トランスジェニック齧歯類アッセイ男性生殖細胞変異頻度を定量化するための

畜産、メンテナンスや取り扱いに関わるすべてのプロトコールはカナダ保健省の動物管理委員会によって承認された。 1動物のエクスポージャーランダムに選択された投与時期に適切な暴露経路による試験化合物および関連するコントロールを持つグループと治療グループ（グループ当たり最小= 5）.Treatマウスを制御するために、（8-12週齢）トランスジェニック雄マウスを配布します。興味のある精子形成細胞型（ 図3）に応じて適切なサンプリング時間を選択してください。 サンプリング時間後に、イソフルラン麻酔下で頸椎脱臼（または他の適切な方法）によりマウスを安楽死させる。慎重に腹部や陰嚢の切開から精巣を引き出し、馬尾上体を切除します（ 図4、Duselis らを参照の精巣上体、コレクションの詳細な映像を表示する。24）。精細管を分析する場合には別の方法として、精巣を収集の細胞。後で使用するために-80℃で液体窒素とストアにフリーズ。 馬尾精子の2離と消化氷の上で尾上体解凍。ペトリ皿に解凍した馬尾を移し、徹底的にメスまたはカミソリの刃でミン​​チ。 ペトリ皿に室温D-PBS700μlのを追加します。 D-PBSは、精子（約10倍）と濁るまで懸濁液を描画し、放出することによって、ワイドボア千μlのピペットチップ、尾からの放出の精子を使用した。注：ワイドボアピペットチップを調製するためには、プラスチック製のピペットチップの先端から2〜3ミリメートルを切る。 新しい1.5mlチューブにステンレス製のメッシュフィルターで濾過してサスペンション。 D-PBSの追加の700μlのペトリ皿を洗うとメッシュフィルターを介して同じ1.5ミリリットルチューブに移す。メッシュを取り外し、チューブを氷上に置きます。 繰り返して、残りのサンプルについての2.1から2.3を繰り返します。 3分間11000×gでsamplesatスピン。上清を慎重にデカント。ペレットを乱さないようにしてください。 1.0ミリリットルの冷1×生理食塩水クエン酸ナトリウム（SSC）を追加します。ペレットまで、渦が完全に再懸濁する。これはときどきボルテックス数ラウンドがかかります。 10％SDS15μlのを追加します。反転/非精子細胞を破壊するために30秒間激しく振る。あまりにも静かに振る不十分な混乱をもたらすであろうし、ペレットは、以下のステップで適切に形成されません。 2分間11000×gでスピン。ゆるい、「ふわふわ」ペレットは、ステップ2.7における揺れが不十分のために体細胞の不完全な崩壊を示している。この問題が発生した場合は、もう一度サンプルを振ると、固いペレットが形成されるまでリスピン。注意深く上清を除去。ペレットを乱さないようにしてください。簡単に言うと、再びスピンし、200μlピペットで残りの上清を除去します。 ペレットを再懸濁されるまで、940μlの0.2×冷たいSSC及び渦を追加します。このペレットを再懸濁することが非常に困難であり得るし、ボルテックス数ラウンドをとることができる。 sのときどき塊パーマは避けられない。 120μlのβ-メルカプトエタノール、100μlの10％SDS、20μlの0.5M EDTA、pHが8、および20μlのProteinase Kを（60ミリグラム/ mlの、新しく調製）を追加します。よく混合し、37℃で回転させながら一晩消化する。フェノール/クロロホルム抽出に進んでください。 3フェノール/クロロホルムカウダ精子からDNAの抽出注：後期精子細胞および成熟精子の核DNAはプロタミンと複合体を形成されており、高度に体細胞のDNAと比較して、凝縮されているため、従来の核酸抽出方法には、仕事に突然変異試験のための十分な収率および純度のDNAを生成しません効率的。積極的な消化後の複数のフェノール-クロロホルム抽出を解放して（15から方法に基づく）精子DNAを精製するために必要とされる。 転送精子細胞を、15mlのポリプロピレンチューブにダイジェスト。 フェノール2 mlを加え：クロロホルム混合物（1：1）。 22 rpmでチューブを回転させて3分間。 10分間1,600×gで遠心分離し、新鮮な15mlチューブにファジー界面層と一緒に水のトップ層を転送します。 繰り返します3.1.2と3.1.3 3回繰り返したが、それぞれ、3分、4分、6分まで回転時間を変更する。最後の繰り返しでは、「ファジー」界面層のいずれかを転送することは避けてください。 イソアミルアルコール（24：1）4 回目の抽出後、3MのNaAc、pH5.2の1あたりの水性抽出物の溶解および2mlのクロロホルム70μlのを追加します。 12分間の22 rpmでチューブを回転させます。 10分間1,600×gで遠心分離し、新鮮な15mlチューブに水最上層を転送します。 無水エタノール2容量を追加し、静かに緩やかに揺り動かしながら横向きにチューブを回転させることによりDNAを沈殿。 ヒートシールされた牧草ピペットのチップ上にスプーリングによりDNAを収集します。 5分間、70％エタノールと空気乾燥でピペットチップを回転させることによって、DNAをすすぐ。 100μlのトライ – 抽出した後、40にDNA沈殿物を溶解させS-EDTA緩衝液、4℃で8店舗。 DNAはlacZの突然変異試験に進む前に2日以上、4℃で溶解させる。溶解性の問題が発生した場合、DNAは、さらなる使用の前に15分間65℃で溶解させることができる。 260でspectrophotometreとDNAの濃度を決定し、溶解したDNAの濃度は200〜2,000 ngの/μlの間にあることを確認してください。 精細管からの生殖細胞の4離と消化凍結した場合には、氷（約1時間）で精巣を解凍。転送はすりガラス板に精巣。 ピンセットで精巣の一方の端を持ってください。精巣のもう一方の端には、鉗子の別のペアまたは解剖はさみ（ 図5A）を使用して、上皮カプセルに穴を穿刺。穿刺を通して精細管を圧迫し、上皮カプセル（ 図5B）を廃棄します。 Addのカプセル化が解除精細管に室温のD-PBSを500μl。 角度組織ローラ（シリコーンゴムは強固に自由に回転する直径5mmのステンレス管、または同様の装置に嵌合さ）一端が5〜10°（ 図5C）のおおよその角度でプレートと接触するようになっている。任意の圧力を加えることなく、静かに彼らが平坦化されるまで、細管を横切って前後ローラーを移動し、D-PBSは、放出された細胞（約5〜10倍）で濁る。 いくつかの追加回細管を介してD-PBSの別の500μLを加え、穏やかに細管をロールオーバー。 転送さ取り外さ細管（ 図5D）の量を最小限に抑えながら、1.5mlマイクロ遠心チューブに細胞懸濁液を転送する。 繰り返します、必要に応じてより多くの細胞を収集するために4.5から4.6を繰​​り返します。 どんな誤って収集した細管をチューブの底に沈殿するための2分 – 1を許可します。 FRにD-PBSを転送落ち着いた細管（D-PBSの約100μl）を残して1.5ミリリットルチューブESH。この懸濁液の小アリコートを、細胞集団の組成を評価するために顕微鏡（位相差）の下で確認することができる。 30秒間11000×gで細胞をスピンダウン。慎重にペレットを乱すことなく、上清をデカントする。必要に応じて細胞ペレットは、この時点で-80℃で凍結することができる。 必要に応じて細胞を解凍する。溶解緩衝液5ml中の15mlのポリプロピレンチューブに再懸濁した細胞への転送（10mMトリスpH7.6の、10mMのEDTA、100mMのNaCl、1 mg / mlのプロテ​​イナーゼK、1％SDS）。 37℃で一晩回転させながら培養器でのダイジェスト。 フェノール/クロロホルム抽出に進んでください。 5。フェノール/精細管生殖細胞からのDNAのクロロホルム抽出注：これらの細胞型は、まだnまで進行していないので、あまり積極的で抽出は、精細管の生殖細胞DNAを単離するために使用されているuclear結露。 クロロホルム混合物（1：1）に一晩精細管細胞消化フェノールを5ml追加します。 20分間22rpmでチューブを回転させます。 10分間1,600×gで遠心分離し、新鮮な15mlチューブに、「ファジー」界面層を回避しながら、水性トップ層を転送します。 （通常は5ミリリットルを回収する）の5M NaCl 5ミリリットルあたりの水性抽出物の100μLを加えイソアミルアルコール：クロロホルム5ml加える（24：1）。 12分間の22 rpmでチューブを回転させます。 10分間1,600×gで遠心分離し、新鮮な15mlチューブに水最上層を転送します。 無水エタノール2容量を追加し、穏やかにチューブを回転させ、反転させることによりDNAを沈殿さ。 封鎖牧草ピペットのチップ上にスプーリングによりDNAを収集します。 5分間、70％エタノールと空気乾燥でピペットチップを回転させることによって、DNAをすすぐ。 40-100μlのトリス-EDTA緩衝液、4℃で8ストアでDNAを溶解する。 DNAは2の最小4℃で溶解させる日のlacZ突然変異試験に進む前に（ステップ3.9を参照）。溶解性の問題が発生した場合、DNAは、さらなる使用の前に15分間65℃で溶解させることができる。 260でspectrophotometreでDNAの濃度を測定し、濃度が200〜2,000 ngの/μlの間にあることを確認してください。 6。 のLacZ突然変異試験細菌または真菌汚染がパッケージング効率、ならびにプラークの増殖およびスコアを妨害する可能性がある。これは、パッケージング反応、宿主培養および増殖培地の汚染を防止するための適切な無菌の尺度を用いたlacZアッセイを行うことが重要である。 アッセイ前日：ボトム寒天と一晩培養を準備するエイト各寒天8ミリリットルの底を含む（力価をカウントする突然変異体を獲得する4枚、4枚）のプレートをサンプルあたり必要とされる（ すなわち 、サンプルあたり64ミリリットル）。ボトム寒天は、両方に同じです突然変異体およびタイターカウントプレート。処理されているサンプルの数に対して十分なボトム寒天を準備します。無菌的に90ミリメートルペトリ皿（ディッシュあたり8ミリリットル）に注ぎ、寒天を固化することができます。 NOTE：ボトム寒天プレートを予め1週間まで製造することができる。 50mlチューブ中で、20％マルトース溶液を、25μlのアンピシリン（20 mg / ml）を、および20μlのカナマイシン（5 mg / ml）を、100μlの10mlのLBブロスを加える。 Eで接種する大腸菌遺伝子（lacZ – /のgalE – ）25と240 rpmで振盪しながら37℃で一晩成長する。 1日目：サブ培養細胞新鮮なLB（抗生物質なし）中で一晩培養の1：100希釈を調製し、サブ培養細胞。サブカルチャーの8ミリリットルの容量は、サンプル毎に必要とされる。 OD 600 = 1になるまで約3.5時間、240rpmで振盪しながら37℃でインキュベートする。 OD 600 = 1は、10のために15℃で1300×gで均等に50mlチューブ遠心分離に細胞懸濁液を分割した場合分。 （ すなわち 、サンプルあたり4 ml）を元の体積の半分に上清及び再懸濁細胞を除去LBを、10mMのMgSO 4を含有する。 [ステップ6.2.4.3]を必要になるまで脇に細胞を入れてください。 1日目：ラムダファージ粒子中のDNAをパッケージング 30℃に水浴をウォームアップ。 広口径10μlのピペットチップ、1.5mlチューブに移し4μlのDNAを用いて。注：このステップでは、準備時間を短縮するために、事前に日以上行うことができる。 ファージパッケージング抽出キット（各2サンプルのための1管）から第一の管（赤）ウォームアップ。簡単に言えばチューブの底に抽出を収集するためにスピン。 DNAサンプルの最初のチューブからパッケージング抽出物を4.8μLを移し、ピペットチップで穏やかに撹拌により混合する。簡単に言うと、チューブ内のサンプルをスピンダウン。 30℃の水浴中で1.5時間インキュベートする。 第二（青）パッケージング抽出チューブ（〜15のサンプルについて1管）ウォームアップ。簡単に述べると下部の抽出物を収集するためにスピンチューブの。 DNAサンプルを第二の管からパッケージング抽出物を4.8μLを移し、穏やかに攪拌により混合する。簡単に言うと、チューブ内のサンプルをスピンダウン。 30℃の水浴中でさらに1.5時間インキュベートする。 500μlのSMバッファー中でパッケージされたファージ粒子を再懸濁し、20 rpmで30分間回転させて混合します。 チューブの底にサンプルを収集する30秒間11000×gで、簡単に渦サンプルや遠心分離機を回転させた後。ファージ粒子は、感染[ステップ6.2.4]の準備ができている。 1日目：トップ寒天を準備タイタープレートおよび変異選択プレートに個別の上層寒天を準備します。各サンプルは4タイタープレート、および4変異型のプレートが必要です。各プレートは、8ミリリットルトップアガーを必要とします。唯一寒天突然変異体の選択トップに選択剤フェニル-β-D-ガラクトピ（P-GAL）を追加します。事前に（アッセイの日に）両方のトップ寒天を準備し、両方のトップ寒天に硫酸マグネシウムを加える前に50℃で維持し、PG突然変異体の選択寒天にアル。 1日目：パッケージ化されたファージとメッキが細胞に感染サンプルあたり2 50mlチューブにラベルを付ける：サンプルあたり1「変異型」チューブサンプルあたり1「力価」チューブサンプルあたりラベル8寒天プレート：サンプルあたり4「変異体」プレートおよびサンプルあたり4「タイター」プレート各チューブに分注し[ステップ6.2.1.2から]再懸濁した細胞の2ミリリットルを。 （細胞を含む）を「変異体」50mlチューブに[ステップ6.2.2.8から]パッケージされたファージ粒子を500μlを追加。穏やかに混合し、ファージ粒子を室温で30分間、細胞に感染することを可能にする。 30分後、短時間ボルテックスして細胞を感染させ、（細胞を含む）を、適切な50ミリリットル、「力価」の管に感染した細胞を15μlを移す。 プレート力価サンプルに、「力価」50mlチューブに（P-Galを含むNOT）温かい（50℃）「力価」トップアガー30mlのを追加します。すぐにDISTRIB4「タイター」プレート（プレート当たり〜8ミリリットル）の中uteの寒天/細胞混合物。トップアガーをピペットで冷却し、気泡を導入しないようにしようとしないように迅速に作業。 次の「変異体」のサンプルをプレート。 P-Galは「変異の選択」トップアガーに添加したことを確認。 「変異体」50mlチューブに（P-Galを含む）温かい「突然変異の選択」寒天の30ミリリットルを追加します。すぐに4「変異体」プレート（プレート当たり〜8ミリリットル）の中で寒天/細胞混合物を配布します。 次いで、プレートを（〜15分）固化し反転させ、37℃で一晩インキュベートすることを許可する。 2日目：カウントプラーク一晩のインキュベーション後、突然変異体およびタイタープレート上のプラークの数を数える。プラークが多数の場合は、合計数を推定するために、プレートの一部のみをカウント（ 例えば 、多くの場合、¼タイタープレートの100〜200の間のプラークを持つことになります）。時COU 100プラークの最小値は、プレートごとにカウントされるべきであるプレートの一部をnting。 細胞の1μl当たりのプラーク形成単位（P​​FUで）の数を計算します。これは、（15μl）を播種した細胞の体積で「タイター」プレート上のプラークの数で割ることによって行われます。 /μlの「変異体」プレート（のPFU /μlの*の上にプレートし、感染した細胞の総容量のPFUの総数を推定するためのPFUの数を使用します[2ミリリットル細胞+ 0.5ミリリットルパッケージ化されたファージ粒子 – タイタープレート用の15μLを] ）。 「タイター」プレートから決定し、感染した細胞の全体積のPFUの推定総数で4「変異体」プレート上で計数突然変異体のプラークの総数で割ることにより、MFを見積もります。 それはMutaMouse生殖細胞について、OECDガイドラインは、動物あたり125000〜300000の非突然変異体のPFUの最小画面ことをお勧めしますように自発的なlacZの MFは、対照群では3×10 -5のオーダーであるとき信頼性の高いベースライン信号を得るために、突然変異のためのエド。他のトランスジェニックモデルでのPFUのより多くが必要とされる、その場合に低い自発MFを有していてもよい。統計的検出力試験は、所望の解像度を得るために必要なのPFUや動物の最小数を決定するために行うことができる。複数の反復からのデータは、この最小PFU要件を満たすためにプールされ、それらが著しく異なる変異周波数を生成しない設けてもよい。 7統計分析のための実験単位はマウスである。このアッセイから生成されたデータは、一般的に正規分布していない。このように、データの分布特性に基づいて分析のための統計的方法を選択する。 注：適切なデータ変換がobservaの範囲にわたる応答の分散を等化するために適用される場合、標準パラメトリック分析（ 例えば 、ANOVA）を用いてもよいる。ポアソンや二項回帰分析は、多くの場合に適しています。ノンパラメトリック分析を使用することもできる。私たちは日常的に（ すなわち 、学会GENMOD）一般化線形モデル手順を使用してポアソン回帰を採用したSAS v.9.2（SASインスティチュート、ノースカロライナ州ケアリー）でレミューら 26によって記載されているように。