Strato sottile cromatografica (TLC) Separazioni e Bioassays di estratti vegetali per identificare composti antimicrobici

Saggio di composti antimicrobici nelle piante richiede separare i componenti di un estratto vegetale, esponendo un microrganismo di prova per tali componenti, e determinare se la crescita del microrganismo è inibita da qualsiasi dei composti. Separazioni di carta o cromatografia su strato sottile (TLC o PC) sono convenienti perché molti composti possono essere separati su una superficie planare. La separazione è basata sulla polarità, con alcuni composti vincolante strettamente al adsorbente (cellulosa nel caso di PC, e una varietà di adsorbenti nel caso di TLC) e la migrazione meno di altri ^1. Figura 1 fornisce un esempio delle posizioni relative composti fenolici polari e apolari dopo separazione su una piastra TLC silice.

Figura 1. Diagramma che illustra le distribuzioni di composti di diverse polarità dopo la separazione su una silice per cromatografia su strato sottile (TLC) piastra. Composti fenolici di trifoglio rosso (Trifolium pratense L.) vengono utilizzati come esempio. Composti polari, come clovamide, hanno una forte affinità per un adsorbente polare come silice e rimangono vicino all'origine (OR), mentre i composti polari meno, come le tre isoflavoni vicino al fronte del solvente (SF), partizione più facilmente in solventi (che sono meno polare silice meno acqua, acidi o basi sono incluse) e migrare lontano sulla piastra.

Dopo separazione di un estratto su una piastra TLC, microrganismi di prova possono essere esposti a tutti i composti sulla piastra, accelerando così l'identificazione dei componenti attivi di un estratto ^2. Se una coltura fungina o batterica è esposto al cromatogramma, crescita microbica avverrà ovunque tranne su aree con incremento-inibitoreComposti y. Zone di inibizione quindi possono essere visualizzate osservando il contrasto tra la crescita del micelio e le zone di libero crescita se i funghi sono stati applicati ³ o spruzzo con composti che cambiano colore quando ridotto o idrolizzato dalle cellule viventi ^4. Sebbene l'uso di carta o sottile strato cromatogrammi per saggi antimicrobici è stata applicata in primo luogo agli antibiotici ⁵ e fungicidi ^3,6, estratti di piante sono ora spesso sottoposti a screening per composti antimicrobici con questo metodo, spesso definito come bioautografia. I protocolli descritti nel presente documento si applicano a bioautografia di cromatogrammi a film sottile. TLC è ampiamente utilizzato perché è relativamente rapida e può essere eseguita su diversi adsorbenti (ad esempio silice, amido, allumina), oltre a fornire una buona risoluzione e sensibilità ^1.

Estratti vegetali possono essere preparati per TLC in molti modi. I metodi più comuni includono materiale vegetale di estrazione in alcmiscele ohol in acqua come etanolo 80% ^7,8, eventualmente con l'aggiunta di acido o di base ^9. A seguito un'estrazione in tali solventi, che contengono acqua e sono eventualmente acida o basica, estratti devono essere concentrate in modo che possano essere applicati alle piastre TLC in un volume minimo. La concentrazione di estratti alcol-acqua può essere ottenuto partizionando con solventi organici immiscibili in acqua ⁸ o con una miscela di tali solventi, quali acetato di etile-etere etilico (1:1 v / v) ^10,11. Diversi metaboliti vegetali vengono estratti in solventi organici diversi, a seconda della loro polarità. Per assicurarsi che l'impianto acidi organici o basi vengono estratti in solventi organici, in questa fase, il pH di un estratto alcolico-acqua può essere sollevato o abbassato con un acido solubile in acqua o base per convertire analiti dissociate nelle loro forme nondissociated, che sono poi solubile in solventi organici neutri ^9. La fase organica può quindi essere postavaporated sotto pressione ridotta o sotto azoto e regolato il volume desiderato per TLC. Il pH dell'estratto è improbabile che sia letale per i microrganismi di prova biologica dovuti all'isolamento di analiti in solventi neutri, piccolo volume finale, e l'evaporazione dell'estratto sulla piastra TLC prima della separazione.

Entrambi i funghi e batteri sono impiegati come microrganismi prova in bioautografia di estratti vegetali ^2. Spore di alcuni funghi, come Cladosporium cucumerinum, germinano su piastre di TLC (a parte le zone con composti inibitori) se spruzzato su piastre in una soluzione nutritiva e incubate in un ambiente umido per diversi giorni ^3. Il micelio scuro di C. cucumerinum sulle zone noninhibitory fornisce un netto contrasto con le zone franche di crescita del micelio. Anche se i batteri sono stati applicati per cromatografia su strato sottile (TLC) piastre nello stesso modo ^4,12, i batteri si riversano anche su TLCsuperfici delle piastre di agar si sovrappone ^13,14. Lieviti, come Candida albicans, può essere applicato in sovrapposizioni agar e ^14. In alternativa, le piastre TLC possono essere posizionati a faccia in giù su agar inoculato con batteri o lieviti ^{10,15 8,} un metodo noto come contatto bioautografia ^2.

Descriviamo un metodo per contatto bioautografia per schermare per i composti fenolici antimicrobici di trifoglio rosso (Trifolium pratense cv. Kenland). Il microrganismo test è Clostridium sticklandii, a-ammoniaca produce iper batterio ruminale (HAB) e obbligano anaerobi. Sebbene le separazioni utilizzati non risolvono tutti i componenti dell'estratto, facilitano l'individuazione delle zone di attività antimicrobica, riducendo così il numero di possibili composti antimicrobici. Il protocollo utilizza procedure standard per TLC ^1. Il protocollo descrive anche alcune delle tecniche necessarie per la coltura obblighianaerobi cancello per tale saggio, un ciclo di contatto bioautografia ¹⁵ e un metodo di visualizzazione con un sale di tetrazolio, che colora le cellule viventi ^2,4.