של תאים שאינם יעד יכולה להשפיע על MF נצפה (למשל שיחות mutagen תא חיידק חיוביות כוזבות עקב זיהום של תאים סומטיים שעברו מוטציה, או דילול של אות תא חיידק שעבר מוטציה מתאי נבט DNA תיקון לקוי) . כרגע יש מספיק נתונים ללהסיק האם תוצאות מתאי אבוביות זרע ב28 + 3 הצעה אותה רגישות וסגוליותזרע cauda של בנקודות זמן מאוחר יותר. המעבדה שלנו היא משווה כיום MFS המושרה בתאי seminiferous tubules וזרע cauda נאספו לאחר פעמים דגימה שונות כדי לטפל בנקודה זו. נציין כי הקו המנחה OECD מצביע על זמן דגימה חלופי של 28 ימים לרקמות החלוקה לאט כגון הכבד, שעשויה גם להיות מתאים לניתוח תא חיידק. עם זאת, הנתונים זמינים הוא עדיין לא מספיק ואין באפשרותנו כיום להמליץ תכנון ניסוי אחד ואחד לניתוח סימולטני של תאים סומטיים ותאי נבט באמצעות assay המוטציה TGR לבדיקת רגולציה.
אחד מאפיינים של assay זה שיש לציין הוא שאירועי מוטאציות מוערכים על transgene שאינו עכברי. עם זאת, יש עדויות רבות לכך שtransgene מגיב לחומרי גורמי מוטציות סביבתיות באופן דומה לגנים אנדוגני 20. בנוסף, מכיוון שמקורותיה המדויקים של אירועי מוטאציות עצמאיים קשיםלפתור, תוצאות הן בדרך כלל כפי שדווחו בתדירות מוטציה (בניגוד לתדירות מוטציה). תדירות המוטציה בפועל יכולה להיפתר אם תוצאות מתוקנות להרחבה משובט (כלומר. החלוקה והכפלה של תא מוטציה יחיד שיכול לתרום לתדירות הנצפית של מוטציות transgene) על ידי רצפי DNA. רצף של transgenes המוטציה ניתן לבצע כדי לאפיין את מוטציות lacZ, ולזהות מוטציות שעשויות לנבוע מאירועי הרחבה משובטים, למרות שזה מוסיף באופן משמעותי לזמן והעלות של הניתוח. בנוסף לגן lacZ, theλgt10 וקטור מהונדס מטפח גן חלופי טמפרטורה תלויה מוטציה-כתב: גרסה של הגן כת"ש λ, שהוא (294 נ"ב לעומת 3021 נ"ב lacZ, איור 1) קצר יותר וקלים יותר לרצף 29. רצף גם מאפשר הניתוח של ספקטרום המוטציה המושרה, מתן תובנה mutatioמנגנון סופי של המתחם בשאלה. דוגמא קיצונית להרחבה משובט היא ההתרחשות של מוטציה "קופה" (כלומר., מוטציות transgene בשלב מאוד מוקדם של הפיתוח של איבר שתורמות לMF באופן דרמטי גבוה, לעתים מאות עד אלפי פעמים יותר מאשר ברקע). בעלי חיים או רקמות עם מוטציה "קופה" יש להסיר מהניתוח.
Assay שתארנו הוא רחב החלים על מודלים TGR אחרים כגון עכבר BigBlue וחולדה, ועכבר פלסמיד lacZ, אשר כולם נמל וקטורים דומים כתב מוטציה (שנסקרו ב20). רובם המכריע של מחקרי תאי נבט שנערכו עד כה, כי שימוש בשיטות דומות התמקדו גורמי מוטציות מאופיינות כמעט באופן בלעדי על גם כמו ENU וקרינה (שנסקרה ב30). צפוי כי עם שחרורו האחרון של הקו המנחה מבחן OECD לassay TGR, assay זה יהיהפופולרי יותר ויותר להקרנה כימית והערכת רגולציה. התאגדות של assay המוטציה של התא הנבט TGR לסוללת בדיקת רגולציה תהיה למלא את הפער הקיים על ידי התרת הערכה יעילה של אינדוקציה מוטציה בתאי נבט 11. יתר על כן, assay זה יכול לשמש כדי למדוד MF כמעט בכל רקמות, מתן אמצעים מתאימים להשוואת הרגישויות היחסית של תאים סומטיים ותאי נבט לאינדוקציה של מוטציות על ידי סוכנים סביבתיים בנקודתי קצה גנטיות זהות.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was funded by the Canadian Regulatory System for Biotechnology (CRSB) and Chemicals Management Plan (CMP) initiatives.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| MutaMouse | Covance | – | |
| E.coli (lacZ–/galE–) | Covance | – | See reference 25 in manuscript |
| Chloroform | Caledon | 3001-2-40 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (D-PBS) | Gibco | 14190-250 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), 0.5M, pH 8 | Sigma-Aldrich | 03690 FLUKA | |
| Isoamyl alcohol | Caledon | 2/10/7900 | |
| Lennon LB broth base | Invitrogen | 12780-029 | |
| Stainless steel mesh filter | Sigma-Aldrich | S3770 | |
| Transpack packaging extract | Agilent Technologies | 200220 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Ethyl alcohol, anhydrous (EtOH) | Commercial Alcohols | – | |
| Ampicilin | Gibco | 11593-027 | prepare 20 mg/ml in dH2O |
| Kanamycin | Gibco | 11815-024 | prepare 5 mg/ml in dH2O |
| Phenol | Invitrogen | 15509-097 | Saturate in 0.1 M Tris-HCl as per manufacturers direction |
| Phenyl-β-D-galactopyranoside (P-Gal) | Sigma-Aldrich | P6501 | dissolve 3 g per 10 ml of dimethylformamide |
| Proteinase K | Invitrogen | 25530-031 | prepare 60 mg/ml solution dH2O just before use, 20 µl per sample |
| Sodium acetate (NaAc) | Fisher Scientific | BP333-500 | prepare 3M solutution, pH 5.2 |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L4390 | prepare 10% solution in dH2O |
| 1 M MgSO4 | 24.6 g MgSO4·7H2O per 100 ml dH2O, autoclave, store at room temperature up to 1 year | ||
| 20% maltose solution | 20.0 g maltose, 24.6 g MgSO4·7H2O, per 100 ml dH2O, filter sterilize, sore at 4ᵒC up to 6 months | ||
| Bottom agar | Prepare 64 ml per sample (8 pitri plates per sample X 8 ml per plate): 5.0 g LB base, 6.4 g NaCl, 7.5 g agar, per 1L dH2O. Autoclave and cool to 50ᵒC before pouring into Petri plates | ||
| LB Broth | 5.0 g LB base, 6.4 g NaCl per 1L dH2O. Autoclave and cool | ||
| Saline sodium citrate (SSC) | 150 mM NaCl, 15 mM trisodium citrate, pH 7.0 | ||
| SM Buffer | 5.8 g NaCl, 2.0 g MgSO4·7H2O, 50 ml 1 M Tris-HCl (pH 7.5), 5.0 ml of gelatin (2% w/v), per 1L dH2O, autoclave, store at room temperature up to 1 year | ||
| TE buffer | 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8 | ||
| Top agar, mutant plates | Prepare 32 ml per sample (4 mutant plates per sample X 8 ml per plate): 5.0 g LB base, 6.4 g NaCl, 7.5 g agar, per 1L dH2O. Autoclave and cool to 50ᵒC. Add MgSO4 to 10 mM | ||
| Top agar, titre plates | Prepare 32 ml per sample (4 mutant plates per sample X 8 ml per plate): 5.0 g LB base, 6.4 g NaCl, 7.5 g agar, per 1L H2O. Autoclave and cool to 50ᵒC. Add MgSO4 to 10 mM and P-Gal to 3 g/L |
References
- Ahmadi, A., Ng, S. C. Fertilizing ability of DNA-damaged spermatozoa. J. Exp. Zool. 284 (6), 696-704 (1999).
- Crow, J. F. The origins, patterns and implications of human spontaneous mutation. Nat. Rev. Genet. 1 (1), 40-47 (2000).
- Nelson, K., Holmes, L. B. Malformations due to presumed spontaneous mutations in newborn infants. N. Engl. J. Med. 320 (1), 19-23 (1989).
- Kong, A., et al. Rate of de novo mutations and the importance of father’s age to disease risk. Nature. 488 (7412), 471-475 (2012).
- Michaelson, J. J., et al. Whole-genome sequencing in autism identifies hot spots for de novo germline mutation. Cell. 151 (7), 1431-1442 (2012).
- Marchetti, F., Wyrobek, A. J. DNA repair decline during mouse spermiogenesis results in the accumulation of heritable DNA damage. DNA Repair (Amst). 7 (4), 572-581 (2008).
- Marchetti, F., Wyrobek, A. J. Mechanisms and consequences of paternally-transmitted chromosomal abnormalities. Birth Defects Res. C. Embryo. Today. 75 (2), 112-129 (2005).
- Demarini, D. M. Declaring the existence of human germ-cell mutagens. Environ. Mol. Mutagen. 53 (3), 166-172 (2012).
- Epstein, S. S. Use of the dominant-lethal test to detect genetic activity of environmental chemicals. Environ. Health. Perspect. 6, 23-26 (1973).
- Russell, W. L. X-ray-induced mutations in mice. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 16, 327-336 (1951).
- Singer, T. M., Yauk, C. L. Germ cell mutagens: Risk assessment challenges in the 21st century. Environ. Mol. Mutagen. 51 (8-9), 919-928 (2010).
- Tareke, E., Rydberg, P., Karlsson, P., Eriksson, S., Tornqvist, M. Acrylamide: A cooking carcinogen. Chem. Res. Toxicol. 13 (6), 517-522 (2000).
- Witt, K. L., et al. Mouse bone marrow micronucleus test results do not predict the germ cell mutagenicity of N-hydroxymethylacrylamide in the mouse dominant lethal assay. Environ. Mol. Mutagen. 41 (2), 111-120 (2003).
- Marchetti, F., Rowan-Carroll, A., Williams, A., Polyzos, A., Berndt-Weis, M. L., Yauk, C. L. Sidestream tobacco smoke is a male germ cell mutagen. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (31), 12811-12814 (2011).
- Yauk, C. L., Dubrova, Y. E., Grant, G. R., Jeffreys, A. J. A novel single molecule analysis of spontaneous and radiation-induced mutation at a mouse tandem repeat locus. Mutat. Res. 500 (1-2), 147-156 (2002).
- Niwa, O. Indirect mechanisms of genomic instability and the biological significance of mutations at tandem repeat loci. Mutat. Res. 598 (1-2), 61-72 (2006).
- Campbell, C. D., et al. Estimating the human mutation rate using autozygosity in a founder population. Nat. Genet. 44 (11), 1277-1281 (2012).
- Beal, M. A., Glenn, T. C., Somers, C. M. Whole genome sequencing for quantifying germline mutation frequency in humans and model species: Cautious optimism. Mutat. Res. 750 (2), 96-106 (2012).
- Shwed, P. S., Crosthwait, J., Douglas, G. R., Seligy, V. L. Characterisation of MutaMouse lambdagt10-lacZ transgene: Evidence for in vivo rearrangements. Mutagenesis. 25 (6), 609-616 (2010).
- Lambert, I. B., Singer, T. M., Boucher, S. E., Douglas, G. R. Detailed review of transgenic rodent mutation assays. Mutat. Res. 590 (1-3), 1-280 (2005).
- OECD. . OECD Guideline for the testing of chemicals: Transgenic rodent somatic and germ cell gene mutation assays. , (2011).
- Rodriguez, M., Panda, B. B., Ficsor, G. Testes weight reflect ethylnitrosourea induced histopathology in mice. Toxicol. Lett. 17 (1-2), 77-80 (1983).
- Russell, L. B. Effects of male germ-cell stage on the frequency, nature, and spectrum of induced specific-locus mutations in the mouse. Genetica. 122 (1), 25-36 (2004).
- Duselis, A. R., Vrana, P. B. Harvesting sperm and artificial insemination of mice. J. Vis. Exp. (3), 184 (2007).
- Gossen, J. A., Molijn, A. C., Douglas, G. R., Vijg, J. Application of galactose-sensitive E. coli strains as selective hosts for LacZ- plasmids. Nucleic Acids Res. 20 (12), 3254 (1992).
- Lemieux, C. L., et al. Simultaneous measurement of benzo[a]pyrene-induced pig-a and lacZ mutations, micronuclei and DNA adducts in muta mouse. Environ. Mol. Mutagen. 52 (9), 756-765 (2011).
- Douglas, G. R., Jiao, J., Gingerich, J. D., Gossen, J. A., Soper, L. M. Temporal and molecular characteristics of mutations induced by ethylnitrosourea in germ cells isolated from seminiferous tubules and in spermatozoa of lacZ transgenic mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92 (16), 7485-7489 (1995).
- Russell, W. L., Hunsicker, P. R., Raymer, G. D., Steele, M. H., Stelzner, K. F., Thompson, H. M. Dose–response curve for ethylnitrosourea-induced specific-locus mutations in mouse spermatogonia. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79 (11), 3589-3591 (1982).
- Swiger, R. R., Cosentino, L., Shima, N., Bielas, J. H., Cruz-Munoz, W., Heddle, J. A. The cII locus in the MutaMouse system. Environ. Mol. Mutagen. 34 (2-3), 201-207 (1999).
- Singer, T. M., Lambert, I. B., Williams, A., Douglas, G. R., Yauk, C. L. Detection of induced male germline mutation: Correlations and comparisons between traditional germline mutation assays, transgenic rodent assays and expanded simple tandem repeat instability assays. Mutat. Res. 598 (1-2), 164-193 (2006).
