Transgenen Nager Assay zur Quantifizierung von männlichen Keimzellmutantenhäufigkeit
Summary
De novo mutations in the male germline may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Here we describe a protocol for the use of a transgenic rodent model for quantifying mutations in male germ cells induced by environmental agents.
Abstract
De novo mutations arise mostly in the male germline and may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Traditional methods for assessing the induction of germ cell mutations require the use of large numbers of animals, making them impractical. As such, germ cell mutagenicity is rarely assessed during chemical testing and risk assessment. Herein, we describe an in vivo male germ cell mutation assay using a transgenic rodent model that is based on a recently approved Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD) test guideline. This method uses an in vitro positive selection assay to measure in vivo mutations induced in a transgenic λgt10 vector bearing a reporter gene directly in the germ cells of exposed males. We further describe how the detection of mutations in the transgene recovered from germ cells can be used to characterize the stage-specific sensitivity of the various spermatogenic cell types to mutagen exposure by controlling three experimental parameters: the duration of exposure (administration time), the time between exposure and sample collection (sampling time), and the cell population collected for analysis. Because a large number of germ cells can be assayed from a single male, this method has superior sensitivity compared with traditional methods, requires fewer animals and therefore much less time and resources.
Introduction
Sporadische DNA-Mutationen in der Keimbahn können zu einer verminderten Fortpflanzungserfolg führen, und wenn geerbt, können genetische Krankheit oder erhöhten Prädisposition für Krebs bei den Nachkommen 1-3 führen. Erhebliche Beweise zeigen, dass ein großer Anteil der de novo Mutationen werden von der väterlichen Keimbahn vererbt 4, und dass die Anzahl von Mutationen in den Nachkommen positiv mit väterlichen Alter zum Zeitpunkt der Empfängnis 5 korreliert. Der höhere Anteil der männlichen Mutationen ist vermutlich eine Folge der Altersunterschied während der Gametogenese zwischen den Geschlechtern, die größere Zahl der Spermatogenese Zellbereiche im Vergleich mit der Anzahl der oogenic Zellteilungen in der weiblichen Keimbahn 2 und eine progressive Abnahme der DNA Reparatureffizienz mit dem Alter bei Männern. All diese Faktoren tragen zu einer erhöhten Wahrscheinlichkeit des Replikationsfehler in der männlichen Keimbahn 6. Doch die Auswirkungen der väterlichen Engagement in Environmental Faktoren auf die Häufigkeit der de novo Mutationen bleibt ungewiss. Dennoch ist eine große Zahl von Umweltfaktoren sind bekannt, Keimzellmutationen in Nagetieren 7 zu induzieren, und es gibt Anzeichen dafür, dass ein Teil dieser Mittel kann auch die menschliche Keimbahn 8 berührt. Trotz dieser Bedenken sind Chemikalien routinemßig auf ihre Fähigkeit, Mutationen in somatischen Zellen für regulatorische Zwecke zu induzieren, und es wird allgemein angenommen, dass somatische Tests ausreichen, um die Keimbahn zu schützen. Daher werden nur selten Chemikalien auf ihre Fähigkeit zur Keimzellmutationen induziert bewertet.
Ein Grund Keimzellmutagenität Tests wurde weitgehend aus dem regulatorischen Entscheidungsprozess weggelassen ist ein Mangel an praktischen Methoden. Traditionelle Nagetier-basierte Methoden, wie die dominant-letale 9 und spezifischen Locus 10 Tests schätzen Keimzellmutationsraten durch Scoring mutierten Phänotypen in Embryonen oder Nachkommen vonEltern ausgesetzt. Diese Tests erfordern die Verwendung einer sehr großen Anzahl von Tieren, die Zeit und die Ressourcen, um statistisch aussagekräftige Ergebnisse zu erhalten.
Obwohl mehrere moderne Methoden zur Quantifizierung von Keimzellmutation haben vor kurzem entstanden, viele leiden Mängel im Hinblick auf ihre Praktikabilität, Effizienz und biologische Relevanz. Zum Beispiel, wiederholen Länge erweitert Mutationen an einfachen Tandem-Repeat (ESTR) Loci in männlichen Keimzellen mit einem einzigen Molekül PCR Ansatz 15 quantifiziert werden. Jedoch kann die Ausführung dieser Methode technisch anspruchsvoll und aufwendig sein, und im Gegensatz zu Punktmutationen, die biologische und gesundheitliche Bedeutung von Veränderungen in der Rapportlänge des sehr instabilen ESTR Loci unklar 16. Moderne Genomsequenzierungstechnologien können eine Fülle von biologisch sinnvolle Daten zu liefern, wenn für das Problem der vererbbare Mutationen 4,17 angewendet, aber die hohen Kosten, hohe Fehlerraten, verbunden Validierung erforderlichMutationen zu bestätigen, und Bioinformatik Herausforderungen immer noch die routinemäßige Anwendung dieser Option in einen Rechtstestkapazität 18 zu begrenzen.
Hier beschreiben wir ein praktisches Verfahren zur Quantifizierung induzierte Mutationen direkt in den Keimzellen des transgenen männlichen Mäusen. Dieses Protokoll ist für die transgene MutaMouse Modell, das mehrere verkettete Kopien eines rekombinanten gt10-Phagenvektor, enthaltend ein in beide Kopien des Chromosoms 3 19 (Figur 1) integriert Escherichia coli lacZ-Reporter-Gen beschrieben.
Dieses Protokoll ist auch für andere transgene Nager (TGR) Modelle, die auf den gleichen Prinzipien (BigBlue Maus und Ratte, Maus oder lacZ-Plasmid, etc.) Oder leicht unterschiedlichen Reportergenen (gpt Delta Maus und Ratte, TGR-Modelle in Lambert et Bewertung al. 20). Diese Methode basiert auf der in einer kürzlich veröffentlichten beschrieben TGR Mutation Assayund überarbeiteten OECD-Prüfrichtlinie 21 und wir uns auf die besondere Überlegungen erforderlich, um Beurteilung von Mutationen in der männlichen Keimbahn wegen der einzigartigen Eigenschaften der Spermatogenese Platz zu erarbeiten. Kurz gesagt beinhaltet der Test ausgesetzt transgenen männlichen Mäusen mit einem mutagenen Substanz, gefolgt von einer Abtastzeit in dem Vorausmutations Läsionen in stabile Mutationen fixiert. Bei der gewählten Abtastzeit werden die Mäuse getötet und Keimzellen entweder aus dem Nebenhoden oder Cauda Samenkanälchen gesammelt. Wie unten diskutiert, können mutagene Effekte in verschiedenen Phasen der Spermatogenese durch die Auswahl der Zeitspanne zwischen Belichtung und Probenentnahme zu bestimmen. Transgenen Einsätze, mehrere Kopien des λ-Phagen-Genoms pro Zelle, werden aus Keimzelle genomische DNA isoliert und in leer λ Phagen λ Kapside Schaffung Infektionsphagenpartikel, die dann verwendet werden, um einen E. infizieren verpackt coli-Wirt. Die infizierten Bakterien auf Selec gewachsentive Medien, die Zellen, die einen Vektor mit einer mutierten Kopie des lacZ aus Zellen, die Wildtyp-lacZ unterscheiden kann. Die mutagene Wirkung der Exposition auf die männliche Keimbahn wird durch Vergleichen der Frequenz des mutanten Transgene zwischen Kontrolle und behandelten Mäusen (2, 20 Lambert et al. Bewertung) bestimmt. Eine große Anzahl von Keimzellen aus einer einzigen Maus untersucht werden, was diesen Test überlegene Empfindlichkeit gegenüber traditionellen Methoden, während die Zahl der Tiere zu reduzieren erforderlich. Und weil keine spezielle Ausrüstung oder Ausbildung erforderlich ist, bietet dieser Test eine praktische und effiziente Möglichkeit für Keimzellmutation Tests in den meisten modernen Toxikologie / molekularbiologischen Laboratorien.
Eine wesentliche Voraussetzung für die wirksame Anwendung der TGR Keimzellmutationstest ist ein Verständnis der Spermatogenese-Zyklus (Abbildung 3). Die Zeit für die Keimzellen der Maus, um von st Fortschritteem-Zellen in den Samenleiter zu Spermatogonien, Spermatozyten, Spermatiden und schließlich Spermien im Nebenhoden (dh. Spermatogenese) ist etwa 49 Tagen fällig. Mutation kann in verschiedenen Phasen des Zyklus auftreten und ist oft spezifische Verbindung. Zwei wichtige Funktionen, die von besonderer Bedeutung für die Mutagenese in männlichen Keimzellen sind die Beendigung der DNA-Synthese während der frühen Meiose und der fortschreitenden Verlust von DNA-Reparaturkapazität 6 während der späten Post Meiose zwei Prozesse, die für die Einleitung und Fixierung erforderlich sind Die meisten Mutationen.
Aufgrund dieser einzigartigen Eigenschaften der Spermatogenese, gibt es drei kritische experimentelle Variablen für die Durchführung der TGR Keimzellmutationstest: (1) die Testverbindung Verwaltungszeit; (2) den Probezeit; und (3) die Auswahl der Keimzellpopulation zur Analyse (Abbildung 3 und Tabelle 1) zu sammeln. Verwaltung Zeit ist die ExperimeNTAL Variable, wie lange die Zielzellen werden mit den Testverbindungen ausgesetzt bestimmt. Die Länge der Applikationszeit kann auch verwendet werden, um Forderungen an spezifische Zelltypen oder Phasen der Spermatogenese Ziel. Zum Beispiel könnte eine einzelne tägliche Verabreichung verwendet werden, um die Wirkungen einer akuten Exposition auf einen bestimmten Zelltyp zu bestimmen. Ebenso kann die Exposition zu einer gesamten Spermatogenese Phase, indem sie auf nur meiotisch Division Spermatozyten oder mitotisch Division Spermatogonien mit einen 2-wöchigen Verabreichung Zeit und eine geeignete Probenahmezeit fokussiert werden, zum Beispiel. Chronische und subchronische Einnahmezeiten werden verwendet, um die Auswirkungen von Langzeitexposition zu bewerten, um eine ausreichende pharmakokinetischen Verteilung der Testverbindung zu gewährleisten, oder zulassen, ausreichende Akkumulation von Mutationen von schwach mutagen (zum Beispiel der 28-tägigen Verabreichung Zeit im OECD-Test empfohlen Richtlinie).
Abtastzeit ist die kritische Größe für die Bestimmung, bei derPhase der Spermatogenese die Zielzellen waren zum Zeitpunkt der Exposition. Die Probenahme bestimmt, wie viel Zeit und damit, wie viel weiter entlang der Spermatogenese Zyklus Zellen nach der Exposition durch geben. Zum Beispiel, um Effekte in der Stammzell Spermatogonien untersuchen, wurde ein Stichprobenzeit> 49 Tage, wenn das Sammeln ausgereifte Spermien erforderlich ist oder> 42 Tage, wenn das Sammeln unreifen Keimzellen aus den Samenleiter, um sicherzustellen, dass alle gesammelten Zellen haben genug Zeit zu haben entwickeln sich aus Stammzellen ausgesetzt. Es ist wichtig zu beachten, daß eine Probenahmezeit von mindestens 70 Tage wäre vorzuziehen, um eine echte Stammzellen Wirkung zeigen, um genügend Zeit für pharmakokinetische Verteilung des Giftstoffes zur Eliminierung von Zellen in späteren Phasen der Spermatogenese ausgesetzt sind, und zur Rechenschaft eine Zeit der vorübergehenden Sterilität, die nach Exposition mit hoch mutagenen Verbindungen 22 6 Wochen auftreten kann ~. Ebenso würde eine Stichprobenzeit von 21 Tagen, die Spermien zu gewährleisten Colleaus den Nebenhoden Cauda cted würde gerade erst abgeschlossen haben Meiose am letzten Tag der Exposition.
Keimzellen als reife Spermien der Cauda Epididymis oder als eine Mischung von verschiedenen Samenbildungszelltypen aus den Samenleiter gesammelt werden. Reifen Spermien bleiben in der Cauda für ~ 3 Tage, die es ermöglichen, relativ genau der Zelltyp oder die Phase der Spermatogenese, aus dem das Sperma stammt für einen bestimmten Versuchsanordnung zu bestimmen. So, die Analyse der Cauda Spermien ermöglicht eine sehr gezielte Untersuchungen von stadienspezifischen Mutationseffekte. Auf der anderen Seite, Zellsuspensionen aus den Samenkanälchen gesammelt enthalten eine Mischung aus verschiedenen Keimzelltypen in unterschiedlichen Phasen der Entwicklung, und bieten somit schlechtere Auflösung der Spermatogenese Phase, in der Mutationen entstanden. Außerdem Zellsuspensionen aus den Samenkanälchen erholt neigen dazu, eine Überrepräsentation von Spermatiden, gefolgt von Spermatozyten, und ver enthalteny wenige Spermatogonien und Stammzellen (diese Anteile werden durch abgestufte weiße Balken in Abbildung 3 dargestellt). Darüber hinaus können Suspensionen von den Samenkanälchen vorbereitet auch verschiedene Körperzellen enthalten. Somit, weil so viele Zelltypen vorhanden sind, Mutationseffekte können durch eine Vielzahl von Nicht-Zielzellen beeinflusst werden. Allerdings Sammeln von Proben aus Samenkanälchen bietet eine kostengünstige Option für die gleichzeitige Screening mehrere Keimzelltypen und einfache Integration von Keimzellanalyse in den OECD-Standardtestprotokoll für die somatische Mutation.
Um es zu wiederholen, je nach Bedarf des Prüfers, Verabreichungszeit, Abtastzeit und der gesammelten Zellpopulation kann eingestellt werden, um die Wirkungen der Exposition in verschiedenen Zelltypen und in verschiedenen Phasen der Spermatogenese abzufragen. Durch die sorgfältige Auswahl dieser Variablen können Experimente zur gezielten mechanistische Studien, oder für weitere allgemeine regulatorische Prüfung so gestaltet werdenZwecken.
Um Kenntnisse im Test erreichen, empfehlen wir den Einsatz einer akuten oralen Verabreichung von 100 mg / kg N-Ethyl-N-nitrosoharnstoff (DEU), gefolgt von einem 70 Tage Abtastzeit als Positivkontrolle. Analyse der Cauda Spermien so zielt Spermatogonien-Stammzellen (Abbildung 3), die typischerweise eine 4-5 fache Erhöhung der Mutationsrate (MF) gegenüber den Kontrollen nach dieser hoch mutagen Dosis DEU. Es sei darauf hingewiesen, dass diese Dosis ist bekannt, Sterilität induzieren 6 Wochen nach der Exposition werden, so kann es keine geeignete Kontrolldosis für kürzere Abtastzeiten werden. Diese Dosis wird auch produzieren eine erkennbare Zunahme in MF in den meisten somatischen Geweben 20. Die nachstehenden Ergebnisse wurden repräsentativ nach einer akuten Exposition +70 Schema mit drei Dosen von ENU bis einschließlich 100 mg / kg erzeugt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Im Vergleich zu herkömmlichen Methoden bietet die TGR Keimzellmutationstest eine schnellere, wirtschaftlichere und empfindlicher Mittel zur Quantifizierung Keimzellen in vivo Mutationen induziert. Durch die Bewertung Transgen MF direkt im Sperma, im Gegensatz zu Nachkommen, die Anzahl der Tiere, die Zeit und erforderlich, um die Keimbahn Mutagenität von jeder einzelnen Verbindung beurteilen Ressourcen deutlich reduziert. In Bezug auf die Empfindlichkeit, konnten wir eine signifikante 2,6 fache Erhöhung der Spermatogonien Stammzellen MF nach Exposition mit 25 mg / kg ENU mit nur 5 Tiere pro Dosisgruppe zu erkennen. Im Gegensatz dazu die spezifischen Locus-Test konnte keine signifikante Veränderung der MF an dieser gleiche Dosis mit> 3.000 Mäuse in der exponierten Gruppe und> 500.000 Kontrollmäusen 28 zu erkennen.
Zusätzlich zu seiner Eignung für beide mechanistischen und behördlichen Untersuchungen, bietet diese Methode eine Chance für vergleichende Studien zwischen somatischen und Keimbahn Mutatiauf Raten. Aktuelle Hinweise darauf, dass für einige Agenten Keimzellmutationen können bei niedrigerer Konzentration als für somatische Mutation erforderlich induziert werden. Zum Beispiel längerer N-Hydroxymethylacrylamid, ein Metabolit von der Lebensmittel Karzinogen Acrylamid 12, erhöht sich die Frequenz der dominanten tödliche Keimzellmutationen bei Mäusen ohne die Mikrokernfrequenz in den roten Blutkörperchen, ein traditionelles Maß für somatische Zell zytogenetische Schäden 13. Zusätzlich Exposition von Mäusen zu beiden Mainstream-und Nebenstromtabakrauch Ursachen erhöhte Mutationshäufigkeiten bei Tandem-Repeat-DNA-Loci im Sperma bei Dosen, die nicht Blutmikrokernfrequenz 14 erhöhen müssen. Diese Ergebnisse stellen die Annahme, dass somatische Genotoxizität ist immer Schutz der Keimbahn, und verstärken die Nachfrage nach einer effizienteren und kostengünstiges Mittel, um Keimzellmutationsfrequenz zu quantifizieren. Allerdings ist der Nachweis für die bevorzugte Keimzellmutagene noch schwach, Vor allem wegen des Mangels an verfügbaren Daten für den Vergleich von Mutationsraten in der somatischen und Keimzellgewebe. Die TGR Mutation Assay ermöglicht die parallele Prüfung und Vergleich der induzierten Mutationsraten in mehreren Geweben unter Verwendung der gleichen Transgens. So testen Vergleichs Mutation mit der TGR-Test würde helfen, Datenlücken zu füllen um die Möglichkeit von Präferenz Auswirkungen auf Keimzellen.
Gleichzeitige Beurteilung der somatischen und Keimzelle für regulatorische Mutation Test würde auch die Effizienz zu verbessern, indem die Anzahl der Tiere erforderlich. Die OECD-Richtlinie für die somatische Mutation empfiehlt einen 28-tägigen Verabreichung Zeit, gefolgt von einer dreitägigen Probenahmezeit (28 + 3). Analyse der Cauda Spermien geringe Empfindlichkeit zu diesem Zeitpunkt bieten, da sie meist in den Zellen Spermatozyten und Spermatiden Phasen der Spermatogenese (Abbildung 3) ausgesetzt abzielt. Zellen in diesen Phasen nicht synthetisieren DNA und schrittweise verlieren ihre Fähigkeit zur DNA-Reparatur-6 </ Sup>. Außerdem würde Probenahme Cauda Spermien zu diesem Zeitpunkt nicht zu Mutationen in Spermatogonien und Stammzellen auftreten zu erkennen. So ist die Integration in die 28 + 3 Design, empfiehlt die OECD-Richtlinie Sammeln Keimzellen aus den Samenleiter. Diese gemischte Population enthält Zellen, die aus der DNA-Synthese und Reparatur beherrschen Zelltypen, einschließlich Stammzellen abgeleitet und über den Großteil der Spermatogenese Phasen ausgesetzt. Jedoch wegen der gemischten Charakter dieser Zellen, Samenleiter Zellanalyse bietet keine phasenspezifischen Informationen. Darüber hinaus gibt es die Sorge, dass die Anwesenheit von Nicht-Zielzellen können die beobachteten MF beeinflussen (zB falsch positive Keimzellenmutagen Anrufe durch Verschmutzung von mutierten Körperzellen, oder Verdünnung eines mutierten Keimzelle Signal von DNA-Reparatur-defizienten Keimzellen) . Derzeit gibt es keine ausreichenden Daten zu dem Schluss, ob die Ergebnisse von Samenkanälchen Zellen bei 28 + 3 bieten die gleiche Sensitivität und Spezifität eins Cauda Spermien zu späteren Zeitpunkten. Unser Labor ist derzeit Vergleich induzierten Marktfaktoren in Samenkanälchen Zellen und Spermien der Cauda nach verschiedenen Probenahmezeiten gesammelt, um diesen Punkt eingehen. Wir stellen fest, dass der OECD-Richtlinie schlägt eine alternative Abtastzeit von 28 Tagen langsam teil Geweben wie der Leber, die auch für die Keimzellanalyse sein kann. Dennoch ist immer noch unzureichend verfügbaren Daten, und wir sind derzeit nicht in der Lage, eine einzige experimentelle Design für die gleichzeitige Analyse von Körperzellen und Keimzellen mit der TGR-Mutationstest für regulatorische Prüfung zu empfehlen.
Eine Charakteristik dieses Assays, die beachtet werden sollte, ist, daß Mutationsereignisse werden auf einem nicht-transgene Mäuse bewertet. Jedoch gibt es zahlreiche Beweise dafür, dass das Transgen reagiert auf Umwelt Mutagene in einer ähnlichen Weise, um endogene Gene 20. Zusätzlich, da die genauen Ursachen von unabhängigen Mutationsereignisse sind schwerbeheben, werden die Ergebnisse im allgemeinen als ein Mutantenfrequenz (im Gegensatz zu einer Mutationsfrequenz) angegeben. Die tatsächliche Mutationsfrequenz kann gelöst werden, wenn die Ergebnisse für die klonale Expansion (dh. Der Division und Multiplikation eines einzelnen mutierten Zelle, die zu der beobachteten Häufigkeit von Mutanten Transgen tragen kann), die durch DNA-Sequenzierung korrigiert. Die Sequenzierung der mutierten Transgenen kann durchgeführt werden, um die lacZ-Mutationen zu charakterisieren und zu identifizieren, die Mutanten von klonalen Expansion Ereignissen abgeleitet werden kann, obwohl dies trägt wesentlich zu der Zeit und den Kosten der Analyse. Neben dem lacZ-Gen, theλgt10 transgenen Vektor beherbergt eine alternative temperaturabhängigen mutations Reportergen: eine Variante des λ CII-Gen, das kürzere (294 bp vs das 3021 bp lacZ, Abbildung 1) und leichter zu sequenzieren 29 ist. Sequenzierung erlaubt auch die Analyse der induzierten Mutationsspektrum, die einen Einblick in die mutational Mechanismus der Verbindung in Frage. Ein extremes Beispiel für klonalen Expansion ist das Auftreten eines "Jackpot"-Mutation (dh., Transmutationen in einem sehr frühen Stadium der Entwicklung eines Organs, die zu einer dramatisch erhöhten MF beitragen, manchmal hunderte bis tausende Male größer als Hintergrund). Tiere oder Gewebe mit einem "Jackpot"-Mutation sollte aus der Analyse entfernt werden.
Der Test, die wir beschrieben haben, ist breit anwendbar auf andere TGR-Modellen wie dem BigBlue Maus und Ratte, und der lacZ-Plasmid-Maus, die alle ähnliche Mutation Hafen Reporter-Vektoren (in 20 überprüft). Die große Mehrheit der Keimzelle Studien bis heute durchgeführt, die ähnliche Methoden verwenden fast ausschließlich auf gut charakterisiert Mutagenen, wie DEU-und Strahlentherapie (in 30 prüft) konzentriert. Es wird erwartet, dass mit der jüngsten Veröffentlichung des OECD-Prüfrichtlinie für die TGR-Test, dieser Test wirdimmer beliebter für chemische Screening und regulatorische Bewertung. Einbeziehung der TGR Keimzellmutationstest in einen Regelungstestbatterie wird die bestehende Lücke durch die eine effiziente Bewertung der Mutation Induktion in Keimzellen 11 zu füllen. Darüber hinaus kann dieser Assay verwendet werden, um MF in nahezu jedem Gewebe zu messen, die eine geeignete Einrichtung zum Vergleichen der relativen Empfindlichkeiten der somatischen Zellen und Keimzellen auf die Induktion von Mutationen, die durch Umwelteinflüsse in identischen genetischen Endpunkten werden.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was funded by the Canadian Regulatory System for Biotechnology (CRSB) and Chemicals Management Plan (CMP) initiatives.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| MutaMouse | Covance | – | |
| E.coli (lacZ–/galE–) | Covance | – | See reference 25 in manuscript |
| Chloroform | Caledon | 3001-2-40 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (D-PBS) | Gibco | 14190-250 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), 0.5M, pH 8 | Sigma-Aldrich | 03690 FLUKA | |
| Isoamyl alcohol | Caledon | 2/10/7900 | |
| Lennon LB broth base | Invitrogen | 12780-029 | |
| Stainless steel mesh filter | Sigma-Aldrich | S3770 | |
| Transpack packaging extract | Agilent Technologies | 200220 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Ethyl alcohol, anhydrous (EtOH) | Commercial Alcohols | – | |
| Ampicilin | Gibco | 11593-027 | prepare 20 mg/ml in dH2O |
| Kanamycin | Gibco | 11815-024 | prepare 5 mg/ml in dH2O |
| Phenol | Invitrogen | 15509-097 | Saturate in 0.1 M Tris-HCl as per manufacturers direction |
| Phenyl-β-D-galactopyranoside (P-Gal) | Sigma-Aldrich | P6501 | dissolve 3 g per 10 ml of dimethylformamide |
| Proteinase K | Invitrogen | 25530-031 | prepare 60 mg/ml solution dH2O just before use, 20 µl per sample |
| Sodium acetate (NaAc) | Fisher Scientific | BP333-500 | prepare 3M solutution, pH 5.2 |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L4390 | prepare 10% solution in dH2O |
| 1 M MgSO4 | 24.6 g MgSO4·7H2O per 100 ml dH2O, autoclave, store at room temperature up to 1 year | ||
| 20% maltose solution | 20.0 g maltose, 24.6 g MgSO4·7H2O, per 100 ml dH2O, filter sterilize, sore at 4ᵒC up to 6 months | ||
| Bottom agar | Prepare 64 ml per sample (8 pitri plates per sample X 8 ml per plate): 5.0 g LB base, 6.4 g NaCl, 7.5 g agar, per 1L dH2O. Autoclave and cool to 50ᵒC before pouring into Petri plates | ||
| LB Broth | 5.0 g LB base, 6.4 g NaCl per 1L dH2O. Autoclave and cool | ||
| Saline sodium citrate (SSC) | 150 mM NaCl, 15 mM trisodium citrate, pH 7.0 | ||
| SM Buffer | 5.8 g NaCl, 2.0 g MgSO4·7H2O, 50 ml 1 M Tris-HCl (pH 7.5), 5.0 ml of gelatin (2% w/v), per 1L dH2O, autoclave, store at room temperature up to 1 year | ||
| TE buffer | 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8 | ||
| Top agar, mutant plates | Prepare 32 ml per sample (4 mutant plates per sample X 8 ml per plate): 5.0 g LB base, 6.4 g NaCl, 7.5 g agar, per 1L dH2O. Autoclave and cool to 50ᵒC. Add MgSO4 to 10 mM | ||
| Top agar, titre plates | Prepare 32 ml per sample (4 mutant plates per sample X 8 ml per plate): 5.0 g LB base, 6.4 g NaCl, 7.5 g agar, per 1L H2O. Autoclave and cool to 50ᵒC. Add MgSO4 to 10 mM and P-Gal to 3 g/L |
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