Transgene knaagdieren Assay voor het kwantificeren van Male Germ Cell Mutant Frequency
Summary
De novo mutations in the male germline may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Here we describe a protocol for the use of a transgenic rodent model for quantifying mutations in male germ cells induced by environmental agents.
Abstract
De novo mutations arise mostly in the male germline and may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Traditional methods for assessing the induction of germ cell mutations require the use of large numbers of animals, making them impractical. As such, germ cell mutagenicity is rarely assessed during chemical testing and risk assessment. Herein, we describe an in vivo male germ cell mutation assay using a transgenic rodent model that is based on a recently approved Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD) test guideline. This method uses an in vitro positive selection assay to measure in vivo mutations induced in a transgenic λgt10 vector bearing a reporter gene directly in the germ cells of exposed males. We further describe how the detection of mutations in the transgene recovered from germ cells can be used to characterize the stage-specific sensitivity of the various spermatogenic cell types to mutagen exposure by controlling three experimental parameters: the duration of exposure (administration time), the time between exposure and sample collection (sampling time), and the cell population collected for analysis. Because a large number of germ cells can be assayed from a single male, this method has superior sensitivity compared with traditional methods, requires fewer animals and therefore much less time and resources.
Introduction
Sporadische DNA-mutaties in de kiembaan kan leiden tot verminderde reproductief succes en, indien geërfd, kunnen genetische ziekte of een verhoogde aanleg voor kanker in de nakomelingen 1-3 veroorzaken. Substantieel bewijs aantoont dat een groot deel van de novo mutaties overgenomen van de vaderlijke kiembaan 4, en het aantal mutaties in het nageslacht positief gecorreleerd met paternale leeftijd de conceptie 5. Het hogere aandeel van mannelijke mutaties wordt verondersteld een gevolg van de verschillen in leeftijd gedurende gametogenese tussen de seksen, het groter aantal spermatogenese celdelingen vergelijking met het aantal oogenic celdelingen in de vrouwelijke kiemlijn 2, en een geleidelijke afname in DNA repareren efficiency met de leeftijd bij mannen. Al deze factoren dragen bij tot een verhoogde kans op replicatie fouten in de mannelijke kiemlijn 6. Echter, de impact van de vaderlijke blootstelling aan Environmental factoren op de frequentie van de novo mutaties blijft onzeker. Desalniettemin is een groot aantal milieu-agenten staan bekend om kiemcel mutaties bij knaagdieren 7 opwekken, en er is steeds meer bewijs dat sommige van deze middelen kunnen ook invloed hebben op de menselijke kiembaan 8. Ondanks deze zorgen, worden chemicaliën routinematig getest op hun vermogen om mutaties in somatische cellen voor onderzoeksdoeleinden induceren en algemeen wordt aangenomen dat somatische proeven volstaan om de kiemlijn beschermen. Daarom zijn chemische stoffen zelden onderzocht op hun vermogen om kiemcel mutaties veroorzaken.
Een reden mutageniteit tests zijn grotendeels weggelaten uit de regelgeving besluitvormingsproces is een gebrek aan praktische methodieken. Traditionele knaagdieren gebaseerde methoden, zoals de dominante letale 9 en specifieke locus 10 testen, schatten kiemcel mutatie tarieven door te scoren mutante fenotype in embryo's of nakomelingen vanblootgesteld ouders. Deze testen vereisen het gebruik van een groot aantal dieren, tijd en middelen om statistisch significante resultaten te verkrijgen.
Hoewel verschillende moderne methoden voor het kwantificeren van kiemcel mutatie onlangs naar voren zijn gekomen, veel last hebben tekortkomingen in termen van hun functionaliteit, efficiency en biologische relevantie. Bijvoorbeeld, herhaal lengte mutaties op uitgebreid eenvoudige tandem repeat (ESTR) loci kan worden gekwantificeerd in mannelijke geslachtscellen met behulp van een enkel molecuul PCR benadering 15. Echter, het uitvoeren van deze werkwijze technisch moeilijk en omslachtig, en in tegenstelling puntmutaties, biologische en gezondheidsbelang van veranderingen in de herhaallengte van de zeer instabiele ESTR loci onduidelijk 16. Moderne whole genome sequencing technologieën kan een schat aan biologisch zinvolle gegevens te verstrekken wanneer toegepast op het probleem van erfelijke mutaties 4,17, maar de hoge kosten, hoge foutenpercentages, geassocieerd validatie vereistom mutaties te bevestigen, en bioinformatica uitdagingen nog steeds beperken de routinematige toepassing van deze optie in een regelgevend testcapaciteit 18.
Hierin beschrijven we een praktische methode voor het kwantificeren geïnduceerde mutaties direct in de geslachtscellen van transgene mannelijke muizen. Dit protocol wordt beschreven voor de transgene MutaMouse model, die meerdere aaneengeschakelde kopieën van een recombinant Agt10 faag vector die een Escherichia coli lacZ-gen geïntegreerd in beide kopieën van chromosoom 3 19 (figuur 1) heeft.
Dit protocol is ook op andere transgene knaagdier (TGR) modellen gebaseerd op dezelfde principes (BigBlue muis en rat, of lacZ plasmide muis, etc.) Of iets andere reportergenen (gpt delta muis en rat relevant TGR modellen beoordeeld in Lambert et al. 20). Deze methode is gebaseerd op de TGR mutation assay in een onlangs beschrevenen de herziene OESO-richtsnoer 21 en gaan we dieper in op de speciale overwegingen nodig zijn voor de beoordeling van de mutaties te ontvangen in de mannelijke kiembaan vanwege de unieke kenmerken van de spermatogenese. In het kort, de bepaling omvat het blootstellen transgene mannelijke muizen met een mutagene stof, gevolgd door een bemonsteringstijdstip waarbij pre-mutatie laesies is bevestigd in stabiele mutaties. Op de gekozen sample tijd, zijn muizen gedood en kiemcellen worden verzameld van zowel de cauda epididymis of de testes. Zoals hieronder wordt besproken, kunnen mutagene effecten in verschillende fasen van de spermatogenese worden bepaald door het selecteren van de tijd tussen blootstelling en monstername. Transgene inserts, die meerdere kopieën van de λ faag genoom per cel worden geïsoleerd uit kiemcellen genomisch DNA en verpakt in lege capsiden faag λ λ creëren infectieuze faagdeeltjes die vervolgens worden gebruikt om een E. infecteren coli gastheer. De geïnfecteerde bacteriën worden gekweekt op selectieve media die cellen die een vector met een gemuteerde kopie van lacZ uit cellen die wildtype lacZ kunnen onderscheiden. Het mutagene effect van blootstelling op de mannelijke kiemlijn wordt bepaald door de frequentie van mutant transgenen tussen controle en behandelde muizen (figuur 2 beoordeeld in Lambert et al. 20) te vergelijken. Een groot aantal kiemcellen kan worden bepaald uit een enkele muis, waardoor deze test superieure gevoeligheid ten opzichte van traditionele methoden en vermindert het aantal benodigde dieren. Omdat geen speciale uitrusting of opleiding nodig, deze test een praktische en efficiënte oplossing voor kiemcellen mutatie testen in de meeste moderne toxicologie / moleculaire biologie laboratoria.
Een essentiële voorwaarde voor de effectieve toepassing van de TGR kiemcel mutatie test is een goed begrip van de spermatogene cyclus (Figuur 3). De tijd voor de muis kiemcellen om van stem cellen in de testes te spermatogonia, spermatocyten, spermatiden, en ten slotte naar sperma rijpen in de bijbal (dwz. spermatogenese) is ongeveer 49 dagen. Mutatie kan op verschillende fasen van deze cyclus en is vaak verbindingsspecifieke. Twee belangrijke functies die van bijzonder belang zijn voor mutagenese in mannelijke geslachtscellen zijn de beëindiging van de DNA-synthese tijdens de vroege meiose, en het progressief verlies van DNA-herstel capaciteit 6 tijdens de late post-meiose, twee processen die nodig zijn voor de inductie en de fixatie van meeste mutaties.
Vanwege deze unieke kenmerken van de spermatogenese, zijn er drie kritische experimentele variabelen voor het gedrag van de TGR kiemcel mutatieassay: (1) de te onderzoeken verbinding administratie tijd; (2) de bemonsteringstijd; en (3) de keuze van de kiem celpopulatie te verzamelen voor analyse (Figuur 3 en Tabel 1). Administratie is de experimental variabele die bepaalt hoe lang doelcellen blootgesteld aan de testverbindingen. De duur van de toediening tijd kan ook worden gebruikt blootstelling aan specifieke celtypen of fasen van spermatogenese richten. Bijvoorbeeld kan een enkele dag toediening worden gebruikt om de effecten van een acute blootstelling aan een specifiek celtype te bepalen. Evenzo kan blootstelling worden gericht op een volledige spermatogenese fase, bijvoorbeeld doelwit alleen meiose verdelen spermatocyten of mitotisch delende spermatogonia met een 2 weken toedieningstijd en een geschikte bemonsteringstijd. Chronische en sub-chronische toediening keer worden gebruikt om de effecten van de blootstelling op lange termijn te beoordelen, om voldoende farmacokinetische verdeling van de teststof te zorgen, of toestaan voldoende accumulatie van mutaties van zwakke mutagene agentia (bijvoorbeeld de 28 dagelijks bestuur aanbevolen tijd in de OESO-test richtlijn).
Sampling is de kritische variabele bepalen waaropfase van spermatogenese de doelwitcellen waren ten tijde van de belichting. De bemonsteringstijd bepaalt hoeveel tijd, en dus hoe veel verder langs de spermatogene cyclus, cellen passeren na blootstelling. Bijvoorbeeld om effecten in stamcel spermatogonia te onderzoeken, een bemonsteringstijd> 49 dagen is nodig als het verzamelen van volledig gerijpt sperma, of> 42 dagen, indien het verzamelen van onrijpe kiemcellen van de testes, om ervoor te zorgen dat alle verzamelde cellen genoeg tijd hebben gehad om ontwikkelen van blootgestelde stamcellen. Het is belangrijk op te merken dat een bemonsteringstijd van ten minste 70 dagen de voorkeur een echte stamcel effect aantonen voldoende tijd voor farmacokinetische verdeling van de toxische, voor het elimineren van cellen die blootgesteld bij latere fasen van spermatogenese zou zijn, en die rekening een periode van tijdelijke steriliteit kunnen optreden ~ 6 weken na blootstelling aan sterk mutagene verbindingen 22. Evenzo zou een bemonsteringstijd van 21 dagen zorgen ervoor dat sperma collected van de cauda epididymis slechts zou hebben afgerond meiose op de laatste dag van de blootstelling.
Kiemcellen kan worden verzameld als rijp sperma van de cauda epididymis, of als een mengsel van verschillende celtypes spermatogenese van de testes. Oudere sperma blijven de cauda voor ~ 3 dagen, waardoor kan worden vastgesteld met nauwkeurigheden het celtype of fase spermatogenese waarvan het sperma afkomstig van een bepaalde proefopzet. Zo analyse van cauda sperma vergunningen zeer gerichte onderzoeken van fase-specifieke mutatie-effecten. Anderzijds, celsuspensies vanuit het testes een mengsel bevatten van verschillende soorten kiemcellen in verschillende ontwikkelingsfasen, en biedt dus slechtere resolutie van de spermatogenese fase waarin mutaties ontstaan. Daarnaast celsuspensies hersteld van de testes hebben de neiging om een oververtegenwoordiging van spermatiden, gevolgd door spermatocyten, en ver bevatteny paar spermatogonia en stamcellen (deze verhoudingen zijn vertegenwoordigd door afgestudeerd witte balken in figuur 3). Bovendien kunnen suspensies bereid uit de testes ook verscheidene somatische cellen. Aldus, omdat veel celtypen aanwezig zijn, mutatie-effecten kan worden beïnvloed door een verscheidenheid van niet-doelwitcellen. Echter, het verzamelen van monsters van testes biedt een voordelige optie voor het gelijktijdig screenen van meerdere kiemcellen soorten en eenvoudige integratie van kiemcellen analyse naar de standaard OECD test protocol voor somatische mutatie.
Nogmaals, afhankelijk van de behoeften van de onderzoeker, toedieningstijd, bemonsteringstijd en de verzamelde celpopulatie kan worden aangepast om de effecten van blootstelling in verschillende celtypes en in verschillende fasen van spermatogenese ondervragen. Door het zorgvuldig selecteren van deze variabelen, kunnen experimenten worden ontwikkeld voor gerichte mechanistische studies, of voor meer algemene regelgeving testening doeleinden.
Om vaardigheid te bereiken in de test, raden wij het gebruik van een acute orale toediening van 100 mg / kg N-ethyl-N-nitrosoureum (ENU), gevolgd door een 70 daagse bemonsteringstijd als positieve controle. Analyse van cauda sperma gericht aldus spermatogoniastamcellen (figuur 3), die typisch vertonen een 4-5 voudige toename mutant frequentie (MF) dan controles na dit sterk mutagene dosis ENU. Opgemerkt zij dat deze dosis bekend induceren steriliteit 6 weken na blootstelling, het kan dus een besturingskaart dosis voor kortere bemonsteringstijden zijn. Deze dosis zal ook een detecteerbare toename MF meeste somatische weefsels 20. De representatieve onderstaande resultaten werden verkregen na een acute blootstelling 70 regime met drie doses ENU tot en met 100 mg / kg.
Protocol
Representative Results
Discussion
In vergelijking met traditionele methoden, de TGR kiemcel mutatieassay biedt een snellere, zuiniger en meer gevoelige middel van het kwantificeren geïnduceerd in vivo kiemcel mutaties. Afgaande transgen MF direct in sperma, in tegenstelling tot nageslacht, het aantal dieren, de tijd en middelen die de kiemlijn mutageniteit van een enkele verbinding beoordelen aanzienlijk verminderd. Qua gevoeligheid, konden we een aanzienlijke 2,6-voudige toename in spermatogonia stamcellen MF na blootstelling aan 25 mg / kg ENU maar 5 dieren per dosisgroep detecteren. In tegenstelling, de specifieke locus test kon geen significante verandering in de MF op deze zelfde dosis met> 3.000 muizen in de blootgestelde groep en> 500.000 controle muizen 28 te detecteren.
Naast de geschiktheid voor zowel mechanistische en van onderzoeken, deze methode biedt een mogelijkheid voor vergelijkende studies tussen somatische en germinale Mutatiop de tarieven. Recente gegevens wijzen erop dat voor sommige agenten kiemcellen mutaties kunnen worden geïnduceerd bij een lagere concentratie dan nodig is voor somatische mutatie. Bijvoorbeeld, langdurige blootstelling aan N-hydroxymethylacrylamide, een metaboliet van het eten carcinogeen acrylamide 12, verhoogt de frequentie van dominante letale mutaties kiemcellen in muizen zonder de micronucleus frequentie in rode bloedcellen, een traditionele maat somatische cellen cytogenetische schade 13. Bovendien, de blootstelling van muizen aan zowel mainstream en sidestream tabaksrook oorzaken verhoogde mutatie frequenties tandem repeat loci DNA in het sperma bij doses die niet in het bloed verhogen micronucleus- frequentie 14. Deze bevindingen betwisten de veronderstelling dat somatische genotoxiciteitsonderzoeken is altijd beschermend van de kiembaan, en versterken de vraag naar een meer efficiënte en kosteneffectieve manier om kiemcel mutatie frequentie te kwantificeren. Echter, het bewijs voor preferentiële mutagene stoffen in geslachtscellen is nog zwak, Grotendeels te wijten aan het gebrek aan beschikbare gegevens voor het vergelijken van het aantal mutaties in somatische en kiemcellen weefsels. De TGR mutatieassay laat parallel testen en vergelijken van geïnduceerde mutatie tarieven in meerdere weefsels met behulp van hetzelfde transgen. Zo vergelijkende mutatie testen met behulp van de TGR test zou helpen vullen lacunes in de gegevens rond de mogelijkheid van preferentiële kiemceleffecten.
Gelijktijdige beoordeling van somatische en kiemcellen mutatie die wettelijk voorgeschreven proeven zou ook de efficiëntie te verbeteren door vermindering van het aantal dieren dat nodig is. De OESO-richtlijn voor somatische mutatie beveelt een 28 dagen administratie tijd, gevolgd door een driedaagse sampling tijd (28 + 3). Analyse van cauda sperma kunnen lage sensitiviteit op dit tijdstip aanbieden, aangezien doelcellen vooral blootgesteld gedurende de spermatocyte en spermatid fasen van spermatogenese (figuur 3). De cellen in deze fasen niet synthetiseren van DNA en geleidelijk verliezen hun capaciteit voor herstel van DNA 6 </ Sup>. Bovendien zou bemonstering cauda sperma op dit tijdstip niet mutaties optreden in spermatogonia en stamcellen detecteren. Zo is voor de integratie in de 28 + 3 design, de OECD richtlijn beveelt verzamelen kiemcellen van de testes. Deze gemengde populatie bevat cellen afgeleid van DNA-synthese en reparatie bedreven celtypen, waaronder stamcellen, en zijn blootgesteld door de meeste spermatogenetische fasen. Vanwege de gemengde aard van deze cellen, testes celanalysesysteem ofwel geen fase-specifieke informatie. Verder is er bezorgdheid dat de aanwezigheid van non-target cellen de waargenomen MF kunnen beïnvloeden (bijvoorbeeld vals positieve in geslachtscellen mutagene stof oproepen als gevolg van verontreiniging van gemuteerde somatische cellen, of verdunning van een gemuteerd kiemcel signaal van DNA-reparatie-deficiënte geslachtscellen) . Op dit moment is er onvoldoende gegevens om te concluderen of de resultaten van testes cellen bij 28 + 3 bieden dezelfde sensitiviteit en specificiteit van eens cauda sperma op latere tijdstippen. Ons laboratorium is momenteel te vergelijken geïnduceerde magnetische velden in de testes cellen en cauda sperma verzameld na diverse bemonsteringstijden om dit punt aan te pakken. We merken op dat de OESO-richtlijn stelt een alternatieve bemonstering tijd van 28 dagen voor langzaam delende weefsels zoals de lever, die ook geschikt is voor kiemcellen analyse kan zijn. Toch beschikbare gegevens nog steeds onvoldoende en we zijn momenteel niet in staat om een enkele experimentele opzet te bevelen voor de gelijktijdige analyse van somatische cellen en kiemcellen met behulp van de TGR mutation assay die wettelijk voorgeschreven proeven.
Een kenmerk van deze test die moet worden opgemerkt is dat mutatie gebeurtenissen worden beoordeeld op niet-transgene muizen. Er is voldoende bewijs dat het transgen reageert op milieu mutagene op dezelfde wijze als endogene genen 20. Bovendien, omdat de precieze oorsprong van onafhankelijke mutationele gebeurtenissen zijn moeilijk telossen, worden de resultaten meestal vermeld als een mutant frequentie (in tegenstelling tot een mutatiefrequentie). De werkelijke mutatiefrequentie kan worden opgelost als resultaat gecorrigeerd voor klonale expansie (dwz. De delen en vermenigvuldigen van een gemuteerde cel die kan bijdragen aan de waargenomen frequentie van transgene mutanten) door DNA sequentiebepaling. Sequencing van de gemuteerde transgenen kunnen worden uitgevoerd om het lacZ mutaties karakteriseren en identificeren van mutanten die kunnen worden afgeleid van klonale expansie gebeurtenissen, hoewel dit aanzienlijk bij tot de tijd en kosten van de analyse. Naast het lacZ gen theλgt10 transgene vector herbergt alternatief temperatuurafhankelijke mutatie-reportergen: een variant van de λ cII gen dat korter (294 bp tov het 3021 bp lacZ, figuur 1) en gemakkelijker sequentie 29. Sequencing maakt ook de analyse van de geïnduceerde mutatie spectrum, die inzicht geven in de mutatiointerne mechanisme van de verbinding in kwestie. Een extreem voorbeeld van klonale expansie het optreden van een "jackpot" mutatie (dwz., Transgen mutaties in een zeer vroeg stadium van ontwikkeling een orgaan dat bijdraagt tot een drastisch verhoogde MF, soms honderden tot duizenden malen groter dan de achtergrond). Dieren of weefsels met een "jackpot" mutatie moet worden verwijderd uit de analyse.
De test die we hebben beschreven is breed toepasbaar op andere TGR modellen zoals de BigBlue muis en rat en de lacZ plasmide muis, die haven soortgelijke mutatie reportervectoren (besproken in 20). De overgrote meerderheid van de kiemcel tot dusver verrichte onderzoek dat gelijkaardige methoden gebruiken, hebben zich gericht vrijwel uitsluitend op goed gekarakteriseerd mutagene agentia, zoals ENU en straling (beoordeeld in 30). De verwachting is dat met de recente vrijlating van de OESO-richtlijnen voor de TGR assay, zal deze test wordensteeds populairder voor chemische screening en regelgeving evalueren. Incorporatie van de TGR kiemcel mutatie proef tot een regelgevend testen batterij zal de bestaande leemte op te vullen door het toelaat een efficiënte beoordeling van de mutatie-inductie in kiemcellen 11. Bovendien kan deze bepaling worden gebruikt MF meten vrijwel elk weefsel, die een geschikt middel voor het vergelijken van de relatieve gevoeligheden van somatische cellen en zaadcellen bij de inductie van mutaties door milieufactoren agentia op identieke genetische eindpunten.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was funded by the Canadian Regulatory System for Biotechnology (CRSB) and Chemicals Management Plan (CMP) initiatives.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| MutaMouse | Covance | – | |
| E.coli (lacZ–/galE–) | Covance | – | See reference 25 in manuscript |
| Chloroform | Caledon | 3001-2-40 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (D-PBS) | Gibco | 14190-250 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), 0.5M, pH 8 | Sigma-Aldrich | 03690 FLUKA | |
| Isoamyl alcohol | Caledon | 2/10/7900 | |
| Lennon LB broth base | Invitrogen | 12780-029 | |
| Stainless steel mesh filter | Sigma-Aldrich | S3770 | |
| Transpack packaging extract | Agilent Technologies | 200220 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Ethyl alcohol, anhydrous (EtOH) | Commercial Alcohols | – | |
| Ampicilin | Gibco | 11593-027 | prepare 20 mg/ml in dH2O |
| Kanamycin | Gibco | 11815-024 | prepare 5 mg/ml in dH2O |
| Phenol | Invitrogen | 15509-097 | Saturate in 0.1 M Tris-HCl as per manufacturers direction |
| Phenyl-β-D-galactopyranoside (P-Gal) | Sigma-Aldrich | P6501 | dissolve 3 g per 10 ml of dimethylformamide |
| Proteinase K | Invitrogen | 25530-031 | prepare 60 mg/ml solution dH2O just before use, 20 µl per sample |
| Sodium acetate (NaAc) | Fisher Scientific | BP333-500 | prepare 3M solutution, pH 5.2 |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L4390 | prepare 10% solution in dH2O |
| 1 M MgSO4 | 24.6 g MgSO4·7H2O per 100 ml dH2O, autoclave, store at room temperature up to 1 year | ||
| 20% maltose solution | 20.0 g maltose, 24.6 g MgSO4·7H2O, per 100 ml dH2O, filter sterilize, sore at 4ᵒC up to 6 months | ||
| Bottom agar | Prepare 64 ml per sample (8 pitri plates per sample X 8 ml per plate): 5.0 g LB base, 6.4 g NaCl, 7.5 g agar, per 1L dH2O. Autoclave and cool to 50ᵒC before pouring into Petri plates | ||
| LB Broth | 5.0 g LB base, 6.4 g NaCl per 1L dH2O. Autoclave and cool | ||
| Saline sodium citrate (SSC) | 150 mM NaCl, 15 mM trisodium citrate, pH 7.0 | ||
| SM Buffer | 5.8 g NaCl, 2.0 g MgSO4·7H2O, 50 ml 1 M Tris-HCl (pH 7.5), 5.0 ml of gelatin (2% w/v), per 1L dH2O, autoclave, store at room temperature up to 1 year | ||
| TE buffer | 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8 | ||
| Top agar, mutant plates | Prepare 32 ml per sample (4 mutant plates per sample X 8 ml per plate): 5.0 g LB base, 6.4 g NaCl, 7.5 g agar, per 1L dH2O. Autoclave and cool to 50ᵒC. Add MgSO4 to 10 mM | ||
| Top agar, titre plates | Prepare 32 ml per sample (4 mutant plates per sample X 8 ml per plate): 5.0 g LB base, 6.4 g NaCl, 7.5 g agar, per 1L H2O. Autoclave and cool to 50ᵒC. Add MgSO4 to 10 mM and P-Gal to 3 g/L |
References
- Ahmadi, A., Ng, S. C. Fertilizing ability of DNA-damaged spermatozoa. J. Exp. Zool. 284 (6), 696-704 (1999).
- Crow, J. F. The origins, patterns and implications of human spontaneous mutation. Nat. Rev. Genet. 1 (1), 40-47 (2000).
- Nelson, K., Holmes, L. B. Malformations due to presumed spontaneous mutations in newborn infants. N. Engl. J. Med. 320 (1), 19-23 (1989).
- Kong, A., et al. Rate of de novo mutations and the importance of father’s age to disease risk. Nature. 488 (7412), 471-475 (2012).
- Michaelson, J. J., et al. Whole-genome sequencing in autism identifies hot spots for de novo germline mutation. Cell. 151 (7), 1431-1442 (2012).
- Marchetti, F., Wyrobek, A. J. DNA repair decline during mouse spermiogenesis results in the accumulation of heritable DNA damage. DNA Repair (Amst). 7 (4), 572-581 (2008).
- Marchetti, F., Wyrobek, A. J. Mechanisms and consequences of paternally-transmitted chromosomal abnormalities. Birth Defects Res. C. Embryo. Today. 75 (2), 112-129 (2005).
- Demarini, D. M. Declaring the existence of human germ-cell mutagens. Environ. Mol. Mutagen. 53 (3), 166-172 (2012).
- Epstein, S. S. Use of the dominant-lethal test to detect genetic activity of environmental chemicals. Environ. Health. Perspect. 6, 23-26 (1973).
- Russell, W. L. X-ray-induced mutations in mice. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 16, 327-336 (1951).
- Singer, T. M., Yauk, C. L. Germ cell mutagens: Risk assessment challenges in the 21st century. Environ. Mol. Mutagen. 51 (8-9), 919-928 (2010).
- Tareke, E., Rydberg, P., Karlsson, P., Eriksson, S., Tornqvist, M. Acrylamide: A cooking carcinogen. Chem. Res. Toxicol. 13 (6), 517-522 (2000).
- Witt, K. L., et al. Mouse bone marrow micronucleus test results do not predict the germ cell mutagenicity of N-hydroxymethylacrylamide in the mouse dominant lethal assay. Environ. Mol. Mutagen. 41 (2), 111-120 (2003).
- Marchetti, F., Rowan-Carroll, A., Williams, A., Polyzos, A., Berndt-Weis, M. L., Yauk, C. L. Sidestream tobacco smoke is a male germ cell mutagen. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (31), 12811-12814 (2011).
- Yauk, C. L., Dubrova, Y. E., Grant, G. R., Jeffreys, A. J. A novel single molecule analysis of spontaneous and radiation-induced mutation at a mouse tandem repeat locus. Mutat. Res. 500 (1-2), 147-156 (2002).
- Niwa, O. Indirect mechanisms of genomic instability and the biological significance of mutations at tandem repeat loci. Mutat. Res. 598 (1-2), 61-72 (2006).
- Campbell, C. D., et al. Estimating the human mutation rate using autozygosity in a founder population. Nat. Genet. 44 (11), 1277-1281 (2012).
- Beal, M. A., Glenn, T. C., Somers, C. M. Whole genome sequencing for quantifying germline mutation frequency in humans and model species: Cautious optimism. Mutat. Res. 750 (2), 96-106 (2012).
- Shwed, P. S., Crosthwait, J., Douglas, G. R., Seligy, V. L. Characterisation of MutaMouse lambdagt10-lacZ transgene: Evidence for in vivo rearrangements. Mutagenesis. 25 (6), 609-616 (2010).
- Lambert, I. B., Singer, T. M., Boucher, S. E., Douglas, G. R. Detailed review of transgenic rodent mutation assays. Mutat. Res. 590 (1-3), 1-280 (2005).
- OECD. . OECD Guideline for the testing of chemicals: Transgenic rodent somatic and germ cell gene mutation assays. , (2011).
- Rodriguez, M., Panda, B. B., Ficsor, G. Testes weight reflect ethylnitrosourea induced histopathology in mice. Toxicol. Lett. 17 (1-2), 77-80 (1983).
- Russell, L. B. Effects of male germ-cell stage on the frequency, nature, and spectrum of induced specific-locus mutations in the mouse. Genetica. 122 (1), 25-36 (2004).
- Duselis, A. R., Vrana, P. B. Harvesting sperm and artificial insemination of mice. J. Vis. Exp. (3), 184 (2007).
- Gossen, J. A., Molijn, A. C., Douglas, G. R., Vijg, J. Application of galactose-sensitive E. coli strains as selective hosts for LacZ- plasmids. Nucleic Acids Res. 20 (12), 3254 (1992).
- Lemieux, C. L., et al. Simultaneous measurement of benzo[a]pyrene-induced pig-a and lacZ mutations, micronuclei and DNA adducts in muta mouse. Environ. Mol. Mutagen. 52 (9), 756-765 (2011).
- Douglas, G. R., Jiao, J., Gingerich, J. D., Gossen, J. A., Soper, L. M. Temporal and molecular characteristics of mutations induced by ethylnitrosourea in germ cells isolated from seminiferous tubules and in spermatozoa of lacZ transgenic mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92 (16), 7485-7489 (1995).
- Russell, W. L., Hunsicker, P. R., Raymer, G. D., Steele, M. H., Stelzner, K. F., Thompson, H. M. Dose–response curve for ethylnitrosourea-induced specific-locus mutations in mouse spermatogonia. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79 (11), 3589-3591 (1982).
- Swiger, R. R., Cosentino, L., Shima, N., Bielas, J. H., Cruz-Munoz, W., Heddle, J. A. The cII locus in the MutaMouse system. Environ. Mol. Mutagen. 34 (2-3), 201-207 (1999).
- Singer, T. M., Lambert, I. B., Williams, A., Douglas, G. R., Yauk, C. L. Detection of induced male germline mutation: Correlations and comparisons between traditional germline mutation assays, transgenic rodent assays and expanded simple tandem repeat instability assays. Mutat. Res. 598 (1-2), 164-193 (2006).
