Трансгенные грызунов Анализ на Количественная мужской половой клетки Частота мутантного
Summary
De novo mutations in the male germline may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Here we describe a protocol for the use of a transgenic rodent model for quantifying mutations in male germ cells induced by environmental agents.
Abstract
De novo mutations arise mostly in the male germline and may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Traditional methods for assessing the induction of germ cell mutations require the use of large numbers of animals, making them impractical. As such, germ cell mutagenicity is rarely assessed during chemical testing and risk assessment. Herein, we describe an in vivo male germ cell mutation assay using a transgenic rodent model that is based on a recently approved Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD) test guideline. This method uses an in vitro positive selection assay to measure in vivo mutations induced in a transgenic λgt10 vector bearing a reporter gene directly in the germ cells of exposed males. We further describe how the detection of mutations in the transgene recovered from germ cells can be used to characterize the stage-specific sensitivity of the various spermatogenic cell types to mutagen exposure by controlling three experimental parameters: the duration of exposure (administration time), the time between exposure and sample collection (sampling time), and the cell population collected for analysis. Because a large number of germ cells can be assayed from a single male, this method has superior sensitivity compared with traditional methods, requires fewer animals and therefore much less time and resources.
Introduction
Отдельные мутации ДНК в зародышевой линии может привести к снижению репродуктивного успеха и, если в наследство, может вызвать генетические заболевания или повышенное предрасположенности к раку у потомства 1-3. Имеются веские доказательства показывает, что большая часть De Novo мутаций наследуются от отцовской зародышевой линии 4, и что число мутаций у потомства положительно коррелирует с отцовской возраст на момент зачатия 5. Чем выше доля мужчин мутаций, как полагают, является результатом различий в возрасте во время гаметогенеза между полами, тем больше количество клеточных делений сперматогенных по сравнению с числом делений клеток oogenic в женской зародышевой линии 2, и прогрессирующее снижение ДНК ремонт эффективность с возрастом у мужчин. Все эти факторы способствуют увеличению вероятности ошибок репликации в мужской зародышевой линии 6. Тем не менее, влияние отцовской воздействия Environmental факторов на частоте De Novo мутаций остается неопределенным. Тем не менее, большое количество агентов окружающей среды, как известно, вызывают зародышевых клеток мутации у грызунов 7, и появляется все больше доказательств того, что некоторые из этих агентов также может влиять на человеческое зародышевой линии 8. Несмотря на эти проблемы, испытания химических веществ в плановом порядке для их способности индуцировать мутации в соматических клетках для целей регулирования и она, как предполагается, что соматические тесты достаточно для защиты зародышевой линии. Поэтому, химические вещества редко оценены по их способности индуцировать зародышевых клеток мутации.
Одна из причин зародышевых клеток мутагенность испытания в значительной степени исключены из процесса регулирования принятия решений является отсутствие практических методик. Традиционные методы грызунов основе, такие как доминантных летальных 9 и конкретных локус 10 тестов, оценить частота мутаций зародышевых клеток, забив мутантные фенотипы в эмбрионах или потомковоблученных родителей. Эти анализы требуют использования очень большого числа животных, времени и ресурсов, чтобы приобрести статистически значимые результаты.
Хотя несколько современных методов количественной мутации зародышевой клетке недавно появились, многие страдают недостатки с точки зрения их практичности, эффективности и биологической значимости. Например, повторить длины мутации в расширенном просто тандемного повтора (ПЭБТ) локусов может быть определена количественно в мужских половых клеток с использованием одной молекулы ПЦР подход 15. Тем не менее, выполнение этого метода может быть технически сложным и трудоемким, и в отличие от точечных мутаций, биологическая и здоровье значимость изменений в длине повторение того крайне нестабильной ПЭБТ локусов остаются неясными 16. Современные целые технологии секвенирования генома может обеспечить богатство биологически значимую данных при применении к проблеме наследственных мутаций 4,17, но высокая стоимость, высокие коэффициенты ошибок, требуется связано проверкидля подтверждения мутации, и биоинформатики проблемы по-прежнему ограничивают рутинную применение этой опции в регулирующего потенциала тестирования 18.
В данном случае мы описываем практичный способ количественного определения индуцированных мутаций непосредственно в половых клетках трансгенных мышей-самцов. Этот протокол описан для трансгенной модели MutaMouse, который имеет несколько сцепленных копий рекомбинантной λgt10 фага вектора, содержащего ген-репортер кишечная палочка LacZ интегрированный в обеих копиях хромосоме 3 19 (рисунок 1).
Этот протокол является также актуальны для других трансгенных грызунов (ТТГ) моделей, основанных на тех же принципах (BigBlue мышей и крыс, или LacZ плазмиды мыши, и т.д..) Или слегка различных генов-репортеров (GPT дельта мыши и крысы, модели TGR отзывы в Lambert др Al. 20). Этот метод основан на анализе мутации TGR, описанной в недавно опубликованноми пересмотренный руководящий принцип ОЭСР 21 и мы разрабатываем на специальных соображений, необходимых для размещения оценку мутаций в мужской зародышевой линии из уникальных характеристик сперматогенеза. Вкратце, анализ включает подвергая трансгенных мышей мужского пола в мутагенного вещества с последующим временем выборки, где предварительно мутационные повреждения фиксируются в стабильные мутаций. При выбранной времени выборки, мышей подвергали эвтаназии и зародышевые клетки собираются либо из конского придатка или семенных канальцев. Как обсуждается ниже, мутагенных эффектов на различных этапах сперматогенеза может быть определен путем выбора времени между воздействием и отбора проб. Трансгенные вставки, содержащие несколько копий λ генома фага на клетку, изолированы от зародышевых клеток геномной ДНК и упакованы в пустые λ-фага капсид, создающих инфекционные частицы λ фагов, которые затем используются для заразить E. палочка хозяин. Инфицированные бактерии выращивают на выбраннтивные СМИ, что можно выделить клетки, содержащие вектор с мутантным копии LacZ из клеток, несущих дикого типа LacZ. Мутагенный эффект воздействия на мужской зародышевой линии определяется путем сравнения частоты мутантных трансгенов между контрольных и обработанных мышей (рисунок 2, рассмотренных в Lambert и соавт. 20). Большое количество зародышевых клеток можно анализировать с одной мыши, что дает этот анализ высокую чувствительность по сравнению с традиционными методами, в то время как уменьшение количества животных, необходимых. И потому, что не требуется специальное оборудование или обучение, этот анализ представляет собой практическое и эффективное решение для тестирования зародышевых клеток мутации в большинстве современных токсикологии / молекулярных лабораторий биологии.
Одним из важнейших условий эффективного применения TGR мутации половых клеток анализа является понимание сперматогенного цикла (рисунок 3). Время для зародышевых клеток мыши, чтобы прогрессировать от улэм клетки в семенных канальцах в сперматогенов, сперматоцитах, сперматидах, и, наконец, чтобы созреть сперму в придатке яичка (т.е.. сперматогенез) составляет примерно 49 дней. Мутация может произойти в различных фазах этого цикла и часто соединение конкретных. Двумя основными характеристиками, которые имеют особое значение для мутагенеза в мужских половых клетках являются прекращение синтеза ДНК в начале мейоза, и прогрессирующая потеря репарации ДНК мощностью 6 в конце пост-мейоза, два процесса, которые необходимы для индукции и фиксации большинство мутаций.
Из этих уникальных характеристик сперматогенеза, есть три критических экспериментальные переменные для проведения TGR мутации половых клеток анализа: (1) времени администрация соединение испытание; (2) время выборки; и (3) Выбор зародышевых клеток населения собрать для анализа (рисунок 3 и в таблице 1). Время Администрация experimental переменная, которая определяет, как долго клетки-мишени подвергаются испытуемых соединений. Длина времени введения также могут быть использованы для целевой воздействия на специфические типы клеток или фаз сперматогенеза. Например, однократное введение день может быть использован для определения влияния острого воздействия на одном конкретном типе клеток. Точно так же, экспозиция может быть сосредоточено до целой сперматогенного фазе, например, таргетинг только мейотически разделительные сперматоциты или митотически деления сперматогоний использованием 2-недельный время администрирования и соответствующий времени выборки. Хронические и субхроническом раз администрирования используются для оценки последствий долгосрочного воздействия, чтобы обеспечить достаточное распределение фармакокинетический тестируемого соединения, или разрешать достаточное накопление мутаций от слабых мутагенов (например 28 день время администрация рекомендованный в тесте ОЭСР руководство).
Время выборки является критической переменной для определения, на которомфаза сперматогенеза клетки-мишени были в то время облучения. Время выборки определяет, как много времени, и, следовательно, насколько дальше по сперматогенного цикла, клетки проходят через после воздействия. Например, изучать эффекты, в стволовых клеток сперматогенов время выборки> 49 дней требуется, если сбор вполне назрел сперму, или> 42 дней, если сбор незрелых половых клеток из семенных канальцев, чтобы гарантировать, что все собранные клетки имели достаточно времени, чтобы развиваются из подвергается стебли клетки. Важно отметить, что время выборки, по меньшей мере, 70 дней было бы предпочтительно, чтобы продемонстрировать истинную эффект стволовых клеток, чтобы обеспечить достаточное время для распространения фармакокинетического в токсиканта, для устранения клеток, подвергнутых на более поздних этапах сперматогенеза, и для учета Период временного бесплодия, которые могут возникнуть ~ 6 недель после контакта с высокой мутагенных соединений 22. Аналогично, время выборки из 21 дней будет гарантировать, что спермы КоллеИДКТК из конского придатка бы только что завершили мейоза в последний день экспозиции.
Половые клетки могут быть собраны в зрелой спермы из конского придатка, или в виде смеси различных типов клеток сперматогенеза из семенных канальцах. Зрелые сперматозоиды остаются в конского для ~ 3 дней, что дает возможность определить с относительной точностью типа клеток или фазы сперматогенеза, из которых возник спермы для любого данного эксперимента. Таким образом, анализ разрешений спермы конского весьма целенаправленные исследования стадии конкретных мутаций эффектов. С другой стороны, клеточные суспензии, полученные из семенных канальцах содержать смесь различных типов зародышевых клеток в различных стадиях развития, и, таким образом, предлагает хуже разрешение сперматогенеза фазы, в которой возникла мутации. Кроме того, клеточные суспензии, выделенные из семенных канальцев, как правило, содержат по-представление сперматидах, а затем сперматоцитах и верУ некоторых сперматогенов и стволовых клеток (эти пропорции представлены закончили белых полос на рисунке 3). Кроме того, суспензии, приготовленные из семенных канальцах может также содержать различные соматические клетки. Таким образом, потому, что так много типов клетки присутствуют, мутационные эффекты могут зависеть от различных нецелевых клеток. Однако, собирая образцы из семенных канальцев предлагает экономичное решение для одновременно скрининга нескольких типов зародышевых клеток и легкую интеграцию анализа зародышевых клеток в стандартный протокол испытания ОЭСР соматической мутации.
Повторим, в зависимости от потребностей исследователя, времени введения, времени выборки и собранной клеточной популяции можно регулировать, чтобы опросить эффекты воздействия в различных типах клеток и на разных этапах сперматогенеза. Тщательно выбирая эти переменные, эксперименты могут быть разработаны для целевых механистических исследований, или для более обобщенного нормативного тестаЦЕЛЕЙ.
Для достижения мастерства в анализе, мы рекомендуем использовать острого перорального введения 100 мг / кг N-этил-N-нитрозомочевины (ЕНУ), за которым следует 70-дневного времени выборки в качестве положительного контроля. Анализ конского спермы, таким образом, нацелен сперматогониальные стволовые клетки (рисунок 3), которые обычно имеют 4-5 кратное увеличение мутант частоты (СЧ) по сравнению с контрольными следующую этом высоко мутагенного дозе ЕНУ. Следует отметить, что эта доза, как известно, вызывают стерильность 6 недель после облучения, таким образом, оно не может быть подходящая доза управления для сокращения времени отбора проб. Эта доза будет также получения выявляемой увеличение MF в большинстве соматических тканях 20. Представительные результаты, представленные ниже, были генерируется После острой +70 режима воздействия, используя три дозы ЕНУ вплоть до 100 мг / кг.
Protocol
Representative Results
Discussion
По сравнению с традиционными методами, TGR мутация половых клеток анализ обеспечивает более быстрый, более экономичные и более чувствительные способы количественной индуцированных в естественных мутаций зародышевых клеток. По оценке трансгена MF непосредственно в сперме, в отличие от потомство, количество животных, время и ресурсы, необходимые для оценки зародышевой линии мутагенность любого одного соединения значительно снижается. С точки зрения чувствительности, мы смогли обнаружить значительное 2,6 кратное увеличение сперматогониев стволовых клеток MF после воздействия 25 мг / кг ЕНУ, используя только 5 животных на группу дозы. В отличие от этого, конкретного локуса анализа не удалось обнаружить никаких существенных изменений в МФ в этой же дозе, используя> 3000 мышей в открытой группы и> 500 000 28 контрольных мышей.
В дополнение к его пригодности для обеих механистических и нормативных исследований, этот метод дает возможность сравнительных исследований между соматическими и зародышевой линии mutatiпо темпам. Последние данные свидетельствуют о том, что для некоторых агентов зародышевые мутации клеток может быть вызвана при более низкой концентрации, чем требуется для соматических мутаций. Например, длительное пребывание на N-hydroxymethylacrylamide, метаболит пищевой канцероген акриламид 12, увеличивает частоту доминантных летальных мутаций зародышевых клеток у мышей, не влияя на частоту микроядер в эритроцитах, традиционный меру соматических клеток цитогенетических повреждений 13. Кроме того, экспозиция мышей в обеих основного потока и побочного табачного дыма является причиной повышенных частотах мутации в тандемного повтора локусов ДНК в сперме в дозах, не увеличивающих микроядер крови частоту 14. Эти выводы оспорить предположение, что соматические тестирование генотоксичности всегда защищает зародышевой линии, и усилить спрос на более эффективных и экономичных средств для количественной частоты мутаций клеток зародышей. Тем не менее, доказательства льготных мутагенов зародышевых клеток по-прежнему слаб, В основном в связи с отсутствием доступных данных для сравнения частота мутаций в соматических и половых тканей клеток. TGR мутация анализ позволяет параллельное тестирование и сравнение индуцированных частоты мутаций в нескольких тканях, использующих тот же трансген. Таким образом, сравнительный мутация тестирования с использованием анализа TGR бы помочь заполнить пробелы в данных окружающие возможность льготных эффектов зародышевых клеток.
Одновременное оценка соматического и зародышей мутации клеток для нормативной тестирования будет также повысить эффективность за счет сокращения количества животных, необходимых. Руководящие принципы ОЭСР для соматической мутации рекомендует 28 день время на администрирование, а затем трехдневного времени выборки (28 + 3). Анализ конского спермы может предложить слабую чувствительность в этот момент времени, так как он нацелен на клетки подвергаются главным образом в течение сперматоцит и сперматид этапах сперматогенеза (рисунок 3). Клетки в этих фазах не синтезируют ДНК и постепенно теряют свою способность к репарации ДНК 6 </ SUP>. Кроме того, отбор проб конского спермы в этот момент времени не сможет обнаружить мутации, происходящие в сперматогенов и стволовых клеток. Таким образом, для интеграции в 28 + 3 дизайна, Руководящие принципы ОЭСР рекомендует собирать зародышевые клетки от семенных канальцев. Это смешанное население содержит клетки, полученные из синтез ДНК и ремонта опытным типов клеток, в том числе стволовых клеток, и подвергаются по большей части сперматогенных фаз. Тем не менее, в связи с смешанный характер этих клеток, семенных канальцах анализ клеток не дает информации фазы конкретного. Кроме того, есть опасения, что наличие нецелевых клеток может влиять на наблюдаемую MF (например ложноположительные зародышевых клеток мутагенные звонки за счет загрязнения мутировавших соматических клеток, или разбавления мутировал сигнала зародышевых клеток от ДНК ремонт-дефицитных половых клеток) . В настоящее время данных недостаточно для вывода о том, результаты семенных канальцев клеток в 28 + 3 предложению же чувствительность и специфичность вс конского сперма на более поздние моменты времени. Наша лаборатория в настоящее время по сравнению индуцированных МЖ в семенных канальцах клеток и конского спермы, собранных после различных времен выборки для решения этой точки. Отметим, что Руководящие принципы ОЭСР предлагает альтернативный время дискретизации 28 дней для медленно разделительных тканей, таких как печень, что может также быть пригодны для анализа зародышевых клеток. Тем не менее, имеющиеся данные по-прежнему недостаточно, и мы в настоящее время не в состоянии рекомендовать один единственный экспериментальный дизайн для одновременного анализа соматических клеток и половых клеток, используя мутация пробирного TGR для нормативной тестирования.
Одной из характерных черт этого анализа, которые необходимо отметить, что мутационные события оцениваются на не-мышиного трансгена. Тем не менее, имеется достаточно доказательств того, что трансгенная реагирует на мутагенов окружающей среды в аналогичным образом в эндогенных генов 20. Кроме того, так как точное происхождение из независимых мутаций труднорешить, результаты, как правило, представлены как мутантного частоты (в отличие от частоты мутаций). Фактическая частота мутаций может быть решена, если результаты с поправкой на клоновых расширения (т.е.. Разделения и умножения одной мутантной клетки, которые могут способствовать наблюдаемой частоты трансгенных мутантов) путем секвенирования ДНК. Секвенирование мутантных трансгенов может быть выполнена, чтобы охарактеризовать LacZ мутации и идентификации мутантов, которые могут быть получены из клональных событий расширения, хотя это значительно увеличивает время и стоимость анализа. В дополнение к гена LacZ, theλgt10 трансгенного вектора альтернативного таит в зависимости от температуры мутации гена-репортера: вариант гена λ CII, который короче, (294 п.н. против на 3021 п.о. LacZ, Рисунок 1) и проще в последовательности 29. Секвенирование также позволяет анализ спектра индуцированных мутаций, содержащие информацию в mutatioNAL механизм рассматриваемых соединений. Крайним примером клональной экспансии является появление "джекпот" мутации (т.е.., Трансгенные мутации в очень ранней стадии развития органа о том, что вносят вклад в резко повышенной MF, иногда от сотен до тысяч раз больше, чем фон). Животные или ткани с "джек-пот" мутации должны быть исключены из анализа.
Анализ, что мы описали широко применима к другим ТТГ моделей, таких как BigBlue мыши и крысы, и плазмиды мыши LacZ, все, которые несут подобные мутации репортерных векторов (обзор в 20). Подавляющее большинство исследований половых клеток проведенных на сегодняшний день, которые используют подобные методы были сосредоточены почти исключительно на хорошо характеризующиеся мутагенов, таких как ЕНУ и излучения (обзор 30). Ожидается, что с недавним выпуском тестового руководством ОЭСР для анализа TGR, этот анализ будетвсе более популярным для химической скрининга и нормативной оценки. Включение в TGR зародышевых клеток мутация пробирного в нормативно тестирования батареи заполнит существующий пробел, позволяя эффективно оценку индуцирования мутаций в половых клетках 11. Кроме того, этот анализ может быть использован для измерения MF практически в любой ткани, что обеспечивает подходящие средства для сравнения относительной чувствительности соматических клеток и половых клеток к индукции мутаций факторов окружающей среды при одинаковых генетических конечных точек.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was funded by the Canadian Regulatory System for Biotechnology (CRSB) and Chemicals Management Plan (CMP) initiatives.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| MutaMouse | Covance | – | |
| E.coli (lacZ–/galE–) | Covance | – | See reference 25 in manuscript |
| Chloroform | Caledon | 3001-2-40 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (D-PBS) | Gibco | 14190-250 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), 0.5M, pH 8 | Sigma-Aldrich | 03690 FLUKA | |
| Isoamyl alcohol | Caledon | 2/10/7900 | |
| Lennon LB broth base | Invitrogen | 12780-029 | |
| Stainless steel mesh filter | Sigma-Aldrich | S3770 | |
| Transpack packaging extract | Agilent Technologies | 200220 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Ethyl alcohol, anhydrous (EtOH) | Commercial Alcohols | – | |
| Ampicilin | Gibco | 11593-027 | prepare 20 mg/ml in dH2O |
| Kanamycin | Gibco | 11815-024 | prepare 5 mg/ml in dH2O |
| Phenol | Invitrogen | 15509-097 | Saturate in 0.1 M Tris-HCl as per manufacturers direction |
| Phenyl-β-D-galactopyranoside (P-Gal) | Sigma-Aldrich | P6501 | dissolve 3 g per 10 ml of dimethylformamide |
| Proteinase K | Invitrogen | 25530-031 | prepare 60 mg/ml solution dH2O just before use, 20 µl per sample |
| Sodium acetate (NaAc) | Fisher Scientific | BP333-500 | prepare 3M solutution, pH 5.2 |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L4390 | prepare 10% solution in dH2O |
| 1 M MgSO4 | 24.6 g MgSO4·7H2O per 100 ml dH2O, autoclave, store at room temperature up to 1 year | ||
| 20% maltose solution | 20.0 g maltose, 24.6 g MgSO4·7H2O, per 100 ml dH2O, filter sterilize, sore at 4ᵒC up to 6 months | ||
| Bottom agar | Prepare 64 ml per sample (8 pitri plates per sample X 8 ml per plate): 5.0 g LB base, 6.4 g NaCl, 7.5 g agar, per 1L dH2O. Autoclave and cool to 50ᵒC before pouring into Petri plates | ||
| LB Broth | 5.0 g LB base, 6.4 g NaCl per 1L dH2O. Autoclave and cool | ||
| Saline sodium citrate (SSC) | 150 mM NaCl, 15 mM trisodium citrate, pH 7.0 | ||
| SM Buffer | 5.8 g NaCl, 2.0 g MgSO4·7H2O, 50 ml 1 M Tris-HCl (pH 7.5), 5.0 ml of gelatin (2% w/v), per 1L dH2O, autoclave, store at room temperature up to 1 year | ||
| TE buffer | 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8 | ||
| Top agar, mutant plates | Prepare 32 ml per sample (4 mutant plates per sample X 8 ml per plate): 5.0 g LB base, 6.4 g NaCl, 7.5 g agar, per 1L dH2O. Autoclave and cool to 50ᵒC. Add MgSO4 to 10 mM | ||
| Top agar, titre plates | Prepare 32 ml per sample (4 mutant plates per sample X 8 ml per plate): 5.0 g LB base, 6.4 g NaCl, 7.5 g agar, per 1L H2O. Autoclave and cool to 50ᵒC. Add MgSO4 to 10 mM and P-Gal to 3 g/L |
References
- Ahmadi, A., Ng, S. C. Fertilizing ability of DNA-damaged spermatozoa. J. Exp. Zool. 284 (6), 696-704 (1999).
- Crow, J. F. The origins, patterns and implications of human spontaneous mutation. Nat. Rev. Genet. 1 (1), 40-47 (2000).
- Nelson, K., Holmes, L. B. Malformations due to presumed spontaneous mutations in newborn infants. N. Engl. J. Med. 320 (1), 19-23 (1989).
- Kong, A., et al. Rate of de novo mutations and the importance of father’s age to disease risk. Nature. 488 (7412), 471-475 (2012).
- Michaelson, J. J., et al. Whole-genome sequencing in autism identifies hot spots for de novo germline mutation. Cell. 151 (7), 1431-1442 (2012).
- Marchetti, F., Wyrobek, A. J. DNA repair decline during mouse spermiogenesis results in the accumulation of heritable DNA damage. DNA Repair (Amst). 7 (4), 572-581 (2008).
- Marchetti, F., Wyrobek, A. J. Mechanisms and consequences of paternally-transmitted chromosomal abnormalities. Birth Defects Res. C. Embryo. Today. 75 (2), 112-129 (2005).
- Demarini, D. M. Declaring the existence of human germ-cell mutagens. Environ. Mol. Mutagen. 53 (3), 166-172 (2012).
- Epstein, S. S. Use of the dominant-lethal test to detect genetic activity of environmental chemicals. Environ. Health. Perspect. 6, 23-26 (1973).
- Russell, W. L. X-ray-induced mutations in mice. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 16, 327-336 (1951).
- Singer, T. M., Yauk, C. L. Germ cell mutagens: Risk assessment challenges in the 21st century. Environ. Mol. Mutagen. 51 (8-9), 919-928 (2010).
- Tareke, E., Rydberg, P., Karlsson, P., Eriksson, S., Tornqvist, M. Acrylamide: A cooking carcinogen. Chem. Res. Toxicol. 13 (6), 517-522 (2000).
- Witt, K. L., et al. Mouse bone marrow micronucleus test results do not predict the germ cell mutagenicity of N-hydroxymethylacrylamide in the mouse dominant lethal assay. Environ. Mol. Mutagen. 41 (2), 111-120 (2003).
- Marchetti, F., Rowan-Carroll, A., Williams, A., Polyzos, A., Berndt-Weis, M. L., Yauk, C. L. Sidestream tobacco smoke is a male germ cell mutagen. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (31), 12811-12814 (2011).
- Yauk, C. L., Dubrova, Y. E., Grant, G. R., Jeffreys, A. J. A novel single molecule analysis of spontaneous and radiation-induced mutation at a mouse tandem repeat locus. Mutat. Res. 500 (1-2), 147-156 (2002).
- Niwa, O. Indirect mechanisms of genomic instability and the biological significance of mutations at tandem repeat loci. Mutat. Res. 598 (1-2), 61-72 (2006).
- Campbell, C. D., et al. Estimating the human mutation rate using autozygosity in a founder population. Nat. Genet. 44 (11), 1277-1281 (2012).
- Beal, M. A., Glenn, T. C., Somers, C. M. Whole genome sequencing for quantifying germline mutation frequency in humans and model species: Cautious optimism. Mutat. Res. 750 (2), 96-106 (2012).
- Shwed, P. S., Crosthwait, J., Douglas, G. R., Seligy, V. L. Characterisation of MutaMouse lambdagt10-lacZ transgene: Evidence for in vivo rearrangements. Mutagenesis. 25 (6), 609-616 (2010).
- Lambert, I. B., Singer, T. M., Boucher, S. E., Douglas, G. R. Detailed review of transgenic rodent mutation assays. Mutat. Res. 590 (1-3), 1-280 (2005).
- OECD. . OECD Guideline for the testing of chemicals: Transgenic rodent somatic and germ cell gene mutation assays. , (2011).
- Rodriguez, M., Panda, B. B., Ficsor, G. Testes weight reflect ethylnitrosourea induced histopathology in mice. Toxicol. Lett. 17 (1-2), 77-80 (1983).
- Russell, L. B. Effects of male germ-cell stage on the frequency, nature, and spectrum of induced specific-locus mutations in the mouse. Genetica. 122 (1), 25-36 (2004).
- Duselis, A. R., Vrana, P. B. Harvesting sperm and artificial insemination of mice. J. Vis. Exp. (3), 184 (2007).
- Gossen, J. A., Molijn, A. C., Douglas, G. R., Vijg, J. Application of galactose-sensitive E. coli strains as selective hosts for LacZ- plasmids. Nucleic Acids Res. 20 (12), 3254 (1992).
- Lemieux, C. L., et al. Simultaneous measurement of benzo[a]pyrene-induced pig-a and lacZ mutations, micronuclei and DNA adducts in muta mouse. Environ. Mol. Mutagen. 52 (9), 756-765 (2011).
- Douglas, G. R., Jiao, J., Gingerich, J. D., Gossen, J. A., Soper, L. M. Temporal and molecular characteristics of mutations induced by ethylnitrosourea in germ cells isolated from seminiferous tubules and in spermatozoa of lacZ transgenic mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92 (16), 7485-7489 (1995).
- Russell, W. L., Hunsicker, P. R., Raymer, G. D., Steele, M. H., Stelzner, K. F., Thompson, H. M. Dose–response curve for ethylnitrosourea-induced specific-locus mutations in mouse spermatogonia. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79 (11), 3589-3591 (1982).
- Swiger, R. R., Cosentino, L., Shima, N., Bielas, J. H., Cruz-Munoz, W., Heddle, J. A. The cII locus in the MutaMouse system. Environ. Mol. Mutagen. 34 (2-3), 201-207 (1999).
- Singer, T. M., Lambert, I. B., Williams, A., Douglas, G. R., Yauk, C. L. Detection of induced male germline mutation: Correlations and comparisons between traditional germline mutation assays, transgenic rodent assays and expanded simple tandem repeat instability assays. Mutat. Res. 598 (1-2), 164-193 (2006).
