Mince couche chromatographique (CCM) Séparations et essais biologiques d'extraits végétaux pour identifier des composés antimicrobiens

Le dosage de composés antimicrobiens dans des plantes nécessite la séparation des constituants d'un extrait de plante, l'exposition d'un micro-organisme d'essai à ces composants, et pour déterminer si la croissance du micro-organisme est inhibée par l'un quelconque des composés. Séparations par papier ou chromatographie sur couche mince (CCM ou PC) sont pratiques car de nombreux composés peuvent être séparés sur une surface plane. La séparation est basée sur la polarité, avec des composés de liaison étanche à l'adsorbant (cellulose dans le cas de PC, et une variété d'adsorbants dans le cas de la Chromatographie sur couche mince) et la migration de moins que les autres ^une. Figure 1 donne un exemple de la position relative des des composés phénoliques polaires et non polaires après la séparation sur une plaque de TLC de silice.

Figure 1. Diagramme illustrant la répartition des composés de polarités différentes après la séparation sur une couche mince de silice chromatographique (CCM) plaque. Composés phénoliques de trèfle rouge (Trifolium pratense L.) sont utilisés comme un exemple. Des composés polaires tels que le clovamide, ont une forte affinité pour un adsorbant polaire comme le silice et restent près de l'origine (OR), alors que moins de composés polaires, tels que les trois isoflavones près du front de solvant (SF), partition plus facilement dans les solvants (qui sont moins polaires que la silice à moins que l'eau, des acides ou des bases sont incluses) et de migrer plus haut sur la plaque.

Après séparation de l'extrait sur ​​une plaque de CCM, les micro-organismes d'essai peuvent être exposés à tous les composés de la plaque, en accélérant ainsi l'identification des composants actifs de l'extrait ^2. Si une culture fongique ou bactérienne est exposé au chromatogramme, la croissance microbienne se produit partout sauf sur les zones où la croissance inhibiteurcomposés y. Zones d'inhibition peuvent ensuite être visualisées en observant le contraste entre la croissance du mycélium et les zones de libre-croissance si les champignons ont été appliquées ³ ou par pulvérisation avec des composés qui changent de couleur lorsqu'ils sont réduits ou hydrolysé par des cellules vivantes ^4. Bien que l'utilisation de papier ou couche mince chromatogrammes pour les tests antimicrobiens a été d'abord appliquée aux antibiotiques et fongicides ^{5 3,6,} extraits de plantes sont maintenant souvent masqués pour les composés antimicrobiens avec cette méthode, souvent appelés bioautographie. Les protocoles décrits ici s'appliquent à bioautographie de chromatogrammes en couche mince. TLC est largement utilisé parce qu'il est relativement rapide et peut être effectué sur les différents adsorbants (par exemple, la silice, l'amidon, l'alumine), ainsi que de fournir une bonne résolution et ^une sensibilité.

Les extraits de plantes peuvent être préparés pour TLC dans de nombreuses façons. Les méthodes courantes comprennent le matériel végétal extraction dans alcdes mélanges tels que l'éthanol à 80% ^7,8, éventuellement avec l'addition d'acide ou de base ⁹ ohol à l'eau. Suite à une extraction dans de tels solvants, qui contiennent un peu d'eau et sont peut-être acide ou basique, les extraits doivent être concentrées de sorte qu'ils peuvent être appliqués à des plaques de CCM dans un volume minimal. La concentration des extraits d'alcool dans l'eau peut être obtenue en divisant l'aide de solvants organiques non miscibles à l'eau ⁸ ou avec un mélange de tels solvants, tels que l'éther éthylique-acétate d'éthyle (1:1, v / v) ^10,11. Métabolites de plantes différentes sont extraits dans différents solvants organiques, en fonction de leur polarité. Pour s'assurer que les acides ou les bases organiques végétaux sont extraits dans des solvants organiques, à ce stade, le pH d'un extrait d'alcool dans l'eau peut être élevé ou abaissé avec un acide ou une base soluble dans l'eau pour convertir les analytes dissociées en leurs formes non dissociée, qui sont ensuite soluble dans les solvants organiques neutres ^9. La phase organique peut alors être evaporated sous pression réduite ou sous atmosphère d'azote et on ajuste le volume souhaité pour la CCM. Le pH de l'extrait est peu susceptible d'être létale pour les micro-organismes dans les essais biologiques en raison de la séparation des analytes dans des solvants neutres, petit volume final, et l'évaporation de l'extrait sur la plaque de CCM avant la séparation.

Les champignons et les bactéries sont utilisées comme des micro-organismes d'essai dans bioautographie d'extraits de plantes ^2. Les spores de certains champignons tels que Cladosporium cucumerinum, germent sur ​​des plaques de CCM (en dehors des zones avec des composés inhibiteurs) si pulvérisée sur les plaques dans une solution nutritive et on les incube dans un environnement humide pendant plusieurs jours ^3. Le mycélium foncé de C. cucumerinum sur les zones non inhibitrice offre un contraste frappant avec les zones franches de la croissance du mycélium. Bien que les bactéries ont été appliquées à une Chromatographie sur couche mince (CCM) des plaques de la même manière ^4,12, les bactéries sont également versé sur TLCsurfaces de la plaque de gélose superpositions ^13,14. Levure, telle que Candida albicans, peut être appliquée dans les superpositions de gélose ainsi ^14. Alternativement, des plaques de CCM peuvent être placés face vers le bas sur une gélose inoculée avec des bactéries ou des levures ^{10,15 8,} un procédé connu sous le nom de contact bioautographie ^2.

Nous décrivons une méthode pour le contact bioautographie pour cribler des composés phénoliques antimicrobiens du trèfle rouge (Trifolium pratense cv. Kenland). Le micro-organisme test est Clostridium sticklandii, une bactérie du rumen hyper ammoniac-production (HAB) et obliger anaérobie. Bien que les séparations utilisées ne résolvent pas tous les composants de l'extrait, elles facilitent l'identification des zones d'activité antimicrobienne, réduisant ainsi la piscine de composés antimicrobiens possibles. Le protocole utilise des procédures standard pour la CCM ^1. Le protocole décrit également certaines des techniques requises pour la culture obligationsgrille anaérobies pour un tel essai, l'utilisation d'un bio-autographie de contacts ¹⁵ et un procédé de visualisation avec un sel de tétrazolium, qui colore les cellules vivantes ^2,4.