微小血管系を対象に細菌感染を研究するためのヒト化マウスモデル

1。リスクと権限 地元の倫理委員会は、すべての動物のプロトコルを承認する必要があります。このプロトコルは、フランスやヨーロッパの実験動物の管理と使用に関する規制（Décrets87から848、2001から464、2001から486及び2001から131とによって確立されたガイドラインに基づいて実施された欧州指令2010/63/UE）とローカル倫理委員化委員会D'ETHIQUEエンマチエールD'実験ANIMALE、大学パリデカルト 、パリ、フランスで承認した。いいえ：CEEA34.GD.002.11ん。 人間の肌のために、書面による通知を患者の同意を得て、すべての手順は、フランス国のガイドラインに従って実施し、地域の倫理委員会、 化委員会D'評価ETHIQUEドゥINSERM IRB 00003888 FWA 00005881、パリ、フランス世論によって承認された：11から048 。 髄膜炎菌は、潜在的に有害な人間の病原体であるとORGAを取り扱う際に必要なすべての予防措置が取られなければならないNISM。これらの注意事項は、ワクチン接種が含まれており、バイオセーフティレベル2の条件の下で働く。 2。皮膚移植できるだけ時間をグラフトに近い人間の皮膚を収集します。本研究では、皮膚の大部分は、腹部領域に関連する整形手術操作から来ている。乳房、脚、さらには顔の他のソースは、成功を収めて使用されている。 好ましい流フードの下で、70％エタノールで皮膚表面を洗浄し、十分に洗浄された表面上に平らに横たわっによりヒト皮膚のサンプルを準備します。 プリセット厚さの皮膚分節を用いて皮膚の上から200〜400程度のスライスをスライス。 短期保存のための10％血清（3-12時間で、すぐにまたはDMEM中で4℃、グラフト化する場合には整合性のために、皮膚のスライスを確認し、2センチメートル×2センチメートルの正方形に切ると、（二価の陽イオンを含まない）PBS中に置く）。 ケタミン（100 mg / kgの）およびキシラジン（10 mg / kg）の麟蹄で6〜8週齢のSCID.bgマウス（約20g）を麻酔しCTED IP マウスを麻酔した後、つま先のピンチ、痛みの反射を確立するための標準的な方法を実行することによって、疼痛反応をチェック。角膜の乾燥を防ぎ、移植片が配置される肩の後ろに動物の左側を剃ることを目にゲルを適用します。作業中はヒートパッド上でマウスを暖かく保つ。 手術のためにマウスを準備中した後、70％EtOHで剃毛エリアを清掃してください。 移植部位（Tronothane）に局所局所麻酔を適用し、慎重に湾曲したハサミでマウスの皮膚の表層を除去することにより、移植部位を準備します。基礎となる血管系を破壊しないように注意してください。 人間の皮膚切片の面積より少し小さい面積で皮膚を取り除きます。 PBS（またはDMEM）から肌のスライスを削除し、移植床の上に置いて、表皮側が上を向いている保証されます。ステップ2.8から2.10に移植床が乾燥しない確実に、可能な限り迅速に行うべきである。 1角を合わせまたはEDGEおよび組織接着剤で固定します。慎重にエッジの周りに組織接着剤の少量を配置し、移植床に皮膚スライスの残りに合う。いつものサイズに、ヒトの皮膚をトリミングではなく、移植床を大きくしてください。 マウスの皮膚は非常に柔軟であるとして移植床の上にきつすぎる肌を引っ張らないでください。 移植片は各コーナーにおける組織接着剤で固定されていることを確認します。 ヨウ素溶液で領域をきれいにします。 移植片の上にクッション面積でバンドエイドを適用します。バンドエイドが企業が、タイトではなく、動物の呼吸に影響を与えないことを確認してください。 ドレッシングテープでバンドエイドを修正します。 動物は暖かい表面に回復することができます。 目を覚ましたら、そのケージに動物を返します。動物はケージ当たり2-3に収容されている。 痛みや苦痛の徴候のための回復中に定期的にマウスを確認してください。 10〜14日、移植後、移植片を破壊しないように注意しながら、バンドエイドを削除します。我々の経験では、術後の痛みはミニですMAL。それにもかかわらず、動物は操作の後、数日、特に毎日監視する必要があります。痛みや苦痛の基準は以下の通りである。 10パーセント以上の重量の損失物理的な外観、毛皮、せむしの位置、目増加呼吸や心臓の料金減少または異常な動き。 体温の上昇場合、疼痛の兆候が検出されたparacetamoleが（300 mg / kgを、4時間毎）を経口投与する。痛みが続く場合は人道的なエンドポイントは厳密に接着されている。 移植片が乾燥して見える場合はしなやかな肌を保つために2〜3日ごとにベビーオイルを適用します。 移植片は、実験21日後に移植のための準備ができています。 3。感染感染の前日には、適切な抗生物質を含むGCB寒天プレート上にストリークした細菌株を準備します。 5％CO 2中で37℃で一晩増殖させる。 細菌の準備 <ol> OD 600は0.05〜10％血清を有するヒト内皮SFM培地5mlのにReinoculate細菌。 緩い蓋をインキュベーターで2時間（37℃、5％のCO 2）振とうしながら、約OD 600 0.1の細菌密度まで、インキュベートする。 3分15,000 rpmで細菌を遠心分離する。 PBS中の上清と再懸濁を削除し、再度遠心する。 二回の洗浄ステップ（2.2.4-2.2.5）を繰り返します。 PBSに細菌ペレットを再懸濁します。 OD 600を測定します。 OD 600 0.1（10 8 CFU / ml）のいずれかの培養物、またはOD 600 1.0（10 9 CFU / ml）を作る。この既知の濃度から、10 7 CFU / mlに希釈する。できるだけ噴射時間に近い細菌を準備してみてください。 マウス マウスを秤量する。 ケタミン（100 mg / kg）を、およびキシラジンでマウスを麻酔し（10 mg / kg）を腹腔内注射一度眠って、C一体その疼痛反応は、熱パッドで暖かくマウスを保ち、乾燥を防ぐために眼軟膏を入れ、つま先のピンチによっては存在しない。 各マウスに食塩水またはPBSに再懸濁ヒトトランスフェリン8mgのを与える、腹腔内注射尾からの血液の小滴を取り、血液が感染前に滅菌されているチェックする寒天プレート上に広げた。 静脈内に後眼窩または尾静脈から100μlを10 7 CFU / mlの細菌培養（10 6 CFUの合計）を注入。 5分後に注射を取っCFUの測定値に関係なく、注射部位に一致している。 数分後、尾の端を切り取ると、すぐに感染後の血中のCFUを確立するための1 10倍希釈して、適切な抗生物質を含む寒天プレート上に血液サンプルを広げた。 組織接着剤で尾を封印。 注入後、細菌接種を希釈し、CFUを確立するために、適切な抗生物質を含む寒天プレート上に広げた。 マウスを許可する彼らが移動になるまでヒートパッド上で回復さ 6時間感染後に、尾部から少量の血液を引き出す希釈し、6時間後にCFUを確立するためにプレート。 CO 2で一晩5％で37℃で、すべての寒天プレートをインキュベートする。 4。犠牲感染の選択された時に、ケタミン（100 mg / kg）をおよびキシラジンでマウスを麻酔した（10mg / kg）を腹腔内注射眠っていると、熱パッドでマウスを暖かく保つ。 痛みの反射が（つま先のピンチを）行っているときは、尾の先端を切り取ると血を引く。 適切な抗生物質を含む寒天プレート上に血液を広め、5μlの直接およびCFUを確立するために、10μlの1:10希釈。 頚椎脱臼によりマウスを生け贄に捧げる。 すべての関連機関および倫理指針に従ってマウスを犠牲にした後に、ハートビートの欠如によって死亡が確認された。正中切開を行い、胸郭を切って、聞くに切開するT。 滅菌チューブの心臓/胸腔と場所からできるだけ多くの血液を採取する。 無菌プレートに臓器（ 例えば 、肝臓、脾臓、脳）を取り外します。 無菌プレートに皮膚移植およびマウスの皮膚のセクションを削除します。 マウス本体を処分。 採取した血液を15分間凝固させされた後、3,000 rpmで15分間遠心分離して。 ELISAまたはFACSベースの方法によるサイトカインの検出については、例えば、後の分析のために-80℃で、血液やストアから血漿を除去。 5。臓器CFU計数各生検の前のサンプルを取ることに500μlのPBSを含む管を均質化量る。 無菌の生検パンチを使用して各組織から4mmの生検サンプルを取る。 500μlのPBSを含む予め秤量均質化チューブに置いて生検。他の臓器には小さいビーズを使用し、2mmのビーズを用いて皮膚試料をホモジナイズする。 残りのTを配置顕微鏡検査のために4℃で4％パラホルムアルデヒド（PFA）およびストア内の問題（以下参照）。 （CFU / mgの組織のそれ以降の計算のために）生検の重量を確立するための生検を含むチューブを均質化量る。 サンプルを均質化する。 30秒間6,000 rpmで、肝臓、脾臓および脳を均質化する。 30秒間6,000 rpmで皮膚サンプルを均質化し、必要に応じて繰り返します。 寒天プレート上に各均質化チューブから希釈液を広げ、器官CFUカウントを確立するために、5％CO 2中で37℃で一晩増殖する。 6。組織学/免疫組織化学 固定 4℃で一晩4％PFA中の組織を修正しました。固定工程は長くなる場合があり、長期間保存するには、0.25％PFAで組織を配置した場合。 PBSに組織を洗い流してから、20％ショ糖溶液中に置き、一晩または組織が溶液中に沈んするまで4℃に戻ります。 （組織型の中で、またはベースボードに接着さのいずれか）のサイズと10月溶液中の場所にカットし、PBS中で組織を洗浄します。 すぐに液体窒素中に浮遊するペトリ皿上で組織を凍結する。 凍結後、保存のために-80℃に移す前に、ドライアイスの上に組織を置く。 スライシング -80°Cから組織を取り出して、クライオスタットに-20℃に平衡化させる。 スライス約10〜15ミクロンの厚さの組織とは、コーティングされた顕微鏡スライド上に配置します。 必要になるまでストアは-20℃でスライドさせる。 染色 スライドを室温に戻します。 疎水性のペンでスライド上のスライスを中心に描く。 5〜10分待ちます。 5分間PBS中/洗浄スライスを再水和、二回繰り返します。 10分間、PBS中0.1％トリトンにおける透過処理スライス。 5分間、PBS 2〜3倍に洗浄します。 PBS中のブロック10〜60分の間で使用される抗体又は汚れに応じて0.1％トリトン1％BSA。 ブロッキングバッファー外し、ブロックバッファに必要に応じて希釈した一次抗体を加える。決められた時間インキュベートする。 （多くの場合、室温で1時間、または一晩4℃）。 5分間、PBS 2〜3倍に洗浄します。 ボックバッファ内の適切に希釈した二次抗体を適用し、DAPIは、一般的に、このステップに含まれています。暗闇の中で、決められた時間、多くの場合、1〜2時間室温でインキュベート。 5分間、PBS 2〜3倍に洗浄します。 マニキュアでカバーガラスとシールで封入剤を保護するフェードインマウント。 4℃でのイメージ染色スライド直ちにまたはストア使用蛍光団への適切なフィルター/レーザーを使用して設定または共焦点蛍光顕微鏡で撮影を行う。 組織学 スライドを室温になるまで組織学のために使用することができます。 として使用して染色スライドtandardヘマトキシリン​​/エオシン染色プロトコル。 スライドラックにスライドを置きます。 次の順序でソリューション間のスライドラックを移す。 水道水に2秒。 フィルタリングヘマトキシリン​​溶液中で3分。 流水に10秒。 蒸留水に10秒。 エタノール100パーセントに10秒。 フィルタリングエオシンに2秒。 流水に10秒。 エタノール100パーセントに10秒キシレン×3（バスI、II、III）に2分。 すぐに転送して、各スライド上にトップの上に置いてカバースリップを固定接着剤を数滴を追加し、気泡を除去、数時間乾燥させます。 画像は、標準的な白色光顕微鏡下でスライドする。