Thin-layer Chromatographic (TLC) Scheidingen en Bioassays van plantenextracten te identificeren antimicrobiële verbindingen

Testen op antimicrobiële verbindingen in planten vereist het scheiden van de componenten van een plantenextract, blootstellen test micro-organisme die delen, en het bepalen of groei van het micro-organisme wordt geremd door een van de verbindingen. Scheidingen door papier of dunne-laag chromatografie (TLC of PC) zijn handig omdat veel verbindingen kunnen worden gescheiden op een vlak oppervlak. Scheiding is gebaseerd op polariteit met sommige verbindingen binden stevig aan het adsorptiemiddel (cellulose bij pc, en een verscheidenheid van adsorptiemiddelen bij TLC) en het migreren van minder dan anderen ^1. Figuur 1 geeft een voorbeeld van de relatieve posities van polaire en niet-polaire fenolen na scheiding op een silica TLC-plaat.

Figuur 1. Diagram verdelingen van verbindingen met verschillende polariteit na scheiding op een silica dunne-laagchromatografie (TLC) plaat. Fenolverbindingen rode klaver (Trifolium pratense L.) dienen als voorbeeld. Polaire verbindingen, zoals clovamide, een sterke affiniteit voor een polair adsorptiemiddel zoals silica en blijft bij de oorsprong (OR), terwijl minder polaire verbindingen, zoals de drie isoflavonen bij vloeistoffront (SF), verdeling gemakkelijker in de oplosmiddelen (die minder polair dan silica tenzij water, zuren, basen of zijn opgenomen) en migreren verder de plaat.

Na afscheiding van een extract op een TLC-plaat kunnen micro-organismen in worden blootgesteld aan verbindingen op de plaat, waardoor sneller de identificatie van de actieve componenten van een extract ^2. Als een schimmel of bacteriële kweek wordt blootgesteld aan het chromatogram zal microbiële groei overal optreden behalve dan gebieden met groei-inhibitory verbindingen. Remmingszones dan kan worden gevisualiseerd door het observeren van het contrast tussen myceliumgroei en de groei gebieden als fungi zijn aangebracht ³ of door besproeien met verbindingen die van kleur veranderen wanneer verminderd of gehydrolyseerd door levende cellen ^4. Hoewel het gebruik van papier of dunne-laag chromatogrammen antimicrobiële assays eerst werd op ⁵ antibiotica en fungiciden ^3,6 worden plantenextracten nu regelmatig onderzocht op antimicrobiële samenstellingen met deze werkwijze vaak aangeduid als bioautografie. De hierin beschreven protocollen toepassing bioautografie dunne-laag chromatogrammen. TLC wordt veel gebruikt omdat het relatief snel en kan worden uitgevoerd op verschillende adsorptiemiddelen (bijvoorbeeld silica, zetmeel, aluminiumoxide), alsmede het verschaffen van goede resolutie en gevoeligheid ^1.

Plantenextracten kunnen worden voorbereid TLC op vele manieren. Voorkomende methodes zijn extraheren plantmateriaal in alcohol-watermengsel zoals 80% ethanol ^7,8, eventueel met toevoeging van zuur of base ^9. Na een extractie dergelijke oplosmiddelen, die wat water bevatten en eventueel zure of basische moet extracten worden geconcentreerd zodat ze kunnen worden toegepast op TLC platen in een minimaal volume. De concentratie van alcohol-water extracten worden bereikt door het verdelen van met water mengbare organische oplosmiddelen ⁸ of een mengsel van dergelijke oplosmiddelen, zoals ethylacetaat-ethylether (1:1, v / v) ^10,11. Verschillende plantmetabolieten worden geëxtraheerd in verschillende organische oplosmiddelen, afhankelijk van de polariteit. Om plantaardige organische zuren of basen worden geëxtraheerd in organische oplosmiddelen in dit stadium kan de pH van een alcohol-water extract worden verhoogd of verlaagd met een in water oplosbare zuur of base aan gedissocieerde analyten zetten in hun nondissociated vormen, die vervolgens oplosbaar in neutraal organische oplosmiddelen ^9. De organische fase kan dan worden evaporated onder verminderde druk of onder stikstof en op de gewenste volume TLC. De pH van het extract waarschijnlijk dodelijk bioassay microorganismen door de verdeling van analyten in neutrale oplosmiddelen, kleine eindvolume en indampen van het extract op de TLC plaat vóór scheiding zijn.

Zowel schimmels en bacteriën werkzaam zijn als proef micro-organismen in bioautografie van plantenextracten ^2. Sporen van sommige schimmels, zoals Cladosporium cucumerinum ontkiemen op TLC-platen (met uitzondering van gebieden met remmende verbindingen) of gesproeid op platen in een voedingsoplossing en geïncubeerd in een vochtige omgeving voor meerdere dagen ^3. De donkere mycelium van C. cucumerinum op non-inhibitive zones zorgt voor een scherp contrast met zones vrij van myceliumgroei. Hoewel bacteriën zijn toegepast op dunnelaagchromatografie (TLC) platen op dezelfde wijze ^4,12, zijn bacteriën ook uitgegoten over TLCplaat oppervlakken in agar overlays ^13,14. Gist zoals Candida albicans, kunnen worden toegepast agar overlays en ^14. Als alternatief TLC-platen kan worden gezicht naar beneden geplaatst op agar geënt met bacteriën ^10,15 of gist ^8, een methode die bekend staat als contact bioautografie ^2.

We beschrijven een methode voor contact bioautografie om te screenen op antimicrobiële fenolen uit rode klaver (Trifolium pratense cv. Kenland). De test micro-organisme Clostridium sticklandii, een pens hyper-ammoniak producerende bacterie (HAB) en obligaat anaërobe. Hoewel de scheidingen die niet alle componenten van het extract lossen, vergemakkelijken ze de identificatie van gebieden van antimicrobiële activiteit, waardoor het verkleinen van de pool van mogelijke antimicrobiële verbindingen. Het protocol maakt gebruik van standaardprocedures voor TLC ^1. Het protocol beschrijft ook een aantal van de technieken die nodig zijn voor het kweken obligate anaeroben voor een dergelijke test, een gebruik van contact bioautografie ¹⁵ en een visualisatie methode met een tetrazoliumzout, die levende cellen ^2,4 vlekken.