Insanlaşmış Fare Modeli mikrovaskülatürde Hedefleme Bakteriyel Enfeksiyonlar Eğitim için
Summary
Neisseria meningitidis kan damarları bulaşan bir insan özgü patojendir. Bu protokolde insan mikrodamarlar bağışıklığı fare üzerine insan cildi aşılama yaparak bir fare sokulur. Bakteriler genellikle insan durumda gözlenen purpurik döküntü vasküler hasar ve gelişimine yol açan, insan gemilere yoğun yapışır.
Abstract
Bu insan kan dolaşımına girdiğinde Neisseria meningitidis ağır, sık sık öldürücü sepsis neden olur. Enfeksiyon vasküler sızıntı, purpura döküntü ve nihai doku nekrozu geliştirilmesi ile sonuçlanan kan damarlarının geniş bir hasara yol açar. Bu enfeksiyonun patogenezinin incelenmesi, daha önce in vivo modellerde zorlaştırır bakterilerin insan özgüllük ile sınırlıydı. Bu protokol, insan derisi, dermal mikrodamarlar ihtiva eden, bağışıklık sistemi üzerine aşılanmış farelerde edildiği bu enfeksiyon için bir insanlaştırılmış modeli açıklar. Insan özelliklerini korurken bu gemiler fare dolaşımı ile anastomoz. Bir kez bu model, N. içine tanıttı meningitidis geniş vasküler hasar, enflamasyon ve purpurik döküntü bazı durumlarda gelişimi ile sonuçlanan insan gemiler için özel olarak uygun. Bu protokol conte bu modelin aşılama, enfeksiyon ve değerlendirme aşamalarını açıklarN. xt meningitidis enfeksiyonu. Bu teknik, kan akışı enfekte çok sayıda insana özgü patojenlere uygulanabilir.
Introduction
Meningococcal sepsis, bakteriyel patojen Neisseria meningitidis tarafından neden olunan bir sıklıkla ölümcül bir kanla enfeksiyondur. Meningokok sepsis hastalar sıklıkla önceden dolaşan bakteriler ve bakteriyel ürünler 1 neden vasküler yıkım ile ilişkili olduğu kendi cilt üzerinde bir peteşiyal veya purpurik döküntü ile mevcut. Klinik hastalardan alınan deri biyopsileri genellikle damarlarına 2 dolgu, kılcal damarlarla ilişkili bakterileri göstermektedir. Yanı sıra, bakteriler, geniş tromboz, pıhtılaşma, tıkanıklık ve vasküler sızıntı purpurik bölgelerde 3-5 görülür. Bu vasküler hasar meningokok kurtulan debridman ve hatta amputasyon sonuçlanan, deri ve çevreleyen dokuların geniş nekrozu yol açabilir. Enfeksiyon, bu vasküler hasara neden nasıl anlamak önleme ve tedavi stratejilerini optimize etmek için önemlidir. Meningokok sepsis araştırma çoğunluğu üzerine in vitro yapılmıştırN. insan özellikten dolayı insan hücre çizgileri meningitidis. Enfeksiyon birçok yönleri bakteriyel yapışma, konakçı hücre yanıtı hem de sitokin tepkisi 6-9 de dahil olmak üzere, in vitro incelenmiştir. Tip IV pili (TFP) N. için önemli yapışma organel gibi emplikedir meningitidis epitelyal ve endotelyal hücreler 10 hem de. Ayrıca, N. bu yapışma gösterilmiştir konukçu hücrelere meningitidis kesme stresi bağımlıdır ve bu nedenle, mikrovasküler 11 kan akış hızları ile ilişkili olduğu düşünülmektedir. Bu bakteri in vivo yüz dinamik gerilmeler patogenezinde çok önemli olduğunu düşündürmektedir. Bu, in vitro olarak, küçük damarların mikro modellemek için ancak çok zordur.
Neisseria TFP için yapışma reseptörü hala bilinmemektedir ve bu nedenle, bir hayvan modelinde bakteriyel yapışmayı elde etmek için knock-in stratejileri bu anda öngörülen edilemez. CD46 TFP reseptör ve transgenik hayvanlar fare modelleri olarak hareket etmek üretildi olduğu öne sürüldü. Bununla birlikte, bu hayvanlarda enfeksiyon geniş enfeksiyona yol değildir ya da geliştirme 12,13 döküntü. Neisseria enfeksiyonun bakteremi yönü için tarif edilmiş olan diğer hayvan modelleri dikkate bir demir kaynağı 14,15 insan transferin için bakteriyel tercih alır. Insan transferin tamamlayan ya da uzun bir süre içinde kan akışında bir artış bakteri yükünde bir transgen sonuçlardan bu ifade, ancak bu model no bakteriyel yapışmayı veya döküntü gelişimini gösterir 16,17 ya.
Bu protokol, dermal mikrovasküler de dahil olmak üzere, insan derisi, farelerde bağışıklığı 18,19 üzerine transplante edildiği bir insanlaştırılmış fare modeli açıklar. Bu, fare dolaşımı ile perfüze fonksiyonel insan damarları, ile sonuçlanır. Insan transferin takviyesi ile birlikte, bu mOdel N. insan özel yönlerinden en az ikisi için hesaplar meningitidis, bir in vivo ortamda, insan endotel ve insan transferin, yani. N. meningitidis vasküler hasar ve purpurik döküntü gelişme 18 de dahil olmak üzere hastaların klinik, rapor ne benzer bir patoloji üreten, insan endotele özellikle uygun bu model damardan tanıttı.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hayvan modelleri bakteriyel patogenez araştırma önem taşımaktadır. Bu, tam olarak, hücre kültüründe in vivo ortamı taklit etmek mümkün değildir ve konukçu-patojen etkileşimi çok dinamik faktörlerden etkilenir açık hale gelmektedir. Böyle N. gibi bazı klinik olarak önemli patojenlerin, insan özgüllüğü meningitidis, HIV, HCV, Plasmodium falciparum, Listeria monocytogenes ve Salmonella typhi, bu enfeksiyonların in vivo modellerin kullanımı sınırlıdır. Biz bulaşıcı adımlar özgüllüğü katılan hangi anlamaya başlar Ancak, beşerileştirilmiş modelleri geliştirilmektedir. Burada açıklanan protokol N ile in vivo enfeksiyon geniş sağlayan, farelere insan mikrokapların tanıtımı ile bir örneğidir meningitidis, damar hasarı ve bazen purpura döküntüleri gelişimi ile sonuçlanır.
Bu modeli kullanarak,Biz TFP yapışkan özellikleri bakteri mutantlar kullanılarak ve vasküler hasar yapışma 18 yokluğunda azalır bu in vivo vasküler kolonizasyonu dahil olduğunu tanımlamak mümkün olmuştur. Daha önce, dolaşımdaki bakteriyel ürünler bu zararlardan sorumlu olmuştur ama bizim sonuçlarımız yerel yapışma ve damar kolonizasyon için belirleyici bir rol oynadığını düşündürmektedir. Bu yeni tedavi hedeflerinin geliştirilmesi için yeni olanaklar açar. Patojenik bakterilerin yapışması farmasötik bloke olabilir eğer muhtemelen dermal lezyonların gelişimini önlemek ve doku nekrozu, debridman ve amputasyon açısından meningokok mağdurları için daha iyi sonuçlara yol açabilir. Bu çalışma ayrıca, enfeksiyonun karmaşıklığı ve bağışıklık yanıtı ve pıhtılaşma kaskadı katılımını göstermiştir. Bu mevcut insan endotel 18 nispeten az miktarda rağmen enfekte edilmiş farelerin serumlarında insan sitokin sinyal tespit edilmiştir.Bu bölgeye fare bağışıklık hücresi popülasyonlarının infiltrasyonu ile birlikte, önemli bir sitokin tepkisi gösterdi.
Hayvan modelleri tabii ki tamamen insan hastalığı çoğaltmak asla ve tüm sonuçları bu düşünce ile ele alınmalıdır onlardan aldı. Örneğin, bu modelde, kan ve dolaşan hücreleri fare kökenlidir ve insan hücrelerine farklı davranabilirler bu indirim olamaz. Bunun bir avantajı, bununla birlikte, yakın yayın 18 de gösterildiği gibi, dolaşan fare hücrelerinkinden insan endotel gelen sinyalleri ayırt menşeli yeteneğidir. Bu modelde kullanılan farelerin immün plan aynı zamanda bir başka "insanlaştırılmasıdır" yönü ekleme, insan immün hücre popülasyonlarının allojenik transferini sağlayacak. Farelerin immün plan ancak tüm eksik ya da, bu modelde, kusurlu NK, T ya da B-hücreleri için bir rol maskeleyebilir. Nispeten shorBu modelde kullanılan t zaman aralığı (24 saat) esas doğuştan yanıtı ilgilidir, ancak uzun vadeli enfeksiyonları ve bağışıklık diğer seçeneklerin geliştirilmesi için keşfedilmeyi gerekebilir.
Cilt N. için önemli bir enfeksiyon sitesi meningitidis değil, insan damar nispeten küçük bir miktarına sahip olan, aynı zamanda çok sayıda organları etkileyen sistemik bir enfeksiyon için veri ekstrapolasyon zor olduğu anlamına gelir. Bu modeli dermal lezyon geliştirme çalışması için izin verir iken, bu gibi epitelyal ve kan-beyin çaprazlama olarak menengokok enfeksiyonu önemli adımlar dahil değildir. Bu insanlaştırılmış modellerin geliştirilmesi ile enfeksiyon bu yönlerini ele için gereklidir. Ancak bu model çok sayıda insan özel patojenlere, kan damarlarını hedefleyen özellikle olanlar için büyük bir potansiyel sunuyor.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar yazının eleştirel okuma için Dumenil laboratuara tüm üyelerini, özellikle Silke Silva teşekkür etmek istiyorum. Hôpital Européen Georges-Pompidou (HEGP), Dr David Maladry de cerrahi bölümü. Michael Hivelin ve Dr Patrick Bruneval, HEGP de Patoloji Anabilim Dalı. Elizabeth Huc başkanlığındaki PARCC at hayvan tesis. Bu çalışma aşağıdaki hibe kuruluşları tarafından desteklenen: Marie Curie İEF dostluk yok. 273223 (KM), İNSERM den ATIP-Avenir Grant, CODDIM ekipman hibe (Ile de France Bölge), FRM ekipman hibe, mükemmellik konsorsiyum IBEID Laboratuvarı (fondation la recherche Médicale dökmek), ANR hibesi "(Agence Nationale la Recherche dökmek) Bugs-in-flow ". Maliyeciler, çalışma tasarımı, veri toplama ve analizi, yayınlamak kararı, ya da yazının hazırlanmasında herhangi bir rolü vardı.
Materials
| DMEM | Gibco Invitrogen | 31885-023 | |
| Phosphate buffered saline | Gibco Invitrogen | 10010-056 | |
| Ketamine 500 | Virbac France | LOT N°VAL4243 | |
| Xylazine | Bayer Healthcare | AMM N° FR/8146715 2/1980 | LOT N° KPO809S |
| (Rompun 2%) | |||
| Optigel | Europhta | Medicament autorisé N°3400933521134 | |
| Lacrigel | |||
| Tronothane | Lisa Pharma | ||
| GC agar Base | Conda | 1106 | |
| Human endothelium SFM media | Gibco Invitrogen | 11111 | |
| Fetal bovine serum | P A A | A15-101 | |
| Human transferrin | Sigma-Aldrich | T3309 | |
| UEA lectin – rhodamine | Vector Labs | RL-1062 | |
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich | H9627 | |
| Eosin | Sigma-Aldrich | E4009 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 534056 | |
| Humeca BV, Holland | 4.SB01 | ||
| Equiptment Name | Company | Catalogue Number | |
| Sober Hand Dermatome | Humeca BV, Holland | 4.SB01 | |
| Animal housing | Innovive | M-BTM-C8 | |
| Biopsy punch (4 mm) | Dominic Dutscher | 30737 | |
| Fast-Prep lysing matrix M tubes | MP Bio | 116923050 | |
| MagNA Lyzer Green Beads | Roche | 3358941001 | |
| MagNA Lyzer | Roche | 3358976001 | |
| Vectashield mounting media | Vector Labs | H-1000 | |
| Vetbond | 3M | 1469SB | Tissue Glue |
| OCT tissue tek | Sakura | 4583 |
References
- Davis, C. E., Arnold, K. Role of meningococcal endotoxin in Meningococcal purpura. J. Exp. Med. 140, 159-171 (1974).
- Mairey, E., et al. Cerebral microcirculation shear stress levels determine Neisseria meningitidis attachment sites along the blood-brain barrier. J. Exp. Med. 203, 1939-1950 (2006).
- Brandtzaeg, P., van Deuren, M. Classification and pathogenesis of meningococcal infections. Methods Mol. Biol. 799, 21-35 (2012).
- Guarner, J., et al. Pathogenesis and diagnosis of human meningococcal disease using immunohistochemical and PCR assays. Am. J. Clin. Pathol. 122, 754-764 (2004).
- Hill, W. R., Kinney, T. D. The cutaneous lesions in acute meningococcemia; a clinical and pathologic study. J. Am. Med. Assoc. 134, 513-518 (1947).
- Capecchi, B., et al. Neisseria meningitidis NadA is a new invasin which promotes bacterial adhesion to and penetration into human epithelial cells. Mol. Microbiol. 55, 687-698 (2005).
- Merz, A. J., Enns, C. A., So, M. Type IV pili of pathogenic Neisseriae elicit cortical plaque formation in epithelial cells. Mol. Microbiol. 32, 1316-1332 (1999).
- Morand, P. C., Tattevin, P., Eugene, E., Beretti, J. L., Nassif, X. The adhesive property of the type IV pilus-associated component PilC1 of pathogenic Neisseria is supported by the conformational structure of the N-terminal part of the molecule. Mol. Microbiol. 40, 846-856 (2001).
- Taha, M. K. Neisseria meningitidis induces the expression of the TNF-alpha gene in endothelial cells. Cytokine. 12, 21-25 (2000).
- Kirchner, M., Meyer, T. F. The PilC adhesin of the Neisseria type IV pilus-binding specificities and new insights into the nature of the host cell receptor. Mol. Microbiol. 56, 945-957 (2005).
- Mikaty, G., et al. Extracellular bacterial pathogen induces host cell surface reorganization to resist shear stress. PLoS Pathog. 5, (2009).
- Johansson, L., et al. CD46 in meningococcal disease. Science. 301, 373-375 (2003).
- Kirchner, M., Heuer, D., Meyer, T. F. CD46-independent binding of Neisserial type IV pili and the major pilus adhesin, PilC, to human epithelial cells. Infect. Immun. 73, 3072-3082 (2005).
- Noinaj, N., et al. Structural basis for iron piracy by pathogenic Neisseria. Nature. 483, 53-58 (2012).
- Schryvers, A. B., Gonzalez, G. C. Receptors for transferrin in pathogenic bacteria are specific for the host’s protein. Can. J. Microbiol. 36, 145-147 (1990).
- Oftung, F., Lovik, M., Andersen, S. R., Froholm, L. O., Bjune, G. A mouse model utilising human transferrin to study protection against Neisseria meningitidis serogroup B induced by outer membrane vesicle vaccination. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 26, 75-82 (1999).
- Zarantonelli, M. L., et al. Transgenic mice expressing human transferrin as a model for meningococcal infection. Infect. Immun. 75, 5609-5614 (2007).
- Melican, K., Michea Veloso, P., Martin, T., Bruneval, P., Dumenil, G. Adhesion of Neisseria meningitidis to dermal vessels leads to local vascular damage and purpura in a humanized mouse model. PLoS Pathog. 9, (2013).
- Murray, A. G., et al. Human T-cell-mediated destruction of allogeneic dermal microvessels in a severe combined immunodeficient mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 9146-9150 (1994).
- Nassif, X., et al. Antigenic variation of pilin regulates adhesion of Neisseria meningitidis to human epithelial cells. Mol. Microbiol. 8, 719-725 (1993).
- Geoffroy, M. C., Floquet, S., Metais, A., Nassif, X., Pelicic, V. Large-scale analysis of the meningococcus genome by gene disruption: resistance to complement-mediated lysis. Genome Res. 13, 391-398 (2003).
- Ho, M., Hickey, M. J., Murray, A. G., Andonegui, G., Kubes, P. Visualization of Plasmodium falciparum-endothelium interactions in human microvasculature: mimicry of leukocyte recruitment. J. Exp. Med. 192, 1205-1211 (2000).
