Cromatográfica em camada delgada (TLC) Separações e Bioensaios de extratos de plantas para identificar compostos antimicrobianos

Ensaio para compostos anti-microbianos em plantas requer a separação dos componentes de um extracto de planta, a exposição de um microorganismo de teste para os componentes, e determinar se o crescimento do microorganismo é inibida por qualquer um dos compostos. Separações por papel ou por cromatografia em camada fina (TLC ou PC) é conveniente, porque muitos compostos podem ser separados sobre uma superfície plana. A separação baseia-se na polaridade, com a ligação de alguns compostos estreitamente ao adsorvente (celulose, no caso de PC, e uma variedade de adsorventes em caso de TLC) e a migração de menos do que os outros ^1. Figura 1 fornece um exemplo das posições relativas compostos fenólicos polares e não polares, após separação numa placa de sílica de CCF.

Figura 1. Diagrama que ilustra a distribuição de compostos de diferentes polaridades, após separação num gel de cromatografia de camada fina (TLC) da placa. Compostos fenólicos de trevo vermelho (Trifolium pratense L.), são utilizados como um exemplo. Compostos polares, tais como clovamide, têm uma forte afinidade para um adsorvente polar como sílica e permanecer perto da origem (OR), enquanto que os compostos menos polares, tais como os três isoflavonas perto da frente do solvente (SF), partição mais facilmente em solventes (que são menos polares do que a água a menos de sílica, ácidos ou bases são incluídos) e migra mais longe da placa.

Após a separação de um extracto de uma placa de TLC, os microrganismos de teste podem ser expostos a todos os compostos na placa, acelerando, assim, a identificação dos componentes activos de um extracto ^2. Se uma cultura fúngica ou bacteriana é exposta ao cromatograma, o crescimento microbiano irá ocorrer em todos os lugares, excepto em áreas de crescimento com inibidorcompostos y. As zonas de inibição, em seguida, pode ser visualizado pela observação do contraste entre o crescimento micelial e as áreas livres do crescimento de fungos se foram aplicadas ^3, ou por pulverização com os compostos que mudam de cor quando reduzido ou hidrolisados ​​pelas células vivas ^4. Embora o uso de papel ou de camada fina cromatogramas para ensaios antimicrobianos foi aplicado pela primeira vez aos antibióticos e fungicidas ^{5 3,6,} extratos de plantas já são freqüentemente selecionados para compostos antimicrobianos com este método, muitas vezes referida como bioautografia. Os protocolos aqui descritos aplicam-se a bioautografia dos cromatogramas em camada fina. TLC é amplamente usada porque é relativamente rápida e pode ser realizada em diferentes adsorventes (por exemplo, sílica, amido, alumina), bem como proporcionar boa resolução e sensibilidade ^1.

Extractos vegetais podem ser preparados por TLC de muitas maneiras. Os métodos mais comuns incluem material vegetal extração em alcmisturas OHOL em água tais como etanol a 80% ^7,8, possivelmente com a adição de ácido ou de base ^9. Na sequência de uma extracção em solventes, que contêm água e que são, eventualmente, ácido ou básico, extractos deve ser concentrado de modo a que possam ser aplicadas a placas de TLC em um volume mínimo. A concentração dos extractos de álcool-água pode ser alcançado através da repartição com solventes orgânicos imiscíveis em água ⁸ ou com uma mistura de tais solventes, tal como acetato de etilo-éter etílico (1:1, v / v) ^10,11. Diferentes metabolitos de plantas são extraídos em diferentes solventes orgânicos, dependendo das suas polaridades. Para garantir que os ácidos orgânicos vegetais ou bases são extraídos para solventes orgânicos, nesta fase, o pH de um extracto de álcool e água pode ser aumentado ou reduzido com um ácido solúvel em água ou uma base para converter analitos dissociados em suas formas nondissociated, que são então solúveis em solventes orgânicos neutros ^9. A fase orgânica pode então ser evaporated sob pressão reduzida ou sob azoto, e ajustou-se o volume pretendido de TLC. O pH do extracto é improvável que seja letal para os microorganismos bio-ensaio, devido à partição de analitos em dissolventes neutros, pequeno volume final, e a evaporação do extracto sobre a placa de TLC, antes da separação.

Ambos os fungos e bactérias são empregados como microrganismos testes em bioautografia de extratos vegetais ^2. Esporos de alguns fungos, tais como Cladosporium cucumerinum, germinar sobre placas de TLC (além de regiões com compostos inibitórios), se for pulverizado sobre placas de uma solução nutriente e incubou-se em um ambiente húmido durante vários dias ^3. O micélio escuro da C. cucumerinum em zonas noninhibitory fornece um nítido contraste com as zonas francas de crescimento micelial. Apesar de as bactérias terem sido aplicadas a cromatografia em camada fina (TLC) as placas da mesma forma que ^4,12, bactérias também são derramadas sobre TLCsuperfícies da placa de ágar sobrepõe ^13,14. Levedura, tais como Candida albicans, pode ser aplicado em sobreposições de agar, bem ^14. Alternativamente, placas de TLC pode ser colocado de bruços em ágar inoculadas com bactérias ou leveduras ^{10,15 8,} um método conhecido como contato bioautografia ^2.

Nós descrevemos um método para contato bioautografia para triagem de compostos fenólicos antimicrobianos de trevo vermelho (Trifolium pratense cv. Kenland). O microrganismo teste é sticklandii Clostridium, uma produtora de amônia bactéria hiper ruminal (HAB) e obrigar anaeróbio. Embora as separações utilizados não resolve todos os componentes do extracto, que facilitam a identificação de zonas de actividade antimicrobiana, reduzindo, assim, o conjunto de possíveis compostos antimicrobianos. O protocolo utiliza procedimentos padrão para TLC ^1. O protocolo também descreve algumas das técnicas necessárias para a cultura obrianaeróbios de corrediça para um tal ensaio, a utilização de contacto bioautografia ¹⁵ e um método de visualização com um sal de tetrazólio, que cora as células vivas ^{de 2,4.}