Тонкослойная Хроматографическое (ТСХ) Разделение и Биоанализы растительных экстрактов для идентификации антимикробные соединения

Анализа на антимикробных соединений в растениях требует разделения компонентов растительного экстракта, подвергая тест-микроорганизма в тех компонентов, и определения, является ли рост микроорганизма в ингибируется любого из соединений. Разделение с помощью бумажной или тонкослойной хроматографии (ПК или ТСХ) удобны тем, что многие соединения могут быть разделены на плоской поверхности. Разделение основано на полярности, при этом некоторые соединения связывания крепко адсорбента (целлюлозы в случае ПК, а также ряд адсорбентов в случае ТСХ) и миграции меньше, чем другие ^1. Рисунок 1 дает пример взаимного расположения полярные и неполярные фенольные соединения после разделения на диоксид кремния ТСХ пластины.

Рисунок 1. Диаграмма, иллюстрирующая распределение соединений различной полярности после разделения на силикагеле, тонкослойной хроматографии (ТСХ) пластины. Фенольные соединения из красного клевера (Trifolium луговой L.) используются в качестве примера. Полярные соединения, такие как clovamide, имеют сильное сродство к полярным адсорбентом, как диоксид кремния и остаются вблизи начала координат (OR), а менее пол рные соединени, такие как три изофлавонов вблизи фронта растворителя (SF), раздел более легко в растворителях (которые являются менее полярным, чем кремнезема, если вода, кислоты, основания или не включены) и мигрировать дальше вверх пластины.

После отделения экстракта на ТСХ пластине, тестовые микроорганизмы могут подвергаться воздействию всех соединений на пластине, тем самым ускоряя идентификацию активных компонентов экстракта ^2. Если грибковая или бактериальная культура подвергается хроматограмме, микробный рост будет происходить везде, кроме над районами с роста-ингибиторау соединения. Зон ингибирования могут быть визуализированы при наблюдении контраст между мицелия и областей роста свободной если грибы были применены ^три или распылением с соединениями, которые меняют цвет, когда уменьшается или гидролизованный живыми клетками, ^4. Хотя использование бумажных или тонкослойных хроматограмм для антимикробных анализов был впервые применен к антибиотикам ⁵ и фунгицидов ^3,6, растительные экстракты в настоящее время часто скрининг на антимикробных соединений с этим методом, часто упоминается как bioautography. Протоколы, описанные здесь, относятся к bioautography тонкослойных хроматограмм. ТСХ широко используется, потому что это относительно быстрый и могут быть выполнены на различных адсорбентов (например, кремнезема, крахмал, оксид алюминия), а также обеспечивает хорошую разрешение и чувствительность ^1.

Растительные экстракты могут быть подготовлены для ТСХ во многих отношениях. Общие методы включают извлекающий растительный материал в алкohol-водные смеси, такие как 80%-ного этанола ^7,8, возможно, с добавлением кислоты или основания ^9. После экстракции в таких растворителей, содержащих воду и, возможно, кислой или основной, экстракты должны быть сконцентрированы, так что они могут быть применены к пластинах ТСХ в минимальном объеме. Концентрация алкоголя водных экстрактов может быть достигнуто путем разделения с несмешивающихся с водой органических растворителей ⁸ или смесью этих растворителей, таких как этилацетат-этиловый эфир (1:1, об / об) ^10,11. Различные метаболиты растений экстрагировали в различных органических растворителей, в зависимости от их полярности. Чтобы гарантировать, что растительные органические кислоты или основания извлекаются в органических растворителях на этой стадии, рН экстракта водно-спиртовой может быть повышена или понижена с водорастворимой кислоты или основания для преобразования диссоциированных аналитов в их недиссоциированных форм, которые затем растворимый в нейтральных органических растворителях ^9. Органическую фазу может быть адресvaporated при пониженном давлении или в атмосфере азота и доводили до требуемого объема для ТСХ. РН экстракта вряд ли будет смертельным для биопроб микроорганизмов за счет разбиения аналитов в нейтральных растворителей, небольшой конечного объема, и испарения экстракта на ТСХ пластине перед разделением.

Оба грибки и бактерии используют в качестве тестовых микроорганизмов в bioautography растительных экстрактов ^2. Споры некоторых грибов, таких как Cladosporium cucumerinum, прорастают на пластинах ТСХ (кроме областей с ингибирующих соединений) если распыляют на пластинах в питательном растворе и инкубировали во влажной среде в течение нескольких дней ^3. Темная мицелий С. cucumerinum на noninhibitory зон обеспечивает резкий контраст зон, свободных от роста мицелия. Хотя бактерии были применены к тонкослойной хроматографии (ТСХ) пластин таким же образом, ^4,12, бактерии также выливают на ТСХповерхности пластины в агар перекрывает ^13,14. Дрожжи, таких как Candida Albicans, может быть применен в чашках с накладками, а ^14. Кроме того, ТСХ пластины могут быть размещены лицевой стороной вниз на агаре инокулировали с бактерий или дрожжей ^{10,15 8,} способом, известным как контактное bioautography ^2.

Мы опишем метод для контактной bioautography для выявления противомикробных фенольных соединений из красного клевера (клевер луговой CV. Kenland). Тест микроорганизм Clostridium sticklandii, рубца гипер аммиака бактерия-продуцент (ВЦВ) и обязать анаэробные. Хотя разделение используемые не решают все компоненты экстракта, они облегчают идентификацию зон антимикробной активности, таким образом, сужение круга возможных противомикробным соединений. Протокол использует стандартные процедуры для ТСХ ^1. Протокол также описывает некоторые из методов, необходимых для культивирования обяворота анаэробы для такого анализа, использование контактной bioautography ¹⁵ и способу визуализации с тетразолиевого соли, которая окрашивает живые клетки ^2,4.