المعدلة وراثيا القوارض الفحص لقياس ذكر جرثومة خلية متحولة التردد
Summary
De novo mutations in the male germline may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Here we describe a protocol for the use of a transgenic rodent model for quantifying mutations in male germ cells induced by environmental agents.
Abstract
De novo mutations arise mostly in the male germline and may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Traditional methods for assessing the induction of germ cell mutations require the use of large numbers of animals, making them impractical. As such, germ cell mutagenicity is rarely assessed during chemical testing and risk assessment. Herein, we describe an in vivo male germ cell mutation assay using a transgenic rodent model that is based on a recently approved Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD) test guideline. This method uses an in vitro positive selection assay to measure in vivo mutations induced in a transgenic λgt10 vector bearing a reporter gene directly in the germ cells of exposed males. We further describe how the detection of mutations in the transgene recovered from germ cells can be used to characterize the stage-specific sensitivity of the various spermatogenic cell types to mutagen exposure by controlling three experimental parameters: the duration of exposure (administration time), the time between exposure and sample collection (sampling time), and the cell population collected for analysis. Because a large number of germ cells can be assayed from a single male, this method has superior sensitivity compared with traditional methods, requires fewer animals and therefore much less time and resources.
Introduction
الطفرات الحمض النووي متفرقة في سلالة الجرثومية يمكن أن يؤدي إلى انخفاض النجاح التناسلي، وإذا ورثت، قد تسبب مرض وراثي أو استعداد لتزايد سرطان في النسل 1-3. يوضح أدلة قوية على أن نسبة كبيرة من دي نوفو طفرات موروثة من سلالة الجرثومية الأب 4، وأن عدد من الطفرات في النسل يرتبط ارتباطا إيجابيا مع سن الأب في وقت الحمل 5. ويعتقد أن نسبة أعلى من الذكور الطفرات أن تكون نتيجة للفارق في السن أثناء عملية تكوين الأمشاج بين الجنسين، وعدد أكبر من انقسامات الخلية المنوية بالمقارنة مع عدد من انقسامات الخلية oogenic في سلالة الجرثومية الإناث 2، والانخفاض التدريجي في DNA إصلاح الكفاءة مع التقدم في السن عند الذكور. كل هذه العوامل تساهم في زيادة احتمال من أخطاء النسخ المتماثل في سلالة الجرثومية الذكور 6. ومع ذلك، فإن تأثير التعرض الأب إلى بيئىالعوامل nmental على وتيرة دي نوفو الطفرات لا تزال غير مؤكدة. ومع ذلك، ومن المعروف أن عددا كبيرا من العوامل البيئية للحث على الطفرات الخلية الجرثومية في 7 القوارض، وهناك أدلة متزايدة على أن بعض هذه العوامل يمكن أن تؤثر أيضا على سلالة الجرثومية الإنسان 8. على الرغم من هذه المخاوف، ويتم اختبار المواد الكيميائية بشكل روتيني لقدرتها على إحداث الطفرات في الخلايا الجسمية لأغراض تنظيمية ويفترض عموما أن اختبارات جسدية كافية لحماية سلالة الجرثومية. لذا، نادرا ما يتم فقط بتقييم المواد الكيميائية لقدرتها على إحداث الطفرات الخلية الجرثومية.
وقد سبب واحد اختبار طفرات الخلية الجرثومية أغفل إلى حد كبير من عملية صنع القرار التنظيمية هو عدم وجود منهجيات عملية. الأساليب التقليدية القائمة على القوارض، مثل المهيمنة قاتلة 9 و 10 محددة موضع الاختبارات، وتقدر معدلات طفرة الخلية الجرثومية بتسجيله الظواهر متحولة في الأجنة أو ذريةالآباء المكشوفة. هذه المقايسات تتطلب استخدام عدد كبير جدا من الحيوانات والوقت والموارد للحصول على نتائج ذات مغزى إحصائيا.
على الرغم من أن العديد من الطرق الحديثة لقياس طفرة الخلية الجرثومية ظهرت مؤخرا، ويعاني العديد القصور من حيث التطبيق العملي، والكفاءة، وأهميتها البيولوجية. على سبيل المثال، تكرار الطفرات في توسيع طول تكرار جنبا إلى جنب بسيط (ESTR) مواضع يمكن قياسها كميا في الخلايا التناسلية الذكرية باستخدام جزيء واحد PCR النهج 15. ومع ذلك، يمكن تنفيذ هذه الطريقة أن يكون تحديا فنيا وشاقة، وعلى عكس الطفرات نقطة، والأهمية البيولوجية والصحية للتغيرات في طول تكرار ESTR مواضع غير مستقر للغاية لا تزال غير واضحة 16. يمكن للتكنولوجيات الحديثة تسلسل الجينوم كله توفر ثروة من البيانات ذات مغزى من الناحية البيولوجية عند تطبيقها على مشكلة الطفرات الوراثية 4،17، ولكن التكلفة عالية، ومعدلات خطأ عالية، والمصادقة المرتبطة مطلوبةلتأكيد الطفرات، والمعلوماتية الحيوية التحديات لا تزال تحد من التطبيق الروتيني لهذا الخيار في اختبار القدرات التنظيمية 18.
هنا، نحن تصف طريقة عملية لقياس الطفرات المستحثة مباشرة في الخلايا التناسلية للذكور الفئران المعدلة وراثيا. يوصف هذا البروتوكول لنموذج MutaMouse المعدلة وراثيا، التي لديها نسخ متسلسلة متعددة من المؤتلف ناقلات λgt10 فج تحتوي على الجين مراسل القولونية lacZ دمجها في كلا نسخ من كروموسوم 19 3 (الشكل 1).
هذا البروتوكول وثيقة الصلة أيضا القوارض المعدلة وراثيا (TGR) نماذج أخرى تقوم على نفس المبادئ (BigBlue الفأر والجرذ، أو lacZ بلازميد الماوس، الخ) أو الجينات مراسل مختلفة قليلا (GPT الماوس الدلتا والفئران، ونماذج TGR في تاريخ لامبرت وآخرون ال 20). ويستند هذا الأسلوب على الفحص طفرة TGR صفها في صدر مؤخراوالمنقحة OECD اختبار التوجيهي 21 ونحن على وضع الاعتبارات الخاصة المطلوبة لاستيعاب تقييم طفرات في سلالة الجرثومية الذكور بسبب الخصائص الفريدة من الحيوانات المنوية. لفترة وجيزة، وفحص يشمل تعريض الفئران الذكور المعدلة وراثيا إلى مادة مطفرة، تليها وقت أخذ العينات حيث يتم إصلاحها الآفات ما قبل طفرية في الطفرات مستقرة. في ذلك الوقت أخذ العينات المختارة، يصرح باستخدامها الفئران وتجمع الخلايا الجرثومية من أي ذيل البربخ أو الأنابيب المنوية. كما هو مبين أدناه، والآثار المطفرة في مراحل مختلفة من الحيوانات المنوية يمكن تحديدها عن طريق تحديد الوقت بين التعرض وجمع العينات. إدراج المعدلة وراثيا، التي تضم نسخ متعددة من جينوم λ فج لكل خلية، يتم عزل الحمض النووي الجيني من الخلايا الجرثومية وتعبئتها في فارغة capsids فج λ λ المعدية خلق جزيئات الفيروس التي تستخدم بعد ذلك لتصيب E. المضيف القولونية. وتزرع البكتيريا المصابة على SELECوسائل الإعلام TIVE يمكن أن تميز الخلايا التي تحتوي على ناقل بنسخة من lacZ تحور من خلايا إيواء البرية من نوع lacZ. يتم تحديد تأثير طفرات التعرض على الذكور سلالة الجرثومية بمقارنة تواتر الجينات المحورة متحولة بين السيطرة والفئران التي عولجت (الشكل 2، استعرض في لامبرت وآخرون 20). يمكن أن يعاير عدد كبير من الخلايا الجرثومية من ماوس واحدة، وإعطاء هذه الحساسية الفائقة الفحص على الطرق التقليدية، مع تقليل عدد الحيوانات اللازمة. ولأن مطلوب أي معدات متخصصة أو التدريب، ويوفر هذا الاختبار خيارا عمليا وكفاءة الخلية الجرثومية لاختبار تحور في معظم مختبرات البيولوجيا الجزيئية وعلم السموم / الحديثة.
أحد المتطلبات الأساسية لتطبيق الفعال للTGR طفرة الخلية الجرثومية الاختبار هو فهم دورة المنوية (الشكل 3). الوقت للخلايا الجرثومية الماوس على التقدم من شارعم في خلايا الأنابيب المنوية لأمهات المني، الخلايا المنوية، spermatids، وأخيرا إلى أن تنضج الحيوانات المنوية في البربخ (أي الحيوانات المنوية) ما يقرب من 49 يوما. يمكن أن تحدث طفرة في مختلف مراحل هذه الدورة وغالبا ما تكون محددة مركب. اثنين من السمات الرئيسية التي هي ذات أهمية خاصة لالطفرات في الخلايا التناسلية الذكرية هي وقف توليف الحمض النووي خلال الانقسام المنصف في وقت مبكر، والفقدان التدريجي للقدرة إصلاح الحمض النووي 6 في أواخر مرحلة ما بعد الانقسام المنصف، واثنين من العمليات التي مطلوبة من أجل تحريض وتثبيت لل معظم الطفرات.
بسبب هذه الخصائص الفريدة من الحيوانات المنوية، وهناك ثلاثة متغيرات تجريبية حاسمة لسير TGR طفرة الخلية الجرثومية الفحص: (1) إدارة الوقت مركب الاختبار؛ (2) وقت أخذ العينات. و (3) اختيار من السكان الخلية الجرثومية لجمع لتحليل (الشكل 3 والجدول 1). إدارة الوقت هو experimeمتغير ntal التي تحدد كيفية تتعرض الخلايا المستهدفة طويلة لمركبات الاختبار. ويمكن أيضا طول الوقت إدارة أن تستخدم لاستهداف التعرض لأنواع معينة من الخلايا أو مراحل تكوين الحيوانات المنوية. على سبيل المثال، يمكن أن تستخدم إدارة يوم واحد لتحديد الآثار المترتبة على التعرض الحاد على واحد نوع من الخلايا معين. وبالمثل، يمكن أن تركز التعرض لمرحلة المنوية بأكملها، على سبيل المثال من خلال استهداف الخلايا المنوية فقط تقسيم meiotically، أو تقسيم ميتوتيكلي أمهات المني باستخدام إدارة الوقت 2 الاسبوع والوقت المناسب لأخذ العينات. وتستخدم مرة الادارة المزمنة وشبه المزمنة لتقييم آثار التعرض على المدى الطويل، لضمان التوزيع الدوائية كاف من مجمع الاختبار، أو السماح تراكم كاف من الطفرات من المطفرة ضعيفة (على سبيل المثال إدارة الوقت 28 يوم أوصى في اختبار OECD التوجيهي).
وقت أخذ العينات هو المتغير الحاسم لتحديد الذيكانت مرحلة من مراحل تكوين الحيوانات المنوية الخلايا المستهدفة في وقت التعرض. الوقت أخذ العينات يملي كيف الكثير من الوقت، وبالتالي مدى أبعد على طول دورة المنوية، والخلايا تمر بعد التعرض. على سبيل المثال، للتحقيق في الآثار أمهات المني الخلايا الجذعية، وهو وقت أخذ العينات> 49 يوما مطلوب إذا جمع الحيوانات المنوية نضجت تماما، أو> 42 يوما إذا جمع الخلايا الجرثومية غير ناضجة من الأنابيب المنوية، لضمان أن جميع الخلايا التي تم جمعها وكان الوقت كافيا ل تطوير يتعرض ينبع من الخلايا. من المهم أن نلاحظ أن وقت أخذ العينات من 70 يوما على الأقل يكون من الأفضل لكى يبرهن على وجود تأثير الخلايا الجذعية وفيا لتوفير الوقت الكافي لتوزيعها الدوائية من السموم، للقضاء على الخلايا المعرضة في مراحل لاحقة من الحيوانات المنوية، وتمثل فترة العقم المؤقت التي قد تحدث ~ 6 أسابيع بعد التعرض للمركبات مطفرة غاية 22. وبالمثل، فإن وقت أخذ العينات من 21 يوما ضمان كولي الحيوانات المنويةأن المديرية التنفيذية من ذيل البربخ قد أكملت للتو الانقسام المنصف في اليوم الأخير من التعرض.
الخلايا الجرثومية يمكن جمعها لتصبح حيوانات منوية ناضجة من ذيل البربخ، أو على شكل مزيج من مختلف أنواع الخلايا المنوية من الأنابيب المنوية. تبقى الحيوانات المنوية الناضجة في ذيل ل~ 3 أيام، مما يجعل من الممكن لتحديد بدقة نسبية نوع من الخلايا أو مرحلة من مراحل تكوين الحيوانات المنوية من الحيوانات المنوية التي نشأت عن أي تصميم تجريبي معين. وهكذا، وتحليل تصاريح الحيوانات المنوية ذيل استهدفت غاية التحقيقات في مرحلة معينة آثار طفرية. من ناحية أخرى، تعليق خلية تم جمعها من الأنابيب المنوية تحتوي على مزيج من مختلف أنواع الخلايا الجرثومية في مراحل مختلفة من التنمية، وبالتالي توفر قرار فقرا المرحلة المنوية التي نشأت الطفرات. بالإضافة إلى ذلك، تعليق خلية تعافى من الأنابيب المنوية تميل لاحتواء التمثيل على من spermatids، تليها الخلايا المنوية، والاصدارذ القليلة أمهات المني والخلايا الجذعية (يتم تمثيل هذه النسب عن طريق أشرطة بيضاء تخرج في الشكل 3). وعلاوة على ذلك، تعليق أعدت من الأنابيب المنوية قد تحتوي أيضا على خلايا جسدية مختلفة. وهكذا، وذلك لأن العديد من أنواع الخلايا موجودة، آثار طفرية يمكن أن تتأثر مجموعة متنوعة من الخلايا غير المستهدفة. ومع ذلك، وجمع عينات من الأنابيب المنوية يوفر خيارا اقتصاديا لفحص في وقت واحد أنواع الخلايا الجرثومية متعددة، والتكامل السهل تحليل الخلية الجرثومية في معيار OECD بروتوكول اختبار للطفرة الجسدية.
أن أكرر، اعتمادا على احتياجات المحقق، إدارة الوقت، والوقت أخذ العينات والسكان الخلية التي تم جمعها يمكن تعديلها لاستجواب آثار التعرض في مختلف أنواع الخلايا، وفي مختلف مراحل تكوين الحيوانات المنوية. عن طريق اختيار بعناية هذه المتغيرات، ويمكن تصميم التجارب للدراسات الآلية المستهدفة، أو لاختبار تنظيمي أكثر المعممأغراض جي.
لتحقيق الكفاءة في الفحص، من المستحسن استخدام لتناوله عن طريق الفم الحادة من 100 ملغ / كغ N-إيثيل-N-نتروزويوريا (ENU)، تليها 70 يوما وقت أخذ العينات ومراقبة إيجابية. تحليل ذيل الحيوانات المنوية وبالتالي يستهدف الخلايا الجذعية النطفة (الشكل 3)، والتي تظهر عادة 4-5 أضعاف الزيادة في وتيرة متحولة (MF) أكثر من الضوابط التالية هذه الجرعة العالية من ENU المطفرة. تجدر الإشارة إلى أن هذه الجرعة هو معروف للحث على العقم 6 أسابيع بعد التعرض، وبالتالي قد لا يكون جرعة تحكم مناسبة لأخذ العينات أقصر الأوقات. هذه الجرعة سوف تنتج أيضا زيادة في كشف MF في معظم الأنسجة الجسدية 20. تم إنشاء نتائج ممثلة الواردة أدناه بعد التعرض الحاد +70 باستخدام نظام ثلاث جرعات من ENU وبما يصل إلى 100 ملغ / كغ.
Protocol
Representative Results
Discussion
بالمقارنة مع الأساليب التقليدية، يوفر TGR طفرة الخلية الجرثومية فحص وسيلة أسرع وأكثر اقتصادية، وأكثر حساسية لقياس يسببها في الجسم الحي الطفرات الخلية الجرثومية. من خلال تقييم التحوير MF مباشرة في الحيوانات المنوية، على عكس ذرية، وعدد من الحيوانات، يتم تقليل الوقت والموارد اللازمة لتقييم الطفرات الجرثومية في أي مجمع واحد كبير. من حيث الحساسية، تمكنا من الكشف عن زيادة كبيرة 2.6 أضعاف في الخلايا الجذعية أمهات المني MF بعد التعرض إلى 25 مغ / كغ ENU فقط باستخدام 5 حيوانات لكل مجموعة الجرعة. في المقابل، لم يتمكن من اكتشاف أي تغيير كبير في MF عند هذه الجرعة نفسها باستخدام> 3،000 الفئران في المجموعة المكشوفة و> 500،000 السيطرة على الفئران 28 فحص موضع معين.
بالإضافة إلى ملاءمتها لكلا التحقيقات الميكانيكية والتنظيمية، وهذه الطريقة توفر فرصة لإجراء دراسات مقارنة بين جسدية والجرثومية خط mutatiعلى أسعار الفائدة. وتشير الأدلة الحديثة إلى أن بعض وكلاء قد يسببها الطفرات الخلية الجرثومية في أقل تركيز من المطلوب للطفرة الجسدية. على سبيل المثال، التعرض لفترات طويلة لN-hydroxymethylacrylamide، وهو المستقلب من الأكريلاميد مادة مسرطنة الغذاء 12، ويزيد من وتيرة المهيمنة قاتلة الطفرات الخلية الجرثومية في الفئران دون التأثير على تردد النواة الصغرى في خلايا الدم الحمراء، وهو مقياس تقليدي من خلية جسدية الضرر الوراثي الخلوي 13. بالإضافة إلى ذلك، تعرض الفئران لكلا الترددات طفرة التيار الرئيسي والجانبي التبغ يسبب الدخان ترتفع في ترادف تكرار مواضع الحمض النووي في الحيوانات المنوية في الجرعات التي لا زيادة تردد النواة الصغرى الدم 14. هذه النتائج تتحدى الافتراض أن اختبار السمية الوراثية الجسدية هو دائما واقية من سلالة الجرثومية، وتعزز الطلب على وسيلة أكثر كفاءة وفعالية من حيث التكلفة لتحديد الجرثومة تردد طفرة الخلية. ومع ذلك، فإن الأدلة لتفضيلية المطفرة الخلية الجرثومية لا يزال ضعيفا، إلى حد كبير بسبب نقص البيانات المتوفرة لمقارنة معدلات طفرة في أنسجة الخلايا الجسدية والجرثومية. يسمح الطفرة فحص TGR اختبار مواز ومقارنة معدلات الطفرات المستحثة في أنسجة متعددة باستخدام نفس التحوير. وبالتالي، طفرة المقارنة اختبار باستخدام الفحص TGR من شأنه أن يساعد ملء الثغرات في البيانات المحيطة إمكانية آثار الخلية الجرثومية تفضيلية.
ان تقييم المتزامن لطفرة الخلية الجسدية والجرثومية لاختبار التنظيمي أيضا تحسين الكفاءة من خلال تقليل عدد الحيوانات اللازمة. المبادئ التوجيهية لمنظمة التعاون والتنمية طفرة جسدية يوصي وقت الإدارة 28 يوما، تليها فترة أخذ العينات لمدة ثلاثة أيام (28 + 3). تحليل ذيل الحيوانات المنوية قد تقدم الفقيرة حساسية عند هذه النقطة الزمن، لأنه يستهدف الخلايا المعرضة معظمها خلال خلية نطفية وspermatid مراحل تكوين الحيوانات المنوية (الشكل 3). الخلايا في هذه المراحل لا توليف الحمض النووي وتفقد تدريجيا قدرتها على إصلاح الحمض النووي 6 </ سوب>. وعلاوة على ذلك، فإن الحيوانات المنوية ذيل أخذ العينات عند هذه النقطة مرة تفشل في الكشف عن الطفرات التي تحدث في الخلايا الجذعية وأمهات المني. وهكذا، على الاندماج في تصميم 28 + 3، يوصي التوجيهي OECD جمع الخلايا الجرثومية من الأنابيب المنوية. يحتوي هذا يقطنها خليط سكاني الخلايا المشتقة من تخليق DNA وإصلاح يتقن أنواع الخلايا، بما فيها الخلايا الجذعية، وتتعرض في معظم مراحل المنوية. ولكن نظرا لطبيعة مختلطة من هذه الخلايا، الخلايا المنوية تحليل الأنابيب لا يقدم معلومات مرحلة محددة. وعلاوة على ذلك، هناك قلق من أن وجود خلايا غير المستهدفة يمكن أن تؤثر على MF احظ (مثل المكالمات إيجابية كاذبة المغير الخلية الجرثومية بسبب تلوث تحور الخلايا الجسدية، أو التخفيف من إشارة الخلية الجرثومية من تحور الخلايا الجرثومية إصلاح الحمض النووي التي تعاني من نقص) . هناك بيانات كافية لإبرام حاليا ما إذا كانت النتائج من خلايا الأنابيب المنوية عند 28 + 3 عرض نفس حساسية وخصوصية وق ذيل الحيوانات المنوية في نقاط زمنية لاحقة. لدينا مختبر ويقارن حاليا MFS يسببها في خلايا الأنابيب المنوية وذيل الحيوانات المنوية التي تم جمعها بعد أوقات لأخذ العينات المختلفة لمعالجة هذه النقطة. ونلاحظ أن المبدأ التوجيهي OECD يشير وقت أخذ العينات بديل من 28 يوما لتقسيم ببطء الأنسجة مثل الكبد التي قد تكون مناسبة أيضا لتحليل الخلية الجرثومية. ومع ذلك، فإن البيانات المتاحة لا يزال غير كاف ونحن غير قادرين حاليا على تصميم واحد يوصي تجريبي واحد في وقت واحد لتحليل الخلايا الجسدية والخلايا الجرثومية باستخدام فحص طفرة TGR للاختبار التنظيمي.
واحدة من سمات هذا الاختبار الذي وتجدر الإشارة أن يتم تقييم الأحداث طفرية على التحوير غير الفئران. ومع ذلك، هناك أدلة كثيرة تشير إلى أن التحوير يستجيب لالمطفرة البيئية بطريقة مشابهة لجينات الذاتية 20. بالإضافة إلى ذلك، لأن أصول دقيقة من الأحداث طفرية مستقلة يصعبحل، يتم الإبلاغ عن النتائج بصفة عامة تردد متحولة (على النقيض من تردد طفرة). يمكن حل تردد طفرة الفعلي إذا كان يتم تصحيح النتائج للتوسع نسيلي (أي الانقسام والتكاثر من الخلايا المتحولة واحدة يمكن أن تسهم في وتيرة الملحوظ من المسوخ التحوير) من خلال تسلسل الحمض النووي. تسلسل الجينات المحورة متحولة يمكن أداؤها لتوصيف الطفرات lacZ، وتحديد المسوخ التي قد تكون مستمدة من الأحداث التوسع نسيلي، على الرغم من أن هذا يضيف إلى حد كبير في الوقت والتكلفة من التحليل. بالإضافة إلى الجين lacZ، theλgt10 ناقلات المعدلة وراثيا والمرافئ التي تعتمد على درجة حرارة بديل تحور الجين مراسل-: البديل من الجين λ اخي، وهو أقصر (294 نقطة أساس في مقابل 3021 نقطة أساس lacZ، الشكل 1) وأسهل للتسلسل 29. تسلسل يسمح أيضا تحليل الطيف الطفرات المستحثة، وتوفير نظرة ثاقبة على mutatioآلية نال من المجمع المذكور. مثالا صارخا على التوسع النسيلي هو حدوث "بالجائزة الكبرى" الطفرة (أي.، والطفرات التحوير في مرحلة مبكرة جدا من التطور جهازا أن تسهم في MF مرتفعة بشكل كبير، وأحيانا مئات الآلاف من المرات أكبر من الخلفية). يجب إزالة أنسجة الحيوانات أو مع "بالجائزة الكبرى" طفرة من التحليل.
الفحص التي وصفناها ينطبق على نطاق واسع لنماذج TGR الأخرى مثل BigBlue الماوس والفئران، والبلازميد الماوس lacZ، والتي تؤوي مماثلة ناقلات مراسل طفرة (استعرضت في 20). الغالبية العظمى من الدراسات الخلية الجرثومية التي أجريت حتى الآن أن استخدام أساليب مماثلة ركزت المطفرة تتميز تقريبا حصرا على ما يرام مثل ENU والإشعاع (استعرضت في 30). ومن المتوقع أنه مع الإفراج مؤخرا عن اختبار OECD التوجيهي للمقايسة TGR، هذا الاختبار سيكونشعبية متزايدة للفحص الكيميائي والتقييم التنظيمي. سيتم إدراج TGR الخلية الجرثومية طفرة في فحص بطارية اختبار التنظيمية ملء الفجوة القائمة من خلال السماح تقييم كفاءة طفرة في تحريض الخلايا الجرثومية 11. وعلاوة على ذلك، هذا الاختبار يمكن أن تستخدم لقياس MF في أي نسيج تقريبا، وتوفير وسيلة مناسبة لمقارنة الحساسيات النسبية للخلايا الجسمية والخلايا الجرثومية في استحثاث الطفرات التي كتبها العوامل البيئية في النهاية جينية متطابقة.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was funded by the Canadian Regulatory System for Biotechnology (CRSB) and Chemicals Management Plan (CMP) initiatives.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| MutaMouse | Covance | – | |
| E.coli (lacZ–/galE–) | Covance | – | See reference 25 in manuscript |
| Chloroform | Caledon | 3001-2-40 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (D-PBS) | Gibco | 14190-250 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), 0.5M, pH 8 | Sigma-Aldrich | 03690 FLUKA | |
| Isoamyl alcohol | Caledon | 2/10/7900 | |
| Lennon LB broth base | Invitrogen | 12780-029 | |
| Stainless steel mesh filter | Sigma-Aldrich | S3770 | |
| Transpack packaging extract | Agilent Technologies | 200220 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Ethyl alcohol, anhydrous (EtOH) | Commercial Alcohols | – | |
| Ampicilin | Gibco | 11593-027 | prepare 20 mg/ml in dH2O |
| Kanamycin | Gibco | 11815-024 | prepare 5 mg/ml in dH2O |
| Phenol | Invitrogen | 15509-097 | Saturate in 0.1 M Tris-HCl as per manufacturers direction |
| Phenyl-β-D-galactopyranoside (P-Gal) | Sigma-Aldrich | P6501 | dissolve 3 g per 10 ml of dimethylformamide |
| Proteinase K | Invitrogen | 25530-031 | prepare 60 mg/ml solution dH2O just before use, 20 µl per sample |
| Sodium acetate (NaAc) | Fisher Scientific | BP333-500 | prepare 3M solutution, pH 5.2 |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L4390 | prepare 10% solution in dH2O |
| 1 M MgSO4 | 24.6 g MgSO4·7H2O per 100 ml dH2O, autoclave, store at room temperature up to 1 year | ||
| 20% maltose solution | 20.0 g maltose, 24.6 g MgSO4·7H2O, per 100 ml dH2O, filter sterilize, sore at 4ᵒC up to 6 months | ||
| Bottom agar | Prepare 64 ml per sample (8 pitri plates per sample X 8 ml per plate): 5.0 g LB base, 6.4 g NaCl, 7.5 g agar, per 1L dH2O. Autoclave and cool to 50ᵒC before pouring into Petri plates | ||
| LB Broth | 5.0 g LB base, 6.4 g NaCl per 1L dH2O. Autoclave and cool | ||
| Saline sodium citrate (SSC) | 150 mM NaCl, 15 mM trisodium citrate, pH 7.0 | ||
| SM Buffer | 5.8 g NaCl, 2.0 g MgSO4·7H2O, 50 ml 1 M Tris-HCl (pH 7.5), 5.0 ml of gelatin (2% w/v), per 1L dH2O, autoclave, store at room temperature up to 1 year | ||
| TE buffer | 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8 | ||
| Top agar, mutant plates | Prepare 32 ml per sample (4 mutant plates per sample X 8 ml per plate): 5.0 g LB base, 6.4 g NaCl, 7.5 g agar, per 1L dH2O. Autoclave and cool to 50ᵒC. Add MgSO4 to 10 mM | ||
| Top agar, titre plates | Prepare 32 ml per sample (4 mutant plates per sample X 8 ml per plate): 5.0 g LB base, 6.4 g NaCl, 7.5 g agar, per 1L H2O. Autoclave and cool to 50ᵒC. Add MgSO4 to 10 mM and P-Gal to 3 g/L |
References
- Ahmadi, A., Ng, S. C. Fertilizing ability of DNA-damaged spermatozoa. J. Exp. Zool. 284 (6), 696-704 (1999).
- Crow, J. F. The origins, patterns and implications of human spontaneous mutation. Nat. Rev. Genet. 1 (1), 40-47 (2000).
- Nelson, K., Holmes, L. B. Malformations due to presumed spontaneous mutations in newborn infants. N. Engl. J. Med. 320 (1), 19-23 (1989).
- Kong, A., et al. Rate of de novo mutations and the importance of father’s age to disease risk. Nature. 488 (7412), 471-475 (2012).
- Michaelson, J. J., et al. Whole-genome sequencing in autism identifies hot spots for de novo germline mutation. Cell. 151 (7), 1431-1442 (2012).
- Marchetti, F., Wyrobek, A. J. DNA repair decline during mouse spermiogenesis results in the accumulation of heritable DNA damage. DNA Repair (Amst). 7 (4), 572-581 (2008).
- Marchetti, F., Wyrobek, A. J. Mechanisms and consequences of paternally-transmitted chromosomal abnormalities. Birth Defects Res. C. Embryo. Today. 75 (2), 112-129 (2005).
- Demarini, D. M. Declaring the existence of human germ-cell mutagens. Environ. Mol. Mutagen. 53 (3), 166-172 (2012).
- Epstein, S. S. Use of the dominant-lethal test to detect genetic activity of environmental chemicals. Environ. Health. Perspect. 6, 23-26 (1973).
- Russell, W. L. X-ray-induced mutations in mice. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 16, 327-336 (1951).
- Singer, T. M., Yauk, C. L. Germ cell mutagens: Risk assessment challenges in the 21st century. Environ. Mol. Mutagen. 51 (8-9), 919-928 (2010).
- Tareke, E., Rydberg, P., Karlsson, P., Eriksson, S., Tornqvist, M. Acrylamide: A cooking carcinogen. Chem. Res. Toxicol. 13 (6), 517-522 (2000).
- Witt, K. L., et al. Mouse bone marrow micronucleus test results do not predict the germ cell mutagenicity of N-hydroxymethylacrylamide in the mouse dominant lethal assay. Environ. Mol. Mutagen. 41 (2), 111-120 (2003).
- Marchetti, F., Rowan-Carroll, A., Williams, A., Polyzos, A., Berndt-Weis, M. L., Yauk, C. L. Sidestream tobacco smoke is a male germ cell mutagen. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (31), 12811-12814 (2011).
- Yauk, C. L., Dubrova, Y. E., Grant, G. R., Jeffreys, A. J. A novel single molecule analysis of spontaneous and radiation-induced mutation at a mouse tandem repeat locus. Mutat. Res. 500 (1-2), 147-156 (2002).
- Niwa, O. Indirect mechanisms of genomic instability and the biological significance of mutations at tandem repeat loci. Mutat. Res. 598 (1-2), 61-72 (2006).
- Campbell, C. D., et al. Estimating the human mutation rate using autozygosity in a founder population. Nat. Genet. 44 (11), 1277-1281 (2012).
- Beal, M. A., Glenn, T. C., Somers, C. M. Whole genome sequencing for quantifying germline mutation frequency in humans and model species: Cautious optimism. Mutat. Res. 750 (2), 96-106 (2012).
- Shwed, P. S., Crosthwait, J., Douglas, G. R., Seligy, V. L. Characterisation of MutaMouse lambdagt10-lacZ transgene: Evidence for in vivo rearrangements. Mutagenesis. 25 (6), 609-616 (2010).
- Lambert, I. B., Singer, T. M., Boucher, S. E., Douglas, G. R. Detailed review of transgenic rodent mutation assays. Mutat. Res. 590 (1-3), 1-280 (2005).
- OECD. . OECD Guideline for the testing of chemicals: Transgenic rodent somatic and germ cell gene mutation assays. , (2011).
- Rodriguez, M., Panda, B. B., Ficsor, G. Testes weight reflect ethylnitrosourea induced histopathology in mice. Toxicol. Lett. 17 (1-2), 77-80 (1983).
- Russell, L. B. Effects of male germ-cell stage on the frequency, nature, and spectrum of induced specific-locus mutations in the mouse. Genetica. 122 (1), 25-36 (2004).
- Duselis, A. R., Vrana, P. B. Harvesting sperm and artificial insemination of mice. J. Vis. Exp. (3), 184 (2007).
- Gossen, J. A., Molijn, A. C., Douglas, G. R., Vijg, J. Application of galactose-sensitive E. coli strains as selective hosts for LacZ- plasmids. Nucleic Acids Res. 20 (12), 3254 (1992).
- Lemieux, C. L., et al. Simultaneous measurement of benzo[a]pyrene-induced pig-a and lacZ mutations, micronuclei and DNA adducts in muta mouse. Environ. Mol. Mutagen. 52 (9), 756-765 (2011).
- Douglas, G. R., Jiao, J., Gingerich, J. D., Gossen, J. A., Soper, L. M. Temporal and molecular characteristics of mutations induced by ethylnitrosourea in germ cells isolated from seminiferous tubules and in spermatozoa of lacZ transgenic mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92 (16), 7485-7489 (1995).
- Russell, W. L., Hunsicker, P. R., Raymer, G. D., Steele, M. H., Stelzner, K. F., Thompson, H. M. Dose–response curve for ethylnitrosourea-induced specific-locus mutations in mouse spermatogonia. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79 (11), 3589-3591 (1982).
- Swiger, R. R., Cosentino, L., Shima, N., Bielas, J. H., Cruz-Munoz, W., Heddle, J. A. The cII locus in the MutaMouse system. Environ. Mol. Mutagen. 34 (2-3), 201-207 (1999).
- Singer, T. M., Lambert, I. B., Williams, A., Douglas, G. R., Yauk, C. L. Detection of induced male germline mutation: Correlations and comparisons between traditional germline mutation assays, transgenic rodent assays and expanded simple tandem repeat instability assays. Mutat. Res. 598 (1-2), 164-193 (2006).
