Humanisierten Maus-Modell, um bakterielle Infektionen Studieren Targeting der Mikrogefäß
Summary
Neisseria meningitidis ist ein Menschen bestimmten Erreger infiziert, die Blutgefäße. In diesem Protokoll menschlichen Mikrogefäße werden durch Pfropfen von der menschlichen Haut auf immungeschwächten Mäusen in eine Maus vorgestellt. Bakterien haften umfassend für die menschlichen Gefäße, was zu Gefäßschäden und die Entwicklung der Purpura typischerweise in menschlichen Fälle beobachtet.
Abstract
Neisseria meningitidis verursacht eine schwere, oft tödliche Sepsis, wenn es den menschlichen Blutkreislauf gelangt. Die Infektion führt zu umfangreichen Schäden der Blutgefäße, was zu Gefäß Leck, der Entwicklung von Purpura Hautausschläge und eventuelle Gewebe Nekrose. Untersuchung der Pathogenese dieser Infektion wurde zuvor durch das menschliche Spezifität der Bakterien, die in-vivo-Modellen erschwert beschränkt. In diesem Protokoll beschreiben wir einen humanisierten Modell für diese Infektion in der die menschliche Haut, Hautmikrogefäße enthält, wird auf immungeschwächten Mäusen gepfropft. Diese Gefäße anastomosieren mit der Maus Zirkulation unter Wahrung ihrer menschlichen Eigenschaften. Einmal in diesem Modell, N. eingeführt meningitidis haften ausschließlich die menschlichen Gefäße, was zu umfangreichen Gefäßschäden, Entzündungen und in einigen Fällen die Entwicklung der Purpura. Dieses Protokoll beschreibt die Transplantation, Infektion und Auswertungsschritte dieses Modells in der context von N. meningitidis-Infektion. Die Technik kann zu zahlreichen Menschen spezifische Krankheitserreger, die in den Blutstrom zu infizieren angewendet werden.
Introduction
Meningokokken-Sepsis ist eine häufig tödlich Blut geboren Infektion, die durch den bakteriellen Erreger Neisseria meningitidis verursacht. Meningokokken-Sepsis-Patienten oft mit Petechien oder Purpura auf ihrer Haut, die zuvor mit Gefäßzerstörung durch zirkulierende Bakterien und bakterielle Produkte 1 verursacht in Verbindung gebracht wurde Gegenwart. Hautbiopsien von Patienten zeigen klinische Bakterien mit Mikrogefäßen verbunden sind, oft füllt die Gefäße 2. Abgesehen von den Bakterien, ausgedehnten Thrombose, Gerinnung, Staus und Gefäß Leck in den Regionen Purpura 3-5 gesehen. Diese Gefäßschäden können zu ausgedehnten Nekrosen der Haut und der umgebenden Gewebe führen, was Debridement und sogar Amputation in Meningokokken-Überlebenden. Zu verstehen, wie diese Infektion verursacht Gefäßschäden ist wichtig, Prävention und Behandlungsstrategien zu optimieren. Der Großteil der Forschung auf Meningokokken-Sepsis wurde in vitro durchgeführt ammenschlichen Zelllinien aufgrund der Spezifität des menschlichen N. meningitidis. Viele Aspekte der Infektion wurden in vitro einschließlich bakterieller Adhäsion, Wirtszellantwort sowie Cytokinantwort 6-9 untersucht. Typ-IV-Pili (TFP) haben als Haupt Haftung für Organelle N. in Verbindung gebracht meningitidis sowohl Epithel-und Endothel-Zellen 10. Es wurde auch gefunden, daß die Haftung von N. gezeigten meningitidis an Wirtszellen ist Schubspannung abhängig und wird daher angenommen, um den Blutfluss Raten in der Mikrogefäß 11 bezogen werden. Dies legt nahe, die dynamischen Belastungen die Bakterien stellen in vivo sind entscheidend für die Pathogenese. Es ist jedoch sehr schwierig, die Mikroumgebung der kleinen Gefäße in vitro-Modell.
Die Haftung Rezeptor für Neisseria TFP noch unbekannt und somit Knock-in Strategien zur bakteriellen Adhäsion in einem Tiermodell zu erzielen kann zu diesem Zeitpunkt nicht in Betracht gezogen werden. CD46 wurde vorgeschlagen, sein TFP-Rezeptor und transgenen Tieren produziert wurden als Maus-Modelle handeln. Allerdings bedeutet Infektion bei diesen Tieren nicht um umfangreiche Infektionen führen oder die Entwicklung 12,13 Ausschlag. Andere Tiermodelle, die für die Bakteriämie Aspekt der Neisseria-Infektion beschrieben wurden, berücksichtigen die bakterielle Vorliebe für menschliches Transferrin als Eisenquelle 14,15. Entweder Ergänzung menschliches Transferrin oder von einem Transgen zu einer erhöhten Bakterienlast im Blut über einen längeren Zeitraum zum Ausdruck, aber dieses Modell zeigt keine bakterielle Adhäsion oder Hautausschlag Entwicklung 16,17.
In diesem Protokoll beschreiben wir einen humanisierten Mausmodell, in dem die menschliche Haut, einschließlich der dermalen Mikrogefäß, auf immungeschwächten Mäusen 18,19 transplantiert. Dies führt zu Funktions menschlichen Gefäße, mit der Maus Zirkulation durchblutet. In Kombination mit humanem Transferrin Ergänzung, diese modell letzteres mindestens zwei der menschlichen spezifische Aspekte N. meningitidis, dh menschlichen Endothel-und Humantransferrin, in einer in vivo Umgebung. N. meningitidis eingeführt intravenös in diesem Modell haften spezifisch für das menschliche Endothel Herstellung einer Pathologie, die ähnlich zu dem, was in der klinischen Patienten, einschließlich Gefäßschäden und Purpura Entwicklungs 18 angegeben ist.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tiermodelle sind für bakterielle Pathogenese Forschung von entscheidender Bedeutung. Es ist unmöglich, vollständig zu imitieren die in vivo-Umgebung, in der Zellkultur und es zeichnet sich ab, daß Wirt-Pathogen-Wechselwirkung wird durch viele dynamische Faktoren beeinflusst. Der menschliche Anwendbarkeit einiger klinisch wichtige Pathogene, wie N. meningitidis, HIV, HCV, Plasmodium falciparum, Listeria monocytogenes und Salmonella typhi ist die Verwendung von in-vivo-Modelle für diese Infektionen beschränkt. Allerdings, wie wir beginnen zu verstehen, welche Infektionsschritte werden in der Spezifität beteiligt, humanisierte Modelle entwickelt. Das hier beschriebene Protokoll ist ein Beweis dafür mit der Einführung des menschlichen Mikrogefäßen in Mäuse, was eine umfangreiche in vivo-Infektion mit N. meningitidis, was zu Gefäßschäden und gelegentlich die Entwicklung der Purpura Hautausschläge.
Mit diesem ModellWir waren in der Lage zu bestimmen, dass die Klebeeigenschaften der TFP in Gefäßbesiedlung in vivo unter Verwendung von bakteriellen Mutanten und dass die Gefäßschäden in Abwesenheit der Adhäsion beteiligt 18 reduziert. Bisher haben die zirkulierende bakterielle Produkte in diesem Schaden in Verbindung gebracht, aber unsere Ergebnisse legen nahe, eine entscheidende Rolle für die lokale Adhäsion und Gefäß Kolonisation. Dies eröffnet neue Möglichkeiten für die Entwicklung neuer Behandlungsziele. Wenn Adhäsion von pathogenen Bakterien könnten pharmazeutisch blockiert werden es möglicherweise verhindern, könnte die Entwicklung von Hautläsionen und führen zu besseren Ergebnissen für die Meningokokken-Überlebenden in Bezug auf Gewebe Nekrose, Debridement und Amputationen. Die Arbeit hat auch die Komplexität der Infektion und die Beteiligung der Immunantwort und Gerinnungskaskade. Wir identifizierten humanen Zytokin-Signalisierung im Serum infizierter Mäuse trotz der relativ geringen Menge an menschlicher Endothel 18 vorhanden.Dies zeigte eine signifikante Reaktion Cytokin, zusammen mit der Infiltration von Mausimmunzellpopulationen in der Umgebung.
Tiermodelle können natürlich nie vollständig menschlichen Krankheit zu replizieren und alle Ergebnisse erhielt von ihnen müssen in diesem Sinne angesehen werden. Zum Beispiel in diesem Modell das Blut und die zirkulierenden Zellen von Maus Herkunft, und wir können nicht ausschließen, dass sie unterschiedlich auf den menschlichen Zellen zu verhalten. Ein Vorteil davon jedoch, wie in unserer jüngsten Veröffentlichung 18 gezeigt, ist die Fähigkeit, Signal die aus menschlichen Endothel aus, dass der umlaufMausZellen zu differenzieren. Die immun Hintergrund der in diesem Modell verwendeten Mäuse würde auch für die allogene Übertragung von menschlichen Immunzellpopulationen zu ermöglichen, um eine weitere 'Humanisierung' Aspekt. Die immun Hintergrund der Mäuse können jedoch Maske eine Rolle für die NK-, T-oder B-Zellen, die alle fehlen in diesem Modell oder defekt. Die relativ Short Zeitrahmen (24 h) in diesem Modell verwendet, betrifft vor allem die angeborene Reaktion, aber für längerfristige Infektionen und die Entwicklung der Immunität andere Optionen benötigen, erkundet zu werden.
Die Haut ist ein wichtiger Infektionsstelle für N. meningitidis, aber mit einer relativ kleinen Menge an menschlichem Gefäße bedeutet auch, dass eine Extrapolation der Daten zu einer systemischen Infektion, die zahlreiche Organe ist schwierig. Während dieses Modell ermöglicht die Untersuchung von Haut Läsion Entwicklung, sind wichtige Schritte von Meningokokken-Infektion, wie Epithel-und Blut-Hirn-Überfahrt nicht inbegriffen. Die Weiterentwicklung dieser humanisierten Modellen benötigt wird, um diese anderen Aspekte der Infektion zu adressieren. Dennoch ist dieses Modell bietet ein großes Potenzial für zahlreiche Menschen spezifischen Krankheitserregern, insbesondere solcher, die auf die Blutgefäße.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren bedanken sich alle Mitglieder der Dumenil Labor, insbesondere Silke Silva für das kritische Lesen des Manuskripts danken. Die chirurgische Abteilung im Hôpital Européen Georges Pompidou (HEGP), Dr. David Maladry. Michael Hivelin und Dr. Patrick Bruneval, Pathologie-Abteilung an HEGP. Die Tierhaltung in PARCC von Elizabeth Huc geleitet. Diese Arbeit wurde durch die folgenden Zuschuss Agenturen unterstützt: Marie-Curie-Stipendium IEF-Nr. 273.223 (KM), ATIP-Avenir Grant von INSERM, CODDIM Ausrüstung Zuschuss (Region Ile de France), FRM (Fondation pour la recherche médicale) Ausrüstung gewähren, die IBEID Laboratory der Exzellenz-Konsortium, ANR (Agence Nationale pour la Recherche) grant " Bugs-in-flow ". Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung zur Veröffentlichung oder Vorbereitung des Manuskripts.
Materials
| DMEM | Gibco Invitrogen | 31885-023 | |
| Phosphate buffered saline | Gibco Invitrogen | 10010-056 | |
| Ketamine 500 | Virbac France | LOT N°VAL4243 | |
| Xylazine | Bayer Healthcare | AMM N° FR/8146715 2/1980 | LOT N° KPO809S |
| (Rompun 2%) | |||
| Optigel | Europhta | Medicament autorisé N°3400933521134 | |
| Lacrigel | |||
| Tronothane | Lisa Pharma | ||
| GC agar Base | Conda | 1106 | |
| Human endothelium SFM media | Gibco Invitrogen | 11111 | |
| Fetal bovine serum | P A A | A15-101 | |
| Human transferrin | Sigma-Aldrich | T3309 | |
| UEA lectin – rhodamine | Vector Labs | RL-1062 | |
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich | H9627 | |
| Eosin | Sigma-Aldrich | E4009 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 534056 | |
| Humeca BV, Holland | 4.SB01 | ||
| Equiptment Name | Company | Catalogue Number | |
| Sober Hand Dermatome | Humeca BV, Holland | 4.SB01 | |
| Animal housing | Innovive | M-BTM-C8 | |
| Biopsy punch (4 mm) | Dominic Dutscher | 30737 | |
| Fast-Prep lysing matrix M tubes | MP Bio | 116923050 | |
| MagNA Lyzer Green Beads | Roche | 3358941001 | |
| MagNA Lyzer | Roche | 3358976001 | |
| Vectashield mounting media | Vector Labs | H-1000 | |
| Vetbond | 3M | 1469SB | Tissue Glue |
| OCT tissue tek | Sakura | 4583 |
References
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