İnce tabaka kromatografi (TLC) Ayırımı ve bitki özleri Biyodenemeler Antimikrobiyal Bileşikler tanımak

Bitkilerde antimikrobiyal bileşikler için tahlil, bir bitki ekstraktı bileşenlerinin ayrılması ve bu bileşenlerin, bir test mikroorganizmanın maruz bırakılması, ve mikroorganizmaların büyüme bileşiklerin herhangi biri ile inhibe olup olmadığının belirlenmesini gerektirir. Birçok bileşik düzlemsel bir yüzeye ayrılabilir, çünkü kağıt veya ince tabakalı kromatografi (PC veya TLC) ile Separations uygundur. Ayırma bazı bileşikler, adsorban (PC durumunda selüloz, ve TLC durumunda adsorbanların çeşitli) sıkıca bağlanması ve diğerlerine ¹ daha az geçirme ile, polarite dayanmaktadır. Şekil 1, göreli pozisyonlarının bir örnek teşkil silis TLC plakası üzerinde ayrılmasından sonra, polar ve polar olmayan fenolik bileşikler.

Şekil 1. Bir silika ince tabakalı kromatografi (TLC) üzerinde plaka ayrıldıktan sonra farklı polariteye sahip bileşiklerin dağılımı gösteren bir diyagramdır. Kırmızı yonca (Trifolium pratense L.) fenolik bileşikler, bir örnek olarak kullanılmaktadır. Örneğin clovamide gibi Polar bileşikler, silika gibi bir polar adsorban için güçlü bir afiniteye sahip ve kökeni (OR) yakın devam ederken böyle bir çözücü önünde yakınındaki üç izoflavon (SF), bölme daha kolay çözücü içine daha az polar bileşikler, (su, asitler, bazlar ya da içerdiği sürece, silika daha az polar olan) ve daha uzak plaka yukarı göç ederler.

Bir TLC plakası üzerinde bir ekstresinin ayrılmasından sonra, deney mikroorganizmalar bu nedenle bir özü ^2'nin aktif bileşenlerinin tanımlanmasını hız, plaka üzerinde tüm bileşiklere maruz kalabilir. , Bir mantar ya da bakteri kültürü kromatogramında maruz kalırsa, mikrobiyal büyüme büyüme inhibitörü olan alanlarda dışında her yerde ortaya çıkary bileşikler yer alır. Engel bölgeleri daha sonra mantar ³ uygulanmış olması halinde miselial büyüme ve büyüme içermeyen alanlar arasındaki kontrast gözlemleyerek ya da canlı hücreler ⁴ azaltılabilir ya da hidrolize edilmiş renk değiştiren bileşiklerle püskürtme ile görselleştirilebilir. Antimikrobiyal tahliller için kağıt veya ince tabakalı kromatogramların kullanımı ilk antibiyotik ⁵ ve mantar öldürücüler ^3,6 uygulandı, ancak, bitki ekstreleri, sık sık bioautography olarak adlandırılan bu yöntemle antimikrobiyal bileşikler için taranmaktadır. Bu buluşta tarif edilen protokoller, ince tabakalı kromatogramların bioautography için de geçerlidir. Nispeten hızlıdır ve farklı adsorban (örneğin, silika, nişasta, alümina), hem de iyi bir çözünürlük ve hassasiyeti ¹ sağlanması gerçekleştirilebilir, çünkü TLC yaygın olarak kullanılmaktadır.

Bitki özleri birçok yönden TLC için hazırlanabilir. Yaygın yöntemler ALC açılan bitki materyali içerirörneğin muhtemelen bir asit veya baz ⁹ eklenmesiyle% 80 etanol ^7,8 yanı ohol-su karışımları. Bir minimal hacimde TLC plakalarına tatbik edilebilir, böylece bir miktar su içerir ve muhtemelen, asidik veya bazik olan bu gibi çözgenler içinde, bir ekstre edilmesinden sonra, ekstreler konsantre edilmelidir. Alkol-su özleri konsantrasyonu, su ile karışmayan bir organik çözücü ⁸ ile ya da etil asetat-etil eter (1:1, v / v) ^10,11 gibi çözücülerin bir karışımı ile bölünmesi ile elde edilebilir. Farklı bitki metabolitleri, kutupları bağlı olarak, farklı bir organik çözücü içine ekstre edilmektedir. Bu bitki, organik asitler ya da bazlar, bu aşamada, organik çözücüler ile ekstre emin olmak için, bir alkol-su ekstrenin pH yükseltilmiş veya daha sonra da nondissociated formları haline ayrışmış analitlerin dönüştürmek için bir suda çözünür bir asit veya baz ile düşürülebilir nötr organik çözücü ⁹ çözünür. Organik faz daha sonra e olabilir,indirgenmiş basınç altında ya da azot altında vaporated ve TLC için istenen hacme ayarlanabilir. Ekstrenin pH nötr solventler, küçük bir nihai hacme, önceki ayırma TLC plakası üzerinde ekstraktın buharlaştırılması içine analitlerin bölünmesi nedeniyle biyolojik tayin mikroorganizmalar için öldürücü olması pek mümkün değildir.

Mantar ve bakteri her ikisi de ^2, bitki ekstrelerinin bioautography test mikroorganizmalar gibi kullanılır. Bir besleyici çözelti içinde plakalar üzerine püskürtülür ve birkaç gün ³ boyunca nemli bir ortamda inkübe bu tür Cladosporium cucumerinum gibi bazı mantarlar, sporları, (ayrı önleyici bileşikler ile alanlardan) TLC plakalar üzerinde filizlenmesi. C. karanlık miselyum noninhibitory bölgeler üzerinde cucumerinum misel büyüme serbest bölgelere keskin bir kontrast sağlar. Bakteriler ile aynı şekilde ^4,12 ince tabakalı kromatografi (TLC) plakaları uygulanmış olsa da, bakteriler, TLC üzerinde dökülüragar plaka yüzeyleri ^13,14 bindirmeleri. Örneğin Candida albicans gibi maya, hem de ¹⁴ agar kaplamalar olarak uygulanabilir. Seçenek olarak ise, TLC levhaları, bakteri ya da maya ^{8 10,15,} kontak bioautography ² olarak bilinen bir yöntem ile aşılanmış agar üzerine yüzü aşağı yerleştirilebilir.

Bu, kırmızı yonca (Trifolium pratense ev. Kenland) için antimikrobiyal fenolik bileşiklerin taranması için temas bioautography için bir yöntem tarif eder. Test mikroorganizma Clostridium sticklandii, bir rumen hiper amonyak üreten bakteri (HAB) ve anaerob zorunlu olduğunu. Kullanılan ayırma ekstrenin tüm bileşenlerini gidermek de, böylece olası antimikrobiyal bileşiklerin havuz daralma, antimikrobiyal aktivite bölgelerin belirlenmesini kolaylaştırır. Protokol TLC ¹ için standart yöntemler kullanmaktadır. Bu protokol, aynı zamanda kültür obli için gerekli olan bazı teknikler açıklanmaktadırBöyle bir tahlil için kapı anaeroblar canlı hücreler ^2,4 lekeleyen bir tetrazolyum tuzu ile temas bioautography ¹⁵ ve bir görselleştirme yöntemi, bir kullanım.