أنسنة نموذج الفأر لدراسة الالتهابات البكتيرية استهداف الأوعية الدموية الدقيقة
Summary
النيسرية السحائية هو الممرض الذي يصيب الإنسان محددة الأوعية الدموية. في هذا البروتوكول يتم تقديمها microvessels الإنسان في الماوس عن طريق تطعيم الجلد البشري على الفئران المناعة. البكتيريا الالتزام على نطاق واسع في الأوعية الإنسان، مما يؤدي إلى تلف الأوعية الدموية وتطوير الطفح الفرفري احظ عادة في الحالات البشرية.
Abstract
النيسرية السحائية يسبب شديدة، وتعفن الدم قاتلة في كثير من الأحيان عندما يدخل مجرى دم الإنسان. العدوى يؤدي إلى أضرار واسعة النطاق في الأوعية الدموية مما يؤدي إلى تسرب الأوعية الدموية، وتطوير طفح فرفرية ونخر الأنسجة في نهاية المطاف. دراسة التسبب في هذا المرض كان محدودا من قبل خصوصية الإنسان من البكتيريا، الأمر الذي يجعل من الصعب في النماذج الحية. في هذا البروتوكول، ونحن تصف نموذجا أنسنة لهذا المرض الذي جلد الإنسان، التي تحتوي على microvessels الجلدي، وتطعم الفئران المناعة. هذه السفن يفاغر مع تداول الماوس مع الحفاظ على خصائص الإنسان. مرة واحدة أدخلت هذا النموذج، N. السحائية الالتزام حصرا لسفن الإنسان، مما أدى إلى تلف الأوعية الدموية واسعة، والتهاب في بعض الحالات تطور الطفح الفرفري. يصف هذا البروتوكول الخطوات التطعيم، والعدوى وتقييم هذا النموذج في كونتيXT من N. الإصابة السحائية. ويمكن تطبيق هذه التقنية في العديد من مسببات الأمراض التي تصيب الإنسان محددة مجرى الدم.
Introduction
الإنتان هو عدوى المكورات السحائية الدم ولد قاتلة في كثير من الأحيان الناجمة عن مسببات الأمراض البكتيرية التهاب السحايا النيسيري. مرضى الإنتان المكورات السحائية غالبا ما تكون موجودة مع طفح دموية صغيرة أو برفريا على الجلد الذي سبق المرتبطة تدمير الأوعية الدموية التي تسببها البكتيريا المنتشرة والمنتجات البكتيرية 1. خزعات الجلد من المرضى السريرية تظهر البكتيريا المرتبطة microvessels، وغالبا ما يملأ الأوعية 2. وبصرف النظر عن تسرب البكتيريا والجلطة واسعة النطاق، تجلط الدم، واحتقان الأوعية الدموية وينظر في المناطق الفرفري 3-5. هذا تلف الأوعية الدموية يمكن أن يؤدي إلى نخر واسعة من الجلد والأنسجة المحيطة بها، مما أدى إلى بتر التنضير وحتى في الناجين السحائية. فهم كيف يسبب عدوى هذا الضرر الأوعية الدموية مهم لتحسين استراتيجيات الوقاية والعلاج. وقد أجريت غالبية الأبحاث على الإنتان المكورات السحائية في المختبر علىخطوط الخلايا البشرية نظرا لخصوصية الإنسان من N. السحائية. وقد تم دراسة العديد من الجوانب العدوى في المختبر بما في ذلك التصاق البكتيريا، استجابة الخلية المضيفة، وكذلك استجابة خلوى 6-9. النوع الرابع الشعرة (TFP) قد تورطت كما عضية التصاق الرئيسية للN. السحائية على كل من الخلايا الظهارية والبطانية 10. وقد تبين أيضا أن التصاق N. السحائية إلى الخلايا المضيفة هو إجهاد القص تعتمد وبالتالي يعتقد أن لهما صلة معدلات تدفق الدم في الأوعية الدموية الدقيقة 11. هذا يشير إلى الضغوط الحيوية مواجهة البكتيريا في الجسم الحي تعتبر حاسمة بالنسبة لإمراض. غير أنه من الصعب جدا لنموذج المكروية من السفن الصغيرة في المختبر.
مستقبلات الالتصاق لالنيسيري البرلمان الاتحادي الانتقالي لا يزال مجهولا، وبالتالي الضربة القاضية في الاستراتيجيات الرامية إلى تحقيق التصاق البكتيريا في نموذج حيواني لا يمكن تصور في هذا الوقت. واقترح أن تكون CD46 تم إنتاج مستقبلات TFP والحيوانات المعدلة وراثيا لتكون بمثابة نماذج الماوس. ومع ذلك، لا تؤدي العدوى في هذه الحيوانات للإصابة واسعة أو طفح 12،13 التنمية. النماذج الحيوانية الأخرى التي تم وصفها من الناحية تجرثم الدم من العدوى النيسرية تأخذ في الاعتبار تفضيل البكتيرية لترانسفيرين الإنسان كمصدر للحديد 14،15. إما المكمل ترانسفيرين الإنسان أو التعبير عن ذلك من نتائج التحوير في زيادة الحمولة الجرثومية في مجرى الدم على مدى فترة زمنية طويلة، ولكن هذا النموذج لا يظهر التصاق البكتيريا أو تطوير طفح 16،17.
في هذا البروتوكول، ونحن تصف نموذج الفأر أنسنة التي يتم فيها زرع جلد الإنسان، بما في ذلك الأوعية الدموية الدقيقة الجلدي، على الفئران المناعة 18،19. هذه النتائج في الأوعية الإنسان وظيفية، مع perfused تداول الماوس. جنبا إلى جنب مع مكملات ترانسفيرين الإنسان، وهذا محسابات مركز Odel لاثنين على الأقل من جوانب محددة من الإنسان N. السحائية، أي البطانة الإنسان وترانسفيرين الإنسان، في بيئة الجسم الحي. N. قدم السحائية عن طريق الوريد في هذا النموذج الالتزام على وجه التحديد إلى البطانة الإنسان، مما ينتج عنه أمراض مشابهة لما ورد في المرضى السريرية، بما في ذلك الضرر الأوعية الدموية والتنمية طفح الفرفري 18.
Protocol
Representative Results
Discussion
النماذج الحيوانية هي ذات أهمية حاسمة لبحث المرضية البكتيرية. فمن المستحيل أن تحاكي تماما البيئة في الجسم الحي في خلية ثقافة وبات من الواضح أن التفاعل المضيف الممرض يتأثر العديد من العوامل الديناميكية. خصوصية الإنسان من بعض مسببات الأمراض الهامة سريريا، مثل N. السحائية، فيروس نقص المناعة البشرية والتهاب الكبد C، المتصورة المنجلية، المستوحدة الليستيريا، والسالمونيلا التيفية ويقتصر استخدام في الجسم الحي نماذج لهذه الالتهابات. لكن، وكما أن نبدأ في فهم الخطوات التي تشارك المعدية في خصوصية، ويجري حاليا وضع نماذج أنسنة. بروتوكول الموصوفة هنا هو دليل على هذا مع الأخذ microvessels الإنسان في الفئران، مما يسمح للعدوى واسعة في الجسم الحي مع N. السحائية، مما أدى إلى تلف الأوعية الدموية وأحيانا تطور الطفح الجلدي الفرفري.
باستخدام هذا النموذج،كنا قادرين على تحديد أن خصائص لاصقة من البرلمان الاتحادي الانتقالي يشاركون في الاستعمار الأوعية الدموية في الجسم الحي باستخدام المسوخ البكتيرية والتي يتم تقليل تلف الأوعية الدموية في غياب التصاق 18. سابقا، قد تورطت تعميم المنتجات البكتيرية في هذا الضرر ولكن تشير نتائجنا دورا حاسما للالتصاق المحلية والاستعمار الأوعية الدموية. هذا يفتح آفاقا جديدة لتطوير أهداف العلاج الرواية. إذا يمكن أن يكون قد تم حظره من التصاق البكتيريا المسببة للأمراض صيدلي يمكن أن ربما منع تطور آفات الجلد وتؤدي إلى نتائج أفضل للناجين من المكورات السحائية من حيث نخر الأنسجة، التنضير وبتر الأطراف. وقد أظهرت أعمال أيضا تعقيد العدوى وإشراك الاستجابة المناعية والتخثر تتالي. حددنا إشارات خلوى الإنسان في مصل الفئران المصابة على الرغم من كمية صغيرة نسبيا من البطانة الإنسان الحاضر 18.وأشارت هذه استجابة كبيرة خلوى، جنبا إلى جنب مع تسلل الفأر السكان الخلايا المناعية في المنطقة.
يمكن أن النماذج الحيوانية بالطبع أبدا تكرار بالكامل الأمراض التي تصيب البشر وحصل كل النتائج منها يجب النظر مع هذا في الاعتبار. على سبيل المثال، في هذا النموذج الدم والخلايا المنتشرة هي من أصل الماوس ونحن لا نستبعد أنها قد تتصرف بشكل مختلف للخلايا البشرية. ميزة هذا ومع ذلك، كما هو موضح في منشور صدر مؤخرا لدينا 18، هو القدرة على التفريق إشارة تنشأ من البطانة الإنسان من أن من خلايا فأر المنتشرة. ان الخلفية المناعة من الفئران المستخدمة في هذا النموذج يسمح أيضا لنقل خيفي من السكان الخلايا المناعية البشرية، إضافة 'أنسنة' جانب آخر. لكن الخلفية المناعة من الفئران قد تخفي دور للNK، T أو B الخلايا، التي تفتقر إلى كل أو خلل في هذا النموذج. والشور نسبيار زمني (24 ساعة) المستخدمة في هذا النموذج تتعلق أساسا استجابة فطرية، ولكن لالتهابات على المدى الطويل، ووضع حصانة الخيارات الأخرى قد تحتاج إلى من يكتشفها.
الجلد هو موقع الإصابة المهم بالنسبة N. السحائية ولكن وجود كمية صغيرة نسبيا من السفن الإنسان يعني أيضا أن استقراء البيانات إلى العدوى النظامية التي تنطوي على العديد من الأجهزة أمر صعب. في حين أن هذا النموذج يسمح لدراسة التنمية الآفة الجلدية، ليست مدرجة الخطوات الهامة للعدوى المكورات السحائية مثل الظهارية والدم في الدماغ المعبر. هناك حاجة إلى مواصلة تطوير هذه النماذج أنسنة لمعالجة هذه الجوانب الأخرى من العدوى. ومع ذلك يقدم هذا النموذج إمكانات كبيرة للعديد من مسببات الأمراض المحددة الإنسان، لا سيما تلك التي تستهدف الأوعية الدموية.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
فإن الكتاب أود أن أشكر جميع أعضاء المختبر Dumenil، ولا سيما سيلك سيلفا لقراءة نقدية للمخطوطة. قسم الجراحة في مستشفى Hôpital EUROPEEN جورج بومبيدو-(HEGP)، والدكتور ديفيد Maladry. مايكل Hivelin والدكتور باتريك Bruneval، قسم علم الأمراض في HEGP. مرفق الحيوانية في PARCC، برئاسة إليزابيث HUC. وأيد هذا العمل من قبل وكالات منحة التالي: ماري كوري الزمالة منتدى الطاقة الدولي لا. 273223 (KM)، ATIP-أفينير منحة من INSERM، المعدات CODDIM منحة (إيل دو فرانس المنطقة)، FRM (مؤسسة بحوث صب لا MEDICALE) منحة المعدات، مختبر IBEID التميز الكونسورتيوم ANR (الوكالة الوطنية صب لا بحوث) منحة " الخلل في والتدفق ". كان الممولين أي دور في تصميم الدراسة وجمع البيانات والتحليل، وقرار نشر أو إعداد المخطوطة.
Materials
| DMEM | Gibco Invitrogen | 31885-023 | |
| Phosphate buffered saline | Gibco Invitrogen | 10010-056 | |
| Ketamine 500 | Virbac France | LOT N°VAL4243 | |
| Xylazine | Bayer Healthcare | AMM N° FR/8146715 2/1980 | LOT N° KPO809S |
| (Rompun 2%) | |||
| Optigel | Europhta | Medicament autorisé N°3400933521134 | |
| Lacrigel | |||
| Tronothane | Lisa Pharma | ||
| GC agar Base | Conda | 1106 | |
| Human endothelium SFM media | Gibco Invitrogen | 11111 | |
| Fetal bovine serum | P A A | A15-101 | |
| Human transferrin | Sigma-Aldrich | T3309 | |
| UEA lectin – rhodamine | Vector Labs | RL-1062 | |
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich | H9627 | |
| Eosin | Sigma-Aldrich | E4009 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 534056 | |
| Humeca BV, Holland | 4.SB01 | ||
| Equiptment Name | Company | Catalogue Number | |
| Sober Hand Dermatome | Humeca BV, Holland | 4.SB01 | |
| Animal housing | Innovive | M-BTM-C8 | |
| Biopsy punch (4 mm) | Dominic Dutscher | 30737 | |
| Fast-Prep lysing matrix M tubes | MP Bio | 116923050 | |
| MagNA Lyzer Green Beads | Roche | 3358941001 | |
| MagNA Lyzer | Roche | 3358976001 | |
| Vectashield mounting media | Vector Labs | H-1000 | |
| Vetbond | 3M | 1469SB | Tissue Glue |
| OCT tissue tek | Sakura | 4583 |
References
- Davis, C. E., Arnold, K. Role of meningococcal endotoxin in Meningococcal purpura. J. Exp. Med. 140, 159-171 (1974).
- Mairey, E., et al. Cerebral microcirculation shear stress levels determine Neisseria meningitidis attachment sites along the blood-brain barrier. J. Exp. Med. 203, 1939-1950 (2006).
- Brandtzaeg, P., van Deuren, M. Classification and pathogenesis of meningococcal infections. Methods Mol. Biol. 799, 21-35 (2012).
- Guarner, J., et al. Pathogenesis and diagnosis of human meningococcal disease using immunohistochemical and PCR assays. Am. J. Clin. Pathol. 122, 754-764 (2004).
- Hill, W. R., Kinney, T. D. The cutaneous lesions in acute meningococcemia; a clinical and pathologic study. J. Am. Med. Assoc. 134, 513-518 (1947).
- Capecchi, B., et al. Neisseria meningitidis NadA is a new invasin which promotes bacterial adhesion to and penetration into human epithelial cells. Mol. Microbiol. 55, 687-698 (2005).
- Merz, A. J., Enns, C. A., So, M. Type IV pili of pathogenic Neisseriae elicit cortical plaque formation in epithelial cells. Mol. Microbiol. 32, 1316-1332 (1999).
- Morand, P. C., Tattevin, P., Eugene, E., Beretti, J. L., Nassif, X. The adhesive property of the type IV pilus-associated component PilC1 of pathogenic Neisseria is supported by the conformational structure of the N-terminal part of the molecule. Mol. Microbiol. 40, 846-856 (2001).
- Taha, M. K. Neisseria meningitidis induces the expression of the TNF-alpha gene in endothelial cells. Cytokine. 12, 21-25 (2000).
- Kirchner, M., Meyer, T. F. The PilC adhesin of the Neisseria type IV pilus-binding specificities and new insights into the nature of the host cell receptor. Mol. Microbiol. 56, 945-957 (2005).
- Mikaty, G., et al. Extracellular bacterial pathogen induces host cell surface reorganization to resist shear stress. PLoS Pathog. 5, (2009).
- Johansson, L., et al. CD46 in meningococcal disease. Science. 301, 373-375 (2003).
- Kirchner, M., Heuer, D., Meyer, T. F. CD46-independent binding of Neisserial type IV pili and the major pilus adhesin, PilC, to human epithelial cells. Infect. Immun. 73, 3072-3082 (2005).
- Noinaj, N., et al. Structural basis for iron piracy by pathogenic Neisseria. Nature. 483, 53-58 (2012).
- Schryvers, A. B., Gonzalez, G. C. Receptors for transferrin in pathogenic bacteria are specific for the host’s protein. Can. J. Microbiol. 36, 145-147 (1990).
- Oftung, F., Lovik, M., Andersen, S. R., Froholm, L. O., Bjune, G. A mouse model utilising human transferrin to study protection against Neisseria meningitidis serogroup B induced by outer membrane vesicle vaccination. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 26, 75-82 (1999).
- Zarantonelli, M. L., et al. Transgenic mice expressing human transferrin as a model for meningococcal infection. Infect. Immun. 75, 5609-5614 (2007).
- Melican, K., Michea Veloso, P., Martin, T., Bruneval, P., Dumenil, G. Adhesion of Neisseria meningitidis to dermal vessels leads to local vascular damage and purpura in a humanized mouse model. PLoS Pathog. 9, (2013).
- Murray, A. G., et al. Human T-cell-mediated destruction of allogeneic dermal microvessels in a severe combined immunodeficient mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 9146-9150 (1994).
- Nassif, X., et al. Antigenic variation of pilin regulates adhesion of Neisseria meningitidis to human epithelial cells. Mol. Microbiol. 8, 719-725 (1993).
- Geoffroy, M. C., Floquet, S., Metais, A., Nassif, X., Pelicic, V. Large-scale analysis of the meningococcus genome by gene disruption: resistance to complement-mediated lysis. Genome Res. 13, 391-398 (2003).
- Ho, M., Hickey, M. J., Murray, A. G., Andonegui, G., Kubes, P. Visualization of Plasmodium falciparum-endothelium interactions in human microvasculature: mimicry of leukocyte recruitment. J. Exp. Med. 192, 1205-1211 (2000).
