Humanized мышь моделью для изучения Бактериальные инфекции Ориентация микрососудов
Summary
Neisseria Meningitidis является человеком специфических патогенов, который инфицирует кровеносные сосуды. В этом протоколе человека микрососудов вводят в мыши путем прививки человеческую кожу на ослабленным иммунитетом мышей. Бактерии придерживаться широко для человеческого сосудов, что приводит к повреждения сосудов и развития пурпура сыпи обычно наблюдается в случаях заболевания людей.
Abstract
Neisseria Meningitidis вызывает тяжелое, часто фатальное сепсис, когда он попадает в кровь человека. Инфекция приводит к обширным повреждением кровеносных сосудов приводит к сосудистой утечки, развитие пурпура сыпи и некроза возможного ткани. Изучение патогенеза этой инфекции ранее был ограничен человеческой специфики бактерий, что делает в моделях естественных условиях трудно. В этом протоколе, мы описываем гуманизированную модель для этой инфекции, в котором человеческая кожа, содержащая кожные микрососудов, прививается на ослабленным иммунитетом мышей. Эти суда анастомозируют с обращением мыши, сохраняя при этом свои человеческие качества. Как только вводится в этой модели, N. Meningitidis придерживаться исключительно человеческих сосудов, что приводит к обширным повреждения сосудов, воспаления и в некоторых случаях развитие пурпура сыпи. Этот протокол описывает прививки, инфекции и оценки этапы этой модели в КонтеXT от N. Meningitidis инфекции. Методика может быть применена к многочисленным человеческим конкретных патогенов, которые инфицируют в кровоток.
Introduction
Менингококковая сепсис часто смертельным крови родился инфекция, вызванная бактериальным патогеном Neisseria менингита. Менингококковые пациенты сепсис часто присутствует с петехиальной или пурпура сыпь на коже, которая ранее была связана с сосудистой разрушений, вызванных циркулирующих бактерий и бактериальных продуктов 1. Кожные биопсии из клинических пациентов показывают бактерии, связанные с микрососудов, часто заполнения через сосуды 2. Помимо утечки бактерий, обширные тромбоза, коагуляции, перегрузки и сосудов наблюдается в пурпура регионах 3-5. Это повреждение сосудов может привести к обширным некрозом кожи и окружающих тканей, что приводит к санации и даже ампутации в менингококковой выживших. Понимание того, как инфекция вызывает этот повреждения сосудов важно для оптимизации стратегии по профилактике и лечению. Большинство исследований по менингококковой сепсисе была выполнена в пробирке начеловеческие клеточные линии, связанные с человеческой специфики N. Meningitidis. Многие аспекты инфекции были изучены в пробирке в том числе бактериальной адгезии, ответ клетки-хозяина, а также цитокинов ответ 6-9. Тип IV пили (TFP) были вовлечены в качестве основного адгезии органеллы для N. Meningitidis на обеих эпителиальных и эндотелиальных клеток 10. Кроме того, было показано, что адгезия N. Meningitidis в клетках-хозяевах является напряжение сдвига зависит и поэтому полагают, связаны с темпами кровотока в микроциркуляторном 11. Это говорит о том динамические напряжения бактерии сталкиваются в естественных условиях имеют решающее значение для патогенеза. Это, однако, очень трудно моделировать микросреду мелких сосудов в пробирке.
Рецептор адгезии для Neisseria TFP до сих пор неизвестно, и поэтому нокаут-в стратегии достижения бактериальной адгезии в животной модели не могут быть предусмотрены в это время. CD46 было предложено, чтобы быть рецептор Tfp и трансгенные животные были получены в качестве мышиных моделях. Однако инфекция у этих животных не приводит к обширной инфекции или сыпь развития 12,13. Другие животные модели, которые были описаны в аспекте бактериемии Neisseria инфекции учитывать бактериальной предпочтение человеческого трансферрина в качестве источника железа 14,15. Либо дополняя человека трансферрин или выражая его из трансгенных приводит к увеличению бактериальной нагрузки в крови в течение длительного периода времени, но эта модель не показывает бактериальную адгезию или сыпь развитие 16,17.
В этом протоколе, мы описываем гуманизированную модель мыши, в котором человеческая кожа, в том числе кожного микрососудов, пересаживается на ослабленным иммунитетом мышей 18,19. Это приводит к функциональным человека судов, перфузированных циркуляции мыши. В сочетании с человеческим трансферрина добавок, это мОдел составляет по меньшей мере двух человеческих конкретным аспектам N. Meningitidis, т.е. человеческий эндотелий и человеческий трансферрин, в среде в естественных условиях. Н. Meningitidis введены внутривенно в этой модели придерживаться конкретно к эндотелия человека, производя патологии, которая похожа на то, что в клинических больных, в том числе сосудистого повреждения и пурпура развития сыпи 18.
Protocol
Representative Results
Discussion
Животные модели имеют критически важное значение для бактериального исследования патогенеза. Невозможно полностью имитировать среды в естественных условиях в культуре клеток, и это становится очевидным, что хозяин-патоген взаимодействия зависит от многих динамических факторов. Человеческий специфичность некоторых клинически значимых патогенов, таких как N. Meningitidis, ВИЧ, гепатита С, Plasmodium тропической, листерий, и сальмонеллы брюшного тифа ограничил использование естественных условиях моделей в этих инфекций. Однако, как мы начинаем понимать, какие инфекционные шаги, используемые при специфичности, в настоящее время разрабатываются гуманизированные модели. Протокол, описанный здесь является демонстрацией этого с введением человека микрососудов мышам, что позволяет обширная в естественных условиях заражение N. Meningitidis, в результате повреждения сосудов, а иногда и развития пурпура сыпи.
Используя эту модель,мы смогли определить, что адгезионные свойства TFP участвуют в сосудистой колонизации в естественных условиях с использованием бактериальных мутантов и что повреждение сосудов уменьшается в отсутствие адгезии 18. Ранее циркулирующие бактериальные продукты были вовлечены в этот ущерб, но наши результаты показывают, решающую роль для местного адгезии и колонизации сосудов. Это открывает новые возможности для развития целей роман лечения. Если адгезия патогенных бактерий может быть заблокирован фармацевтически она могла бы предотвратить развитие кожных поражений и привести к лучшим результатам для менингококковой выживших в плане некроза тканей, хирургическая обработка раны и ампутации. Работа также продемонстрировал сложность инфекции и участие в иммунном ответе и коагуляции каскада. Мы определили сигнализации цитокинов человека в сыворотке инфицированных мышей, несмотря на относительно небольшом количестве эндотелия человека настоящего 18.Это указывает на значительную реакцию цитокинов, наряду с инфильтрацией мыши популяции иммунных клеток в этой области.
Животные модели не может, конечно, никогда в полной мере имитировать человеческую болезнь, и все результаты получил от них следует рассматривать с учетом этого. Например, в этой модели кровь и циркулирующие клетки из мышиного происхождения, и мы не можем сбрасывать, что они могут вести себя по-разному в клетках человека. Преимуществом этого, однако, как показано в нашей недавней публикации 18, является способность дифференцировать сигналов, происходящих из эндотелия человека от того циркулирующих клеток мыши. Иммунитетом фон из мышей, используемых в этой модели также позволит для аллогенной перемещение населения иммунных клеток человека, добавив дальнейшей «гуманизации» аспект. Ослабленным иммунитетом фон из мышей, однако, может маскировать роль для NK, Т-или В-клеток, которые все отсутствуют или дефектных в этой модели. Относительно шорт сроки (24 часа в сутки), используемый в этой модели в основном касается врожденную реакцию, но для долгосрочных инфекций и развития иммунитета других вариантов, возможно, потребуется изучить.
Кожа является важным местом инфекции для N. Meningitidis, но имеющий относительно небольшое количество сосудов человека также означает, что экстраполяции данных к системной инфекции с участием многочисленных органов трудно. Хотя эта модель позволяет для изучения развития кожной поражения, важные шаги менингококковой инфекции, такие как эпителиальной и гематоэнцефалический пересечения не включены. Дальнейшее развитие этих очеловеченных моделей необходима для решения этих других аспектов инфекции. Тем не менее эта модель имеет большой потенциал для многочисленных человеческих конкретных патогенов, особенно ориентированных на кровеносные сосуды.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить всех членов лаборатории Dumenil, в частности Silke Сильва за критическое прочтение рукописи. Отдел хирургии в Больнице Européen Жорж-Помпиду (HEGP), д-р Дэвид Maladry. Майкл Hivelin и д-р Патрик Bruneval, Отделение патологии в HEGP. Вивария при PARCC во главе с Элизабет Хука. Эта работа была поддержана следующими грантовые учреждения: Мари Кюри МЭФ общение нет. 273223 (КМ), ATIP-Авенир Грант INSERM, CODDIM оборудование грант (Иль-де-Франс область), FRM (Фонд Pour La Recherche Medicale) Оборудование Грант, IBEID лаборатория передового опыта консорциума, ANR (Agence Nationale Pour La Recherche) грант " ошибки-в-поток ". Доноры не участвовал в разработке дизайна исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи.
Materials
| DMEM | Gibco Invitrogen | 31885-023 | |
| Phosphate buffered saline | Gibco Invitrogen | 10010-056 | |
| Ketamine 500 | Virbac France | LOT N°VAL4243 | |
| Xylazine | Bayer Healthcare | AMM N° FR/8146715 2/1980 | LOT N° KPO809S |
| (Rompun 2%) | |||
| Optigel | Europhta | Medicament autorisé N°3400933521134 | |
| Lacrigel | |||
| Tronothane | Lisa Pharma | ||
| GC agar Base | Conda | 1106 | |
| Human endothelium SFM media | Gibco Invitrogen | 11111 | |
| Fetal bovine serum | P A A | A15-101 | |
| Human transferrin | Sigma-Aldrich | T3309 | |
| UEA lectin – rhodamine | Vector Labs | RL-1062 | |
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich | H9627 | |
| Eosin | Sigma-Aldrich | E4009 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 534056 | |
| Humeca BV, Holland | 4.SB01 | ||
| Equiptment Name | Company | Catalogue Number | |
| Sober Hand Dermatome | Humeca BV, Holland | 4.SB01 | |
| Animal housing | Innovive | M-BTM-C8 | |
| Biopsy punch (4 mm) | Dominic Dutscher | 30737 | |
| Fast-Prep lysing matrix M tubes | MP Bio | 116923050 | |
| MagNA Lyzer Green Beads | Roche | 3358941001 | |
| MagNA Lyzer | Roche | 3358976001 | |
| Vectashield mounting media | Vector Labs | H-1000 | |
| Vetbond | 3M | 1469SB | Tissue Glue |
| OCT tissue tek | Sakura | 4583 |
References
- Davis, C. E., Arnold, K. Role of meningococcal endotoxin in Meningococcal purpura. J. Exp. Med. 140, 159-171 (1974).
- Mairey, E., et al. Cerebral microcirculation shear stress levels determine Neisseria meningitidis attachment sites along the blood-brain barrier. J. Exp. Med. 203, 1939-1950 (2006).
- Brandtzaeg, P., van Deuren, M. Classification and pathogenesis of meningococcal infections. Methods Mol. Biol. 799, 21-35 (2012).
- Guarner, J., et al. Pathogenesis and diagnosis of human meningococcal disease using immunohistochemical and PCR assays. Am. J. Clin. Pathol. 122, 754-764 (2004).
- Hill, W. R., Kinney, T. D. The cutaneous lesions in acute meningococcemia; a clinical and pathologic study. J. Am. Med. Assoc. 134, 513-518 (1947).
- Capecchi, B., et al. Neisseria meningitidis NadA is a new invasin which promotes bacterial adhesion to and penetration into human epithelial cells. Mol. Microbiol. 55, 687-698 (2005).
- Merz, A. J., Enns, C. A., So, M. Type IV pili of pathogenic Neisseriae elicit cortical plaque formation in epithelial cells. Mol. Microbiol. 32, 1316-1332 (1999).
- Morand, P. C., Tattevin, P., Eugene, E., Beretti, J. L., Nassif, X. The adhesive property of the type IV pilus-associated component PilC1 of pathogenic Neisseria is supported by the conformational structure of the N-terminal part of the molecule. Mol. Microbiol. 40, 846-856 (2001).
- Taha, M. K. Neisseria meningitidis induces the expression of the TNF-alpha gene in endothelial cells. Cytokine. 12, 21-25 (2000).
- Kirchner, M., Meyer, T. F. The PilC adhesin of the Neisseria type IV pilus-binding specificities and new insights into the nature of the host cell receptor. Mol. Microbiol. 56, 945-957 (2005).
- Mikaty, G., et al. Extracellular bacterial pathogen induces host cell surface reorganization to resist shear stress. PLoS Pathog. 5, (2009).
- Johansson, L., et al. CD46 in meningococcal disease. Science. 301, 373-375 (2003).
- Kirchner, M., Heuer, D., Meyer, T. F. CD46-independent binding of Neisserial type IV pili and the major pilus adhesin, PilC, to human epithelial cells. Infect. Immun. 73, 3072-3082 (2005).
- Noinaj, N., et al. Structural basis for iron piracy by pathogenic Neisseria. Nature. 483, 53-58 (2012).
- Schryvers, A. B., Gonzalez, G. C. Receptors for transferrin in pathogenic bacteria are specific for the host’s protein. Can. J. Microbiol. 36, 145-147 (1990).
- Oftung, F., Lovik, M., Andersen, S. R., Froholm, L. O., Bjune, G. A mouse model utilising human transferrin to study protection against Neisseria meningitidis serogroup B induced by outer membrane vesicle vaccination. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 26, 75-82 (1999).
- Zarantonelli, M. L., et al. Transgenic mice expressing human transferrin as a model for meningococcal infection. Infect. Immun. 75, 5609-5614 (2007).
- Melican, K., Michea Veloso, P., Martin, T., Bruneval, P., Dumenil, G. Adhesion of Neisseria meningitidis to dermal vessels leads to local vascular damage and purpura in a humanized mouse model. PLoS Pathog. 9, (2013).
- Murray, A. G., et al. Human T-cell-mediated destruction of allogeneic dermal microvessels in a severe combined immunodeficient mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 9146-9150 (1994).
- Nassif, X., et al. Antigenic variation of pilin regulates adhesion of Neisseria meningitidis to human epithelial cells. Mol. Microbiol. 8, 719-725 (1993).
- Geoffroy, M. C., Floquet, S., Metais, A., Nassif, X., Pelicic, V. Large-scale analysis of the meningococcus genome by gene disruption: resistance to complement-mediated lysis. Genome Res. 13, 391-398 (2003).
- Ho, M., Hickey, M. J., Murray, A. G., Andonegui, G., Kubes, P. Visualization of Plasmodium falciparum-endothelium interactions in human microvasculature: mimicry of leukocyte recruitment. J. Exp. Med. 192, 1205-1211 (2000).
