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Biology

Transgênicos Rodent Ensaio para Quantificação celular germinativas masculinas Mutant Frequency

Published: August 06, 2014
doi:
10.3791/51576
, , , , , ,
1Environmental Health Science and Research Bureau, Health Canada,Environmental Health Centre

Summary

De novo mutations in the male germline may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Here we describe a protocol for the use of a transgenic rodent model for quantifying mutations in male germ cells induced by environmental agents.

Abstract

De novo mutations arise mostly in the male germline and may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Traditional methods for assessing the induction of germ cell mutations require the use of large numbers of animals, making them impractical. As such, germ cell mutagenicity is rarely assessed during chemical testing and risk assessment. Herein, we describe an in vivo male germ cell mutation assay using a transgenic rodent model that is based on a recently approved Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD) test guideline. This method uses an in vitro positive selection assay to measure in vivo mutations induced in a transgenic λgt10 vector bearing a reporter gene directly in the germ cells of exposed males. We further describe how the detection of mutations in the transgene recovered from germ cells can be used to characterize the stage-specific sensitivity of the various spermatogenic cell types to mutagen exposure by controlling three experimental parameters: the duration of exposure (administration time), the time between exposure and sample collection (sampling time), and the cell population collected for analysis. Because a large number of germ cells can be assayed from a single male, this method has superior sensitivity compared with traditional methods, requires fewer animals and therefore much less time and resources.

Introduction

Mutações no DNA esporádicos na linhagem germinativa pode levar ao sucesso reprodutivo reduzido e, se herdada, pode causar doença genética ou predisposição aumentada ao câncer na prole 1-3. A evidência substancial demonstra que uma grande proporção de mutações de novo são herdados da linhagem germinativa paternal 4, e que o número de mutações na prole é positivamente correlacionada com a idade paterna no momento da concepção 5. A maior taxa de mutações do sexo masculino acredita-se ser um resultado da diferença de idade, durante a gametogénese entre os sexos, a maior número de divisões celulares de espermatogénese em comparação com o número de divisões celulares oogenic na linha germinativa fêmea 2, e um declínio progressivo em ADN reparar a eficiência com a idade nos homens. Todos estes factores contribuem para um aumento da probabilidade de erros de replicação na linha germinativa masculina 6. No entanto, o impacto da exposição paternal para Envirofatores nmental sobre a freqüência de mutações de novo permanece incerto. No entanto, um grande número de agentes ambientais são conhecidos por induzir mutações em células germinativas em roedores 7, e não há evidências de que alguns destes agentes podem também afectar a 8 de linha germinal humana. Apesar destes problemas, os produtos químicos são rotineiramente testados na sua capacidade para induzir mutações em células somáticas para fins regulatórios e é geralmente aceite que os testes somáticas são suficientes para proteger a linha germinal. Portanto, os produtos químicos são raramente avaliadas pela sua capacidade de induzir mutações em células germinativas.

Um dos motivos de testes de mutagenicidade em células germinativas tem sido largamente omitido da regulamentação processo de tomada de decisão é a falta de metodologias práticas. Métodos baseados em roedores tradicionais, como os dominantes letais 9 e específicos lócus 10 testes, estimar as taxas de mutação de células germinativas, marcando fenótipos mutantes em embriões ou descendentes depais expostas. Estes ensaios requerem a utilização de um grande número de animais, o tempo e recursos para obter resultados estatisticamente significativos.

Embora vários métodos modernos para quantificar mutação de células germinativas surgiram recentemente, muitos sofrem deficiências em termos de praticidade, eficiência e relevância biológica. Por exemplo, repita mutações comprimento aos simples tandem repeat (ESTR) loci expandida podem ser quantificados em células germinativas masculinas usando uma única molécula abordagem PCR 15. No entanto, a execução deste método pode ser tecnicamente difícil e trabalhoso, e ao contrário de mutações pontuais, a importância biológica e da saúde das mudanças no comprimento de repetição do loci ESTR altamente instável permanecem obscuros 16. Modernas tecnologias de sequenciamento do genoma inteiro pode fornecer uma riqueza de dados biologicamente significativo quando aplicado ao problema de mutações hereditárias 4,17, mas o custo elevado, altas taxas de erro, validação relacionadas exigidaspara confirmar mutações e desafios da bioinformática ainda limitar a aplicação rotineira de esta opção em uma capacidade de ensaios regulamentares 18.

Aqui, nós descrevemos um método prático para quantificar mutações induzidas diretamente nas células germinativas de ratos machos transgênicos. Este protocolo é descrito para o modelo MutaMouse transgénico, que tem múltiplas cópias de um vector concatenadas λgt10 fago recombinante contendo um gene repórter lacZ de Escherichia coli integrado em ambas as cópias do cromossoma 3 19 (Figura 1).

Este protocolo também é relevante para outros modelos de roedores transgênicos (TGR), com base nos mesmos princípios (BigBlue rato e do rato, ou lacZ plasmídeo de mouse, etc.) Ou genes repórter ligeiramente diferentes (rato delta gpt e rato, modelos TGR revisto em Lambert et ai. 20). Este método baseia-se no ensaio de mutação TGR descrito num modelo recentementee revisto directriz de ensaio da OCDE 21 e elaboramos sobre as considerações especiais necessários para acomodar a avaliação de mutações na linha germinativa masculina por causa das características únicas da espermatogênese. Resumidamente, o ensaio envolve a exposição de ratos machos transgénicos para uma substância mutagénica, seguido por um tempo de amostragem em que as lesões pré-mutacionais são fixados em mutações estáveis. Na época de amostragem escolhido, os ratos são sacrificados e as células germinativas são coletados a partir de qualquer cauda do epidídimo ou dos túbulos seminíferos. Como discutido abaixo, os efeitos mutagénicos, em diferentes fases da espermatogénese pode ser determinado pela selecção do tempo entre a exposição e de recolha de amostras. Inserções transgénicos, compreendendo múltiplas cópias do genoma de fagos por célula λ, são isolados a partir de DNA genómico de células germinativas e empacotadas em cápsides vazias de fago λ criando partículas de fago λ infecciosas que são então utilizados para infectar um E. coli hospedeira. As bactérias infectadas foram crescidas em selecmídia tivas que podem distinguir células contendo um vetor com uma cópia mutante do lacZ a partir de células que abrigam o tipo selvagem lacZ. O efeito mutagénico de exposição na linha germinativa macho é determinado por comparação da frequência de transgenes mutantes entre o controlo e os ratos tratados (Figura 2, na avaliação Lambert et al. 20). Um grande número de células germinais, pode ser ensaiada a partir de um único ratinho, dando a esta sensibilidade superior de ensaio através de métodos tradicionais, enquanto reduz o número de animais necessários. E porque não é necessário nenhum equipamento ou treinamento especializado, este ensaio oferece uma opção prática e eficiente para o teste de mutação de células germinativas na maioria dos modernos laboratórios de biologia molecular de toxicologia /.

Um requisito essencial para a aplicação eficaz do ensaio de mutação de células germinativas TGR é uma compreensão do ciclo espermatogênico (Figura 3). O tempo para as células germinativas do mouse para o progresso de Stcélulas em na túbulos para espermatogônias, espermatócitos, espermátides e, finalmente, para amadurecer espermatozóides no epidídimo (ie. espermatogênese) é de aproximadamente 49 dias. A mutação pode ocorrer em várias fases deste ciclo e muitas vezes é específico composto. Duas características principais que são de particular relevância para a mutação nas células germinativas masculinas são a cessação da síntese de DNA durante a meiose cedo, ea perda progressiva da capacidade de reparo do DNA 6 durante o final de pós-meiose, dois processos que são necessários para a indução e fixação de a maioria das mutações.

Devido a essas características únicas da espermatogênese, existem três variáveis ​​experimentais críticos para a realização do ensaio de mutação de células germinativas TGR: (1) o tempo de administração composto de teste; (2) o tempo de amostragem; e (3) a selecção da população de células germinativas para recolher para análise (Figura 3 e Tabela 1). O tempo de administração é a experimental variável que determina como células alvo longos são expostas aos compostos de teste. A duração do período de administração podem também ser utilizados para direccionar para tipos de exposições ou fases de espermatogénese celulares específicos. Por exemplo, uma administração única dia pode ser usado para determinar os efeitos de uma exposição aguda a um tipo particular de células. Do mesmo modo, a exposição pode ser focado para a totalidade de uma fase espermatogénica, por exemplo, por direccionamento de espermatócitos apenas meioticamente divisórias, ou mitose dividindo Espermatogônias usando um tempo de administração de duas semanas e um tempo de amostragem apropriado. Vezes a administração crônica e sub-crônicos são utilizados para avaliar os efeitos da exposição a longo prazo, para garantir a distribuição farmacocinética suficiente do composto de ensaio, ou permitir o acúmulo suficiente de mutações de agentes mutagénicos fracos (por exemplo, o tempo de administração 28 dias recomendado no teste OECD orientação).

Tempo de amostragem é a variável crítica para determinar em quefase de espermatogénese as células alvo estavam na altura da exposição. O tempo de amostragem determina quanto tempo, e, portanto, quanto mais ao longo do ciclo de espermatogênese, as células passam por após a exposição. Por exemplo, para investigar os efeitos em células-tronco espermatogônias, um tempo de amostragem> 49 dias é necessário se coletar esperma totalmente amadurecido, ou> 42 dias, se a coleta células germinativas imaturas dos túbulos seminíferos, para garantir que todas as células coletadas tiveram tempo suficiente para desenvolver a partir de células-tronco exposta. É importante notar que o tempo de amostragem de, pelo menos, 70 dias seria preferível para demonstrar um efeito em células estaminais verdadeiro para dar tempo suficiente para a distribuição da farmacocinética do agente tóxico, para a eliminação de células expostas em fases posteriores da espermatogénese, e para ter em conta um período de esterilidade temporária que pode ocorrer ~ 6 semanas após a exposição a compostos altamente mutagénicos 22. Do mesmo modo, um tempo de amostragem de 21 dias iria garantir que Colle espermacted da cauda do epidídimo teria acabado de completar a meiose, no último dia da exposição.

Células germinativas podem ser coletados como espermatozóides maduros da cauda do epidídimo, ou como uma mistura de vários tipos de células da espermatogênese dos túbulos seminíferos. Espermatozóides maduros permanecem na cauda para ~ 3 dias, tornando-se possível determinar com exactidão em relação ao tipo de célula ou a fase da espermatogénese do que o esperma originado por qualquer dado desenho experimental. Assim, a análise de síndrome da cauda do esperma permite investigação de efeitos específicos de mutação em estágio altamente segmentada. Por outro lado, as suspensões de células colhidas a partir dos túbulos seminíferos contêm uma mistura de vários tipos de células germinativas em diferentes fases de desenvolvimento, e, assim, oferecer mais pobre resolução da fase em que as mutações espermatogénica originado. Além disso, as suspensões de células recuperadas a partir dos túbulos seminíferos tendem a conter uma representação excessiva de espermatídeos, seguido de espermatócitos, e verpoucos Espermatogônias y e as células-tronco (estas proporções são representados por barras brancas formados na Figura 3). Por outro lado, as suspensões preparadas a partir dos túbulos podem também conter várias células somáticas. Assim, porque muitos tipos de células estão presentes, os efeitos de mutações pode ser influenciada por uma variedade de células não-alvo. No entanto, a coleta de amostras de túbulos seminíferos oferece uma opção econômica para a triagem simultaneamente vários tipos de células germinativas e fácil integração da análise de células germinativas no protocolo padrão de ensaio da OCDE para a mutação somática.

Para reiterar, dependendo das necessidades do investigador, o tempo de administração, o tempo de amostragem e a população de células recolhida pode ser ajustado para interrogar os efeitos da exposição a vários tipos de células e em diferentes fases da espermatogénese. Ao selecionar cuidadosamente estas variáveis, os experimentos podem ser projetados para estudos sobre os mecanismos direcionados, ou para teste regulamentar mais generalizadafins ing.

Para obter proficiência no ensaio, recomenda-se a utilização de uma administração oral aguda de 100 mg / kg de N-etil-N-nitrosoureia (ENU), seguido por um tempo de amostragem de 70 dias como controlo positivo. Análise de cauda de esperma alvo assim as células estaminais espermatogoniais (Figura 3), que, tipicamente, exibem um aumento de 4-5 vezes na frequência de mutante (MF) em relação aos controlos seguinte esta dose altamente mutagénico de ENU. Deve notar-se que esta dose é conhecido por induzir a esterilidade 6 semanas após a exposição, pelo que não pode ser uma dose de controlo adequados para os tempos de amostragem mais curtos. Esta dose também vai produzir um aumento detectável na MF na maioria dos tecidos somáticos 20. Os resultados representativos apresentados a seguir foram gerados na sequência de um regime de exposição aguda +70 usando três doses da ENU até e incluindo 100 mg / kg.

Protocol

Todos os protocolos que envolvem criação de animais, manutenção e manuseio foram aprovados pelo comitê de cuidados com os animais da Saúde do Canadá. 1. Exposições de Animais Aleatoriamente distribuir camundongos machos transgênicos (8-12 semanas de idade) para controlar os grupos e os grupos de tratamento (min = 5 por grupo) camundongos .Treat com composto de ensaio e de controlo relevante através de uma via de exposição adequado ao tempo de administração selecionado. Escolha o tempo de amostragem adequada de acordo com o tipo de célula da espermatogênese de interesse (Figura 3). Após o tempo de amostragem, a eutanásia ratos por deslocamento cervical, sob anestesia de isofluorano (ou outro método apropriado). Passe cuidadosamente os testículos de uma incisão no abdômen ou escroto e extirpar os epidídimos Cauda. (Figura 4, para ver um vídeo detalhado da coleção epidídimo ver Duselis et al. 24). Alternativamente, recolher os testículos se analisar túbulo seminíferos células. Congelar em nitrogênio líquido e armazenar a -80 ° C para uso posterior. 2 O isolamento e digestão de Cauda de esperma Descongele Cauda epidídimo no gelo. Transferir cauda descongelado para uma placa de Petri e pique bem com uma lâmina de bisturi ou navalha. Adicionar 700 ul de temperatura ambiente D-PBS para a placa de Petri. Usando um wide-bore 1.000 l ponteira, esperma liberação da cauda desenhando e liberando a suspensão até o D-PBS torna-se muito nublado com esperma (cerca de 10 vezes). NOTA: Para preparar todo o furo ponteira corte de 2-3 mm a partir da extremidade de uma ponta de pipeta de plástico. Suspensão Filtrar através de um filtro de malha de aço inoxidável para um novo tubo de 1,5 ml. Lava-se a placa de Petri com um adicional de 700 ul de D-PBS e transferir a mesma tubo de 1,5 ml através do filtro de rede. Remover malha, coloque o tubo em gelo. Repita os passos de 2,1-2,3 para as amostras restantes. Gire samplesat 11.000 xg por 3 min. Sobrenadante cuidadosamente decantar. Evite perturbar o sedimento. Adicionar 1,0 ml de citrato de sódio fria salina 1x (SSC). Vortex até pelete é completamente re-suspensa. Isso às vezes vai demorar várias rodadas de vórtex. Adicionam-se 15 ul de SDS a 10%. Inverter / agitar vigorosamente por 30 segundos para interromper células não espermáticas. Agitando muito suavemente irá resultar em interrupção inadequada e o sedimento não formará correctamente no passo seguinte. Giram a 11.000 xg por 2 min. Uma peça solta, pellet "fofo" é indicativo de ruptura incompleta de células somáticas devido à insuficiente balançando no passo 2.7. Se isso ocorrer, simplesmente agitar a amostra mais uma vez, e até um respin pelete é formado apertado. Decantar cuidadosamente o sobrenadante. Evite perturbar o sedimento. Resumidamente girar novamente e remover o sobrenadante remanescente com 200 mL de pipeta. Adicionar 940 mL 0.2x SSC frio e vortex até pellet é ressuspenso. Este pellet pode ser muito difícil voltar a suspender e pode levar várias rodadas de vórtex. Às vezes, aglomerados de sperm são inevitáveis. Adicionar 120 ul β-mercaptoetanol, 100 ul de SDS 10%, 20 ul de EDTA 0,5 M, pH 8, e 20 ul de proteinase K (60 mg / ml, preparado fresco). Misturar bem e digest durante a noite com rotação a 37 ° C. Vá para a extração de fenol / clorofórmio. 3. extracção com fenol / clorofórmio, o ADN a partir da cauda do esperma Observação: Uma vez que o ADN nuclear no espermatídeos fase final e espermatozóides maduros é complexado com protaminas, e é altamente condensados ​​em comparação com o ADN de células somáticas, métodos convencionais de isolamento de ácido nucleico não irá gerar ADN de rendimento e pureza suficiente para o ensaio de mutação para trabalhar eficientemente. Extrações múltiplas fenol-clorofórmio, após uma digestão agressiva são obrigados a liberar e purificar DNA do esperma (com base em métodos de 15). Espermatozóide Transferência digerir para um tubo de polipropileno de 15 ml. Adicionar 2 ml de fenol: mistura de clorofórmio (1: 1). Rode o tubo a 22 rpmdurante 3 min. Centrifugar a 1.600 xg durante 10 minutos e transferir camada aquosa superior, juntamente com a camada de interface difusa para um novo tubo de 15 ml. Repita os passos 3.1.2 e 3.1.3 3x, mas mudando os tempos de rotação de 3 min, 4 min e 6 min, respectivamente. Na repetição final, evitar a transferência de qualquer camada de interface "difusa". Após a 4 º extracção, adicionar 70 mL de NaAc 3M, pH 5,2 por 1 ml de extracto aquoso e 2 ml de clorofórmio: álcool isoamílico (24: 1). Rode o tubo a 22 rpm por 12 min. Centrifugar a 1.600 xg durante 10 minutos e transferir camada superior aquosa para um novo tubo de 15 ml. Precipitar o DNA por adição de 2 volumes de etanol absoluto e rotação suave do tubo de lado, com agitação suave. Recolha de ADN por bobinagem na ponta de uma pipeta de pastagem vedada pelo calor. Lavar ADN agitando a ponta da pipeta em 70% de etanol e secar ao ar durante 5 min. Após a extracção, dissolver precipitado de ADN em 40-100 ul Tris-tampão de EDTA, pH 8 Armazenar a 4 ° C. Permitir que o ADN para dissolver a 4 ° C durante um mínimo de dois dias antes de se proceder ao ensaio de mutação lacZ. Se os problemas de solubilidade são encontrados, o DNA pode ser ainda dissolvida a 65 ° C durante 15 min antes da utilização. Determinar a concentração do ADN com uma spectrophotometre em A 260 e garantir que a concentração de DNA é dissolvido entre 200-2.000 ng / ul. 4 Isolamento e digestão das células germinativas dos túbulos seminíferos de Se congelado, descongelar testículo no gelo (cerca de 1 hora). Transferência de testículos de uma placa de vidro chão. Segurar uma extremidade do testículo com um par de pinças. Na outra extremidade do testículo, perfurar um buraco na cápsula epitelial usando outro par de fórceps ou de um par de tesouras de dissecação (Figura 5A). Aperte os túbulos seminíferos através da punção e descarte a cápsula epitelial (Figura 5B). Add 500 uL de temperatura ambiente D-PBS para os túbulos seminíferos descapsulados. Ângulo de um rolo de tecido (borracha de silicone encontra firmemente ajustado ao longo de um tubo rotativo livremente 5 mm de diâmetro em aço inox, ou aparelho semelhante), de modo que uma das extremidades está em contacto com a placa a um ângulo de aproximadamente 5-10 ° (figura 5C). Sem fazer pressão, mova suavemente o rolo para trás e para frente através dos túbulos até que eles são achatados ea D-PBS torna-se muito nublado com células liberadas (aproximadamente 5-10X). Adicionar mais 500 ul de D-PBS ao longo dos túbulos e rola suavemente sobre os túbulos algumas vezes adicionais. Transferência da suspensão de células para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, minimizando a quantidade de túbulos destacadas sendo transferido (Figura 5D). Repita os passos de 4,5-4,6 para coletar mais células, se necessário. Permitir 1-2 min para qualquer túbulos recolhidos acidentalmente para assentar no fundo do tubo. Transferir o D-PBS a uma fresh tubo de 1,5 ml, deixando para trás os túbulos liquidados (aproximadamente 100 ul de D-PBS). Uma pequena alíquota desta suspensão pode ser verificado com um microscópio (contraste de fase) para avaliar a composição da população de células. Girar as células a 11.000 xg por 30 seg. Decantar cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o sedimento. O sedimento de células podem ser congeladas a -80 ° C nesta altura, se necessário. Descongelar as células, se necessário. Transferir para um tubo de 15 ml de células de polipropileno e ressuspender em 5 ml de tampão de lise (10 mM Tris pH 7,6, 10 mM de EDTA, 100 mM de NaCl, 1 mg / ml de proteinase K, SDS a 1%). Digest dia para o outro em incubadora com rotação a 37 ° C. Vá para a extração de fenol / clorofórmio. 5. fenol / clorofórmio Extração de DNA de células germinativas Seminífero Tubule NOTA: A menos agressiva de extracção é utilizada para isolar o DNA de células túbulos seminíferos germe, uma vez que estes tipos de células mas não progrediram até ncondensação uclear. Adicionam-se 5 ml de fenol: mistura de clorofórmio (1: 1) a digestão durante a noite de células túbulos seminíferos. Rode o tubo a 22 rpm por 20 min. Centrifugar a 1.600 xg durante 10 minutos e transferir camada aquosa superior, evitando ao mesmo tempo a camada de interface "fuzzy", para um novo tubo de 15 ml. Adicionar 100 ul de NaCl 5 M por 5 ml de extracto aquoso (geralmente 5 ml é recuperado) Adicionar 5 ml de clorofórmio: álcool isoamílico (24: 1). Rode o tubo a 22 rpm por 12 min. Centrifugar a 1.600 xg durante 10 minutos e transferir camada superior aquosa para um novo tubo de 15 ml. Precipitar o DNA por adição de 2 volumes de etanol absoluto e suavemente rotativa e invertendo os tubos. Recolha de ADN por bobinagem na ponta de uma pipeta de pasto selada. Lavar ADN agitando a ponta da pipeta em 70% de etanol e secar ao ar durante 5 min. Dissolve-se o ADN em 40-100 ul de tampão de Tris-EDTA, pH 8 Armazenar a 4 ° C. Permitir ADN para dissolver a 4 ° C durante um mínimo de doisdias antes de proceder ao teste de mutação lacZ (veja o passo 3.9). Se os problemas de solubilidade são encontrados, o DNA pode ser ainda dissolvida a 65 ° C durante 15 min antes da utilização. Determinar a concentração do ADN com uma spectrophotometre em A 260 e garantir que a concentração é de entre 200 e 2.000 ng / mL. 6. LacZ mutação Assay A contaminação bacteriana ou fúngica pode interferir com a eficiência de empacotamento, assim como o crescimento de placas e de pontuação. É, portanto, essencial para realizar o ensaio de lacZ utilizando as medidas assépticas apropriadas para evitar a contaminação do meio de reacção de embalagem, cultura hospedeira e crescimento. Dia antes do ensaio: Prepare inferior Agar e cultura durante a noite Oito placas (4 placas para marcar mutantes, 4 placas de contar título) contendo 8 ml de fundo agar cada são necessários por amostra (ie., 64 ml por amostra). O ágar de fundo é idêntico para os doisas placas de contagem mutantes e titulação. Prepare de fundo de agar suficiente para o número de amostras a ser processado. Assepticamente despeje em 90 milímetros placas de Petri (8 ml por prato) e deixe ágar solidificar. NOTA: as placas de fundo de agar podem ser preparadas até 1 semana antes. Num tubo de 50 ml, adicionar 10 ml de caldo LB, 100 ul de solução de maltose a 20%, 25 mL de ampicilina (20 mg / mL) e 20 mL de canamicina (5 mg / ml). Inocular com E. coli (lacZ – / galE -) 25 e crescer durante a noite a 37 ° C com agitação a 240 rpm. Dia 1: Células Sub-cultura Células de sub-cultura, preparando uma diluição a 1: 100 de cultura durante a noite em LB fresco (sem antibióticos). É necessário um volume de 8 ml de subcultura por amostra. Incubar a 37 ° C com agitação a 240 rpm durante cerca de 3,5 horas até DO600 = 1. Quando OD 600 = 1, a suspensão de divisão celular de forma uniforme em tubos de 50 ml e centrifugar a 1300 x g a 15 ° C durante 10min. Remover o sobrenadante e re-suspender as células em metade do volume original (isto é., 4 ml por amostra) de LB contendo 10 mM de MgSO4. Coloque células de lado até ser necessário [passo 6.2.4.3]. Dia 1: Embalagem DNA no fago lambda Partículas Aquecer num banho de água a 30 ° C. Utilizando uma grande calibre 10 ul ponta de pipeta, transferir 4 ul de DNA para um tubo de 1,5 ml. NOTA: Este passo pode ser realizada um ou mais dias antes de reduzir o tempo de preparação. Aquecer o primeiro tubo (vermelho) a partir de um kit de extracto de empacotamento de fago (1 tubo para cada duas amostras). Mexer um pouco para coletar o extrato do fundo do tubo. Transferir 4,8 mL de extracto de embalagem a partir do primeiro tubo para a amostra de ADN e misturar por agitação suave com a ponta da pipeta. Resumidamente girar amostras em tubos. Incubar por 1,5 horas em 30 ° C num banho de água. Aqueça o tubo segundo (azul) de extrato de embalagem (1 tubo para ~ 15 amostras). Mexer um pouco para coletar extrato, no fundo,de tubo. Transferir 4,8 mL de extracto de embalagem a partir do segundo tubo de amostra de ADN e mistura por meio de agitação suave. Resumidamente girar amostras em tubos. Incuba-se durante mais 1,5 h em 30 ° C num banho de água. Re-suspender as partículas de fagos empacotados em 500 ul de tampão SM e misturar por rotação durante 30 minutos a 20 rpm. Depois de rodar, as amostras brevemente vortex e centrifugar a 11.000 xg por 30 segundos para coletar amostras no fundo de tubos. Partículas de fagos estão prontos para a infecção [passo 6.2.4]. Dia 1: Prepare Top Agar Prepare ágar de topo separada para as placas de titulação e placas de selecção de mutantes. Cada amostra requer 4 placas de título, e 4 placas mutantes. Cada placa necessita de 8 ml de agar de topo. Adicionar o agente selectivo fenil-β-D-galactopiranósido (Gal-P) para a selecção de mutantes de agar superior só. Preparar os melhores ágares antes (dia de ensaio) e mantida a 50 ° C antes da adição de MgSO4 a ambos os melhores ágares, e PGai ao mutante ágar selecção. Dia 1: infectar as células com Phage embalados e Galvanização Rotular dois tubos de 50 ml por amostra: uma "mutante" tubo por amostra e um "título" tubo por amostra Etiqueta 8 placas de ágar por amostra: 4 "mutantes" placas por amostra e 4 "de título" placas por amostra Aliquota de 2 ml de células ressuspensas [a partir do passo 6.2.1.2] a cada tubo. Adicionar 500 ul de partículas de fagos empacotados a partir da etapa [6.2.2.8] a "mutante" (50 ml de tubos contendo células). Misturar suavemente e permitir que as partículas de fagos para infectar as células durante 30 minutos à temperatura ambiente. Após 30 min, vortex brevemente células infectadas e transferir 15 ul de células infectadas com o apropriados 50 ml "título" tubo (contendo células). Para placa de amostra título, adicione 30 ml de água morna (50 ° C) "título" agar top (não contendo P-Gal) para "título" tubo de 50 ml. Imediatamente distribute mistura de ágar / celular entre as placas 4 "titulação" (~ 8 ml por placa). Trabalhe rapidamente para que o ágar de topo não arrefece nas pipetas, e tentar não introduzir bolhas de ar. Placa as amostras "mutantes" seguinte. Certifique-se de P-Gal é adicionado agar top "seleção mutante". Adicionar 30 ml de ágar quente "seleção mutante" (contendo P-Gal) para "mutante" tubo de 50 ml. Imediatamente distribuir mistura agar / célula entre as placas 4 "mutantes" ~ (8 ml por placa). Permitir a solidificar placas (~ 15 min), em seguida, inverter e incubar a 37 ° C durante a noite. Dia 2: As placas de contagem Após incubação durante a noite, contar o número de placas em placas de titulação e mutantes. Para um grande número de placas, contar somente uma porção da placa para estimar a contagem total (por exemplo,., Frequentemente ¼ da placa título terá entre 100-200 placas). Um mínimo de 100 placas devem ser contadas por placa quando couNTING uma parte da placa. Calcula-se o número de unidades formadoras de placas (PFUs) por mL de células. Isto é feito através da divisão do número de placas em placas de "titulação" por o volume das células plaqueadas (15 ul). Utilizar o número de PFU / mL para estimar o número total de PFU no volume total de células infectadas plaqueadas em placas de "mutantes" (PFU / l * [2 ml de células + 0,5 ml de partículas de fagos empacotados – 15 ul para placas de titulação] ). Estimar o MF, dividindo o número total de placas mutantes contou com as 4 placas "mutantes" pelo número total estimado de PFUs no volume total de células infectadas determinadas a partir das placas de "titulação". Quando o espontâneo lacZ MF é da ordem de 3 x 10 -5 no grupo de controle, uma vez que para as células germinativas MutaMouse, a orientação da OCDE recomenda um mínimo de 125.000 a 300.000 PFUs não mutantes por animal ser telaed para a mutação de forma a obter um sinal de linha de base fiável. Outros modelos transgénicos podem ter MF inferior espontâneo, em cujo caso, seria necessário um número maior de PFU. Um teste de potência estatística pode ser realizada por forma a determinar o número mínimo de PFU e animais necessários para se obter a resolução pretendida. Dados de várias repetições podem ser agrupadas para satisfazer este requisito mínimo UFP, desde que não produzem significativamente diferentes frequências de mutação. 7. Estatísticas A unidade experimental para a análise é o mouse. Os dados produzidos a partir deste ensaio não são geralmente distribuídos normalmente. Como tal, selecione o método estatístico de análise baseada na característica de distribuição dos dados. NOTA: Padrão análise paramétrica (. Por exemplo, ANOVA) podem ser empregues, se a transformação de dados adequado é aplicado para equalizar a variância da resposta em toda a gama de obserção. Poisson ou análises de regressão binomial são frequentemente mais apropriado. Análise não paramétrica podem também ser empregues. Empregamos rotineiramente regressão de Poisson, utilizando o procedimento modelo linear generalizado (ie., Proc GENMOD) no SAS v.9.2 (SAS Institute, Cary, NC), como descrito por Lemieux et al 26.

Representative Results

Com uma média de contagem de placas de 200.000 placas por animal, que normalmente observamos um fundo média MF de aproximadamente 2,8 x 10 -5 em células germinativas masculinas com um desvio padrão de 1,7 x 10 -5 em nossos grupos de controle (baseado em dados de oito independente experimentos). Com essa contagem de placa, nível de fundo e variância, grupos de dose com n = 5 animais cada são suficientes para detectar um aumento de 2 vezes na MF com potência> 0,8. Os resultados são normalmente reportado em tabelas ou gráficos formatos. Tabela 2 e Figura 6 mostra os resultados representativos de cauda de esperma MutaMouse machos (n = 5 por grupo) expostas a uma única dose oral aguda de 0, 25, 50, e 100 mg / kg N-etil-N-nitrosoureia (ENU), seguido por um tempo de amostragem de 70 dias. Este período de 70 dias permite a medição dos acontecimentos mutacionais que ocorreram em espermatozóides que eram células estaminais espermatogoniais no tempo de exposição (Figura 3). Densidades típicas placa sobre placas de mutantes e titulação são mostrados na Figura 7. Tal como representado na Tabela 2 e na Figura 6, a exposição aguda ENU induziu um aumento significativo, dependente da dose no MF de células estaminais espermatogoniais. A dose mais baixa de 2,6 induziu um significativo aumento de vezes em relação aos controlos, que tinha uma base MF de 2,6 x 10 -5. Indução máxima ocorreu em altas doses, o que causou um aumento de 4,4 vezes mais controles. Um exemplo deste ensaio realizado em células túbulos seminíferos germinais pode ser encontrada em Douglas et al. 27, onde MF foi determinada em células túbulos germinais em vários intervalos de tempo seguintes 5 dias de repetição de injecção intraperitoneal de 50 mg / kg ENU. Nesse estudo, frequências de mutação nas células seminíferos aumentou até 15 dias após o tratamento e permaneceu constante a partir daí. Expocerteza regime Tecido coletadas Tipo de célula coletado (células-alvo) Fase de célula alvo no início da exposição Fases passou durante a exposição Aguda + 70 Cauda Espermatozóides maduros Com células-tronco Com células-tronco 14 + 21 Cauda Espermatozóides maduros Espermatogônias Spermatid 14 + 35 Cauda Espermatozóides maduros Com células-tronco Espermatócito 28 + 3 Cauda Espermatozóides maduros Espermatócito Espermatócito Spermatid Espermatozóides maduros Túbulos Com células-tronco Com células-tronco Com células-tronco Espermatogônias Spermatogonia Espermatogônias Espermatócito Espermatócito Spermatid Spermatid 28 + 49 Cauda Espermatozóides maduros Cel-tronco Com células-tronco Túbulos Com células-tronco Espermatogônias Espermatócito Spermatid Com células-tronco Com células-tronco Tabela 1 tipos de células e as fases da espermatogênese que são direcionados pelo teste de mutação roedor transgênico por vários projetos experimentais. Grupo de dose Animal # Mutant UFP Total UFP MF (x10 -5) MF médio (x 10 -5) Mudança Fold Valor de p Controle 1 5 180245 2.8 2.6 1.0 – 2 4 137835 2.9 3 11 385672 2.9 4 2 431396 0,5 5 6 152413 3,9 25 mg / kg 6 17 162353 10.5 6.9 2.6 0,0002 7 14 150094 9.3 8 4 154401 2.6 9 9 154401 5.8 10 12 196978 6.1 50 mg / kg 11 17 155727 10.9 9.3 3.6 <0,0001 12 11 135847 8.1 13 25 193499 12.9 14 12 133859 </ Td> 9,0 15 14 252807 5.5 100 mg / kg 16 26 170968 15.2 11.5 4.4 <0,0001 17 28 234584 11.9 18 10 145289 6.9 19 35 292236 12,0 20 22 190848 11.5 Tabela 2 A frequência de mutação lacZ na cauda de espermatozóides de transgênicos masculino mgelo expostos agudamente à ENU quando eram células-tronco espermatogônias (tempo de administração = 1 dia, o tempo de amostragem = 70 dias). UFP = placa formando unidade, MF = frequência das mutações. Figura 1 Uma representação esquemática da construção λgt10 fago. Figura 2 Um esboço do ensaio de mutação de células germinativas roedor transgênico. A Figura 3 um diagrama esquemático da espermatogénese no ratinho e os tipos de células e PHAes que são direcionados pelo teste de mutação roedor transgênico por vários projetos experimentais. NOTA: As barras brancas formados representam a proporção relativa de tipos de células presentes em suspensões de células preparadas a partir dos túbulos seminíferos (ou seja, espermátides> espermatócitos> espermatogônias> células-tronco). favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 4 Coleção do epidídimo rato cauda. A) Faça uma incisão no abdômen para o escroto. B) Identificar o epidídimo gordura pad. C) Com cuidado, puxe a almofada de gordura para retirar os testículos e epidídimo. D) Localize e extirpar cauda do epidídimo. <p class = "jove_content" fo: manter-together.within-page = "always"> Figura 5 Preparação da suspensão de células germinativas dos túbulos seminíferos. A) Uma incisão é feita na cápsula epitelial do testículo, expondo os túbulos seminíferos. B) Os túbulos seminíferos são espremidos para fora da cápsula. C) Um rolo de tecido é passado suavemente sobre os túbulos em um ângulo de 5-10 ° para libertar as células germinais contidas dentro. D) A suspensão de células germinativas é recolhido para processamento adicional. Figura 6 Representação gráfica de lacZ frequência de mutantes em MutaMouse esperma exposto de forma aguda como células-tronco para ENU (n = 5). Cadatriângulo representa o MF de um animal. * p <0,05, conforme determinado por meio de regressão de Poisson. Figura 7. placas de ágar representativos do ensaio de mutação roedor transgênico com placas formadas em um gramado de E. bactérias hospedeiras de E. coli. A) As placas de "mutantes" terá muito poucas placas (marcadas com setas), especialmente nos grupos de dose de controlo, que ocasionalmente têm zero de placas em algumas placas. B) As placas de "titulação" pode ter centenas de placas.

Discussion

Em comparação com os métodos tradicionais, o ensaio de mutação de células germinativas TGR fornece um meio mais rápido, mais econômico e mais sensíveis de quantificar induzida em mutações em células germinativas in vivo. Ao avaliar transgene MF directamente no esperma, em oposição à descendência, o número de animais, o tempo e os recursos necessários para a avaliação da mutagenicidade de linha germinal de qualquer composto individual é significativamente reduzida. Em termos de sensibilidade, fomos capazes de detectar um aumento de 2,6 vezes significativa em células estaminais Espermatogônias MF após exposição a 25 mg / kg ENU usando apenas 5 animais por grupo de dose. Em contraste, o ensaio locus específico foi incapaz de detectar qualquer alteração significativa na MF nesta mesma dose usando> 3.000 ratos no grupo exposto e> 500.000 ratos de controle 28.

Além de sua adequação para ambas as investigações mecanicistas e regulamentares, este método oferece uma oportunidade para estudos comparativos entre somático e germe linha Mutatisobre as taxas. Evidências recentes sugerem que, para algumas mutações agentes de células germinativas pode ser induzida em concentração mais baixa do que a necessária para a mutação somática. Por exemplo, a exposição prolongada a N-hydroxymethylacrylamide, um metabólito do carcinógeno acrilamida de alimentos 12, aumenta a freqüência de mutações em células germinativas letais dominantes em camundongos, sem afetar a freqüência de micronúcleos em células vermelhas do sangue, uma medida tradicional de células somáticas dano citogenético 13. Além disso, a exposição de ratos para ambas as freqüências de mutações dominantes e corrente lateral de tabaco fumo causa elevados no conjunto repita loci de DNA no esperma em doses que não aumentam de frequência de micronúcleos no sangue 14. Estas descobertas desafiam a suposição de que os testes de genotoxicidade somática é sempre protetor da linhagem germinativa, e reforçar a procura de um meio mais eficiente e eficaz em termos de custos para quantificar germe frequência de mutação celular. No entanto, a evidência para mutagénicos de células germinativas preferencial ainda é fraca, Em grande parte devido à falta de dados disponíveis para comparar as taxas de mutação em tecidos de células somáticas e germinativas. O ensaio de mutação TGR permite testes em paralelo e comparação das taxas de mutação induzida em vários tecidos, utilizando o mesmo transgene. Assim, o teste de mutação comparativa utilizando o ensaio TGR iria ajudar a preencher lacunas de dados em torno da possibilidade de efeitos em células germinativas preferenciais.

Avaliação simultânea de mutação de células somáticas e germinativas de ensaios regulamentares também melhorar a eficiência, reduzindo o número de animais necessários. A orientação da OCDE para mutação somática recomenda um tempo de administração de 28 dias, seguido por um tempo de amostragem de três dias (28 + 3). Análise de cauda de esperma podem oferecer pouca sensibilidade neste ponto do tempo, uma vez que tem como alvo as células expostas principalmente durante as fases de espermatócitos e spermatid da espermatogénese (Figura 3). As células nessas fases não sintetizam DNA e perdem progressivamente sua capacidade de reparo do DNA 6 </ Sup>. Além disso, a cauda do esperma de amostragem nesse ponto de tempo não seria suficiente para detectar mutações que ocorrem em células estaminais e espermatogônias. Assim, para a integração no projeto 28 + 3, a orientação da OCDE recomenda coletar células germinativas dos túbulos seminíferos. Esta população mista contém células derivadas a partir de síntese de ADN e de reparação proficiente tipos de células, incluindo células estaminais, e são expostos através da maioria das fases de espermatogénese. No entanto, devido à natureza mista destas células, a análise das células dos túbulos seminíferos não fornece informações específicas da fase. Além disso, há preocupação de que a presença de células não-alvo podem influenciar o MF observadas (por exemplo, chamadas mutagénicas em células germinativas falsos positivos devido à contaminação de células somáticas que sofreram mutação, ou diluição de um sinal de células germinativas mutação de células germinativas reparo de DNA com deficiência) . Atualmente não há dados suficientes para concluir se os resultados de células dos túbulos seminíferos em 28 + 3 oferta a mesma sensibilidade e especificidade de ums cauda de espermatozóides em momentos posteriores. Nosso laboratório está comparando CM induzidas em células dos túbulos seminíferos e cauda de espermatozóides recolhidos após vários tempos de amostragem para tratar desta questão. Observamos que a orientação da OCDE sugere um tempo de amostragem alternativo de 28 dias para os tecidos lentamente dividir tais como o fígado, que também pode ser adequado para análise de células germinativas. No entanto, os dados disponíveis são ainda insuficientes e estamos atualmente incapaz de recomendar um único projeto experimental para a análise simultânea de células somáticas e células germinativas, usando o teste de mutação TGR para ensaios regulamentares.

Uma característica deste ensaio que deve ser observado é que os eventos de mutação são avaliados em um transgene não murino. No entanto, há ampla evidência para sugerir que o transgene responde a agentes mutagênicos ambientais em uma forma similar a genes endógenos 20. Além disso, porque as origens precisas de eventos mutacionais independentes, são de difícilresolver, os resultados são geralmente classificado como uma frequência de mutação (em contraste com uma frequência de mutação). A frequência de mutação real pode ser resolvido se os resultados são corrigidos para a expansão clonal (ie. Divisão e multiplicação de uma única célula mutante que pode contribuir para a freqüência observada de mutantes transgene) por sequenciamento de DNA. A sequenciação dos transgenes mutantes podem ser realizados para caracterizar as mutações lacZ, e identificar os mutantes que podem ser derivados a partir de eventos de expansão clonal, embora isto aumenta significativamente o tempo e custo da análise. Em adição ao gene lacZ, theλgt10 vector transgénico abriga um gene-repórter mutação alternativa dependente da temperatura: uma variante do gene λ cll, que é mais curta (294 pb a 3021 pb vs lacZ, Figura 1) e mais fácil de sequenciar 29. A sequenciação também permite a análise do espectro de mutação induzida, proporcionando uma visão sobre o mutatiomecanismo nal do composto em questão. Um exemplo extremo de expansão clonal é a ocorrência de uma mutação "jackpot" (isto é., As mutações do transgene em um estágio muito inicial de desenvolvimento de um órgão que contribuem para a MF dramaticamente elevada, às vezes centenas de milhares de vezes maior do que o fundo). Os animais ou tecidos com uma mutação "jackpot" deve ser removido a partir da análise.

O ensaio que se descreveu é amplamente aplicável a outros modelos, tais como o TGR BigBlue ratinho e rato, e o plasmídeo de lacZ rato, todos os vectores que abrigam mutação repórter semelhantes (revisto em 20). A grande maioria dos estudos de células germinativas realizados até o momento, que empregam métodos semelhantes têm-se centrado quase exclusivamente na mutagénicos bem caracterizadas como ENU e radiação (revisado em 30). Espera-se que com o lançamento recente do método de ensaio da OCDE para o ensaio TGR, este ensaio serácada vez mais popular para a triagem química e avaliação regulamentar. Incorporação do ensaio de mutação de células germinativas TGR em uma bateria de testes de regulamentação irá preencher a lacuna existente, permitindo uma avaliação eficiente das indução de mutação em células germinativas 11. Além disso, este ensaio pode ser usado para medir o MF em praticamente qualquer tecido, proporcionando um meio adequado para a comparação das sensibilidades relativas das células somáticas e das células germinativas para a indução de mutações por agentes ambientais em mecanismos genéticos idênticos.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This research was funded by the Canadian Regulatory System for Biotechnology (CRSB) and Chemicals Management Plan (CMP) initiatives.

Materials

Name of Reagent/Material Company Catalog Number Comments
MutaMouse Covance –
E.coli (lacZ–/galE–) Covance – See reference 25 in manuscript
Chloroform Caledon 3001-2-40
Dulbecco's phosphate-buffered saline (D-PBS) Gibco 14190-250
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), 0.5M, pH 8 Sigma-Aldrich 03690 FLUKA
Isoamyl alcohol Caledon 2/10/7900
Lennon LB broth base Invitrogen 12780-029
Stainless steel mesh filter Sigma-Aldrich S3770
Transpack packaging extract Agilent Technologies 200220
β-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148
Ethyl alcohol, anhydrous (EtOH) Commercial Alcohols –
Ampicilin Gibco 11593-027 prepare 20 mg/ml in dH2O
Kanamycin Gibco 11815-024 prepare 5 mg/ml in dH2O
Phenol Invitrogen 15509-097 Saturate in 0.1 M Tris-HCl as per manufacturers direction
Phenyl-β-D-galactopyranoside (P-Gal) Sigma-Aldrich P6501 dissolve 3 g per 10 ml of dimethylformamide
Proteinase K Invitrogen 25530-031 prepare 60 mg/ml solution dH2O just before use, 20 µl per sample
Sodium acetate (NaAc) Fisher Scientific BP333-500 prepare 3M solutution, pH 5.2
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma-Aldrich L4390 prepare 10% solution in dH2O
1 M MgSO4 24.6 g MgSO4·7H2O per 100 ml dH2O, autoclave, store at room temperature up to 1 year
20% maltose solution 20.0 g maltose, 24.6 g MgSO4·7H2O, per 100 ml dH2O, filter sterilize, sore at 4ᵒC up to 6 months
Bottom agar Prepare 64 ml per sample (8 pitri plates per sample X  8 ml per plate): 5.0 g LB base, 6.4 g NaCl, 7.5 g agar, per 1L dH2O. Autoclave and cool to 50ᵒC before pouring into Petri plates
LB Broth 5.0 g LB base, 6.4 g NaCl per 1L dH2O. Autoclave and cool
Saline sodium citrate (SSC) 150 mM NaCl, 15 mM trisodium citrate, pH 7.0 
SM Buffer 5.8 g NaCl, 2.0 g MgSO4·7H2O, 50 ml 1 M Tris-HCl (pH 7.5), 5.0 ml of gelatin (2% w/v), per 1L dH2O, autoclave, store at room temperature up to 1 year
TE buffer 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8
Top agar, mutant plates Prepare 32 ml per sample (4 mutant plates per sample X 8 ml per plate): 5.0 g LB base, 6.4 g NaCl, 7.5 g agar, per 1L dH2O. Autoclave and cool to 50ᵒC. Add MgSO4 to 10 mM
Top agar, titre plates Prepare 32 ml per sample (4 mutant plates per sample X 8 ml per plate): 5.0 g LB base, 6.4 g NaCl, 7.5 g agar, per 1L H2O. Autoclave and cool to 50ᵒC. Add MgSO4 to 10 mM and P-Gal to 3 g/L
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O’Brien, J. M., Beal, M. A., Gingerich, J. D., Soper, L., Douglas, G. R., Yauk, C. L., Marchetti, F. Transgenic Rodent Assay for Quantifying Male Germ Cell Mutant Frequency. J. Vis. Exp. (90), e51576, doi:10.3791/51576 (2014).
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