Nucleofection von Nagerneuroblasten zu Neuroblast Migrationsstudie<em> In-vitro-</em

Dieses Verfahren steht im Einklang mit den britischen Home Office Verordnungen (Tier Scientific Procedures Act, 1986). Wissenschaftler sollten die etablierten und durch ihre institutionelle und nationale Regulierungsorganisationen Tier genehmigten Richtlinien zu folgen. 1. Dissection und Dissoziation von Ratte RMS Neuroblasten Bereiten Sie die für RMS-Dissektion und Dissoziation erforderlichen Lösungen: Dissektion Medium (100 ml) Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) – 98,5 ml 5 M HEPES pH-Wert von 7,4 bis 0,5 ml Penicillin-Streptomycin (10.000 Einheiten / ml bis 10.000 &mgr; g / ml) – 1 ml Dissoziation Medium (2 ml) HBSS – 1.760 ml 10x Trypsin (2,5%) – 200 ul DNAse1 (1 mg / ml) – 40 &mgr; l Dulbecco modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) + 10% fötales Kälberserum (FCS) (40 ml) DMEM -36 ml FCS – 4 ml Komplett-Medium (12 ml) Neurobasalmedium – 11.46 ml B27 Supplement – 250 ul L-Glutamin (200 mM) – 125 ul Glucose (45%) – 165 ul 2. Filter-Sterilisieren der DMEM + 10% FCS und die Komplettmedium und preequilibrate sie in einem 37 ° C / 5% CO 2-Inkubator. Präparation Opfere eine P6-P7 Ratte Wurf (etwa 12 Jungtiere) durch Genickbruch und enthaupten mit einer Schere. Machen Sie eine ap-Schnitt in der Haut entlang der Mittelpfeilnaht von der Nase des Kleinhirns mit einer Skalpellklinge. Ziehen Sie die Haut ab und wiederholen Sie den gleichen Schnitt entlang der Schädel. Entfernen Sie vorsichtig die Schädelklappen mit Zange und entfernen Sie vorsichtig das Gehirn mit einem Spatel, kümmert sich um die Riechkolben enthalten. Schneiden Sie die meisten Schwanz Drittel des Gehirns und entsorgen. Hacken Sie the Hirngewebe in 1,4 mm dicke Scheiben mit einem koronalen Gewebe Chopper. Zeigen Scheiben in Schalen mit kaltem Dissektion Medium und sorgfältig trennen sie mit einer Nadel. Die RMS wird als dreieckige, durchscheinenden Bereich in der Mitte der OB Abschnitten und als eine kleine, kreisförmige Fläche in mehr kaudalen Hirnschnitten. Schneiden Sie die RMS von jeder Scheibe mit einem mikrochirurgischen Messer, dabei darauf achten, einschließlich der umgebenden Gewebe. In P7 Rattenjungen, in der Regel die meisten rostral ~ 8 Scheiben (inklusive OB) enthalten die RMS. Sammeln Sie die RMS-Fragmente mit einer Kunststoff-Pasteur-Pipette und legen Sie sie in eine kleine Schüssel mit kaltem Dissektion Medium auf Eis. Wenn die Präparation abgeschlossen ist, übertragen Sie die RMS-Fragmente in einen 15-ml-Tube mit einer Kunststoffpipette. Lassen Fragmente am Boden des Röhrchens zu begleichen. Dissoziation Ersetzen Sie die Dissektion Medium mit 2 ml Medium Dissoziation. Verreiben Sie das RMS-Fragmente durch sanft pipetting das Fragment Suspension auf und ab zu 10x mit einem P1000 Pipette. Von dem Schlauch mit der Gewebefragmente in einem 37 ° C Wasserbad für 2 Minuten. Pipettieren Sie die Lösung erneut 10x und sicherzustellen, dass Fragmente gespalten (die Suspension ist trüb). Inaktivierung des Trypsins durch Zugabe von 5 ml des vorgewärmten DMEM + 10% FCS. Zentrifugieren der Zellsuspension bei 433 × g für 5 min. In der Zwischenzeit Aliquot die erforderliche Menge an siRNA / DNA in Eppendorf-Röhrchen (gewöhnlich 3-5 ug DNA / shRNA oder 5-9 ug pro siRNA-Oligo Nukleofektion jedoch die Menge des DNA / siRNA Optimierung erfordern kann). Überschüssiges Medium und Zellpellet durch vorsichtiges Pipettieren in 5 ml vorgewärmten DMEM + 10% FCS. Führen Sie eine Zellzahl. Erwarten ~ 1 x 10 6 Zellen pro Ratte Welpen Gehirn. Für jede Nukleofektion sind mindestens 2,5 x 10 6 Zellen benötigt, währendoptimale Ergebnisse werden mit 3-4 x 10 6 Zellen pro Nukleofektion erreicht. Zentrifugieren der Zellsuspension bei 433 × g für 5 min. Stellen Sie sicher, dass Sie so viel wie möglich zu entfernen Medium. 2. Nucleofection Unmittelbar Zellpellet in Ratte (oder Maus, wenn mit Maus-Zellen), die zuvor bei Raumtemperatur inkubiert Neuron Nukleofektion Lösung. Verwenden Sie 100 ul pro Nukleofektion. Hinweis: in der Regel eine Ratte Wurf von 12 Welpen ist ausreichend, um 4 nucleofections durchführen und eine Maus Wurf (12 Welpen) ist ausreichend, um 2 nucleofections durchzuführen. Überweisung 100 ul der Zellsuspension in jede Eppendorf Röhrchen mit siRNA / DNA und vorsichtig mischen 2-3x durch Pipettieren mit einem P200 Pipette. Hinzufügen der Probe (cell-DNA/siRNA Suspension) an der Unterseite des nucleofectioncuvette, kümmert sich um Blasen zu vermeiden. Nucleofect mit dem Programm G-013 (für Ratten-Zellen) oder O-005 (fürMauszellen). Eine Nukleofektion dauert ca. 5 sek. Schnelles Hinzufügen von 1 ml vorgewärmten DMEM + 10% FCS auf die nucleofected Probe. Wiederholen Sie die Schritte 2.4 und 2.5 für alle anderen Proben. Hinweis: Für optimale Ergebnisse sollte die gesamte Prozedur Nukleofektion nicht länger als 5 min. Übertragen jeder Probe in ein 15 ml Röhrchen mit 5 ml vorgewärmtem DMEM + 10% FCS mit der Kunststoffpipette vom Nukleofektion Kit bereitgestellt. Vermeiden Sie jede Übertragung von Zelltrümmern in die Röhre. Zentrifuge Proben bei 433 × g für 5 min. Überschüssige Medium vorsichtig entfernen und das Pellet in 25-30 ul vorgewärmtes DMEM + 10% FCS mit einem P20 Pipette. Verwenden Sie nicht mehr als 30 ul Medium. Pipettieren die Suspension als ein Tropfen auf die Innenseite eines p35 Schalendeckel. Kehren Sie die Deckel über den p35 Schale mit 2 ml Vollmedium (siehe auch Abbildung 1). Lassen im Inkubator (37 ° C / 5% CO 2) fürmindestens 5 Stunden und bis zu 7 Stunden. Längere Inkubationszeit erlaubt eine bessere Reaggregation von Zellclustern. Übertragen Sie die hängenden Tropfen aus dem Deckel in das Komplettmedium in die Schüssel mit einem P1000 Pipettenspitze mit einem Schnitt. Bei 37 ° C / 5% CO 2 für 24 h für DNA nucleofections und 48 h für siRNA / shRNA nucleofections. 3. Verankerung Vorbereitung Komplettmedium (25 ml) und preequilibrate es bei 37 ° C / 5% CO 2 für ein paar Stunden. Nehmen Sie die gefrorenen Aliquots von Basalmembranmatrix von -80 ° C Gefrierschrank und tauen auf Eis im Kühlraum. Für jede Nukleofektion bereiten ein 6-cm-Schale, die bis zu acht 13 mm steril coverlips. Die Schalen werden auf einem Eis-Box mit Klarsichtfolie abgedeckt. Es ist wichtig, die Deckgläser kühl zu halten, um Matrix Verfestigung während des Einbettungsverfahren zu verhindern. Um Feuchtigkeit zu erhalten, legen Sie einen Streifen von feuchten Gewebe innerhalb einer 15 cm Schüssel, dass wkrank verwendet, um auf drei 6-cm-Schalen, die die eingebetteten Neuroblasten halten werden. Hinzufügen Komplettmedium zu der aufgetauten Matrix in einem Verhältnis von 1:3. Zum Beispiel mischen 40 ul Vollmedium mit 120 ul der Matrix durch Pipettieren. Diese Menge ist ausreichend Matrix zur Einbettung Aggregate auf acht 12 mm Deckgläsern. Übertragen Sie die neu zusammengefügt Zellhaufen zu einem 15-ml-Tube und Zentrifuge bei 433 × g für 5 min. Überschüssiges Medium und das Pellet in 10 ul Vollmedium. Platz 2 ul Zellsuspension auf jedes Aggregat sterilen Deckglas und fügen Sie 18 ul der Matrix / Komplett-Medium-Mischung. Verwenden Sie die Pipettenspitze, um die Matrix über den gesamten Deck verbreiten. Sofort legen Sie die 6-cm-Schale, die die Deckgläser in der 15-cm-Schale und lassen in den Inkubator (37 ° C / 5% CO 2) für 15-20 min. Wenn die Matrix verfestigt hat, vorsichtig mit 5 ml Vollmedium zu jedem 6 cm Schale wobei darauf zu schiebenunten eine schwimmende Deckglas mit einer Pipettenspitze. Inkubation für 24 Stunden bei 37 ° C / 5% CO 2 Neuroblasten Migration aus der Zellaggregate zu lassen. 4. 3D-Migration-Assay Bereiten Sie die für die Immunfärbung erforderlichen Lösungen. Bereiten Sie die Block-Lösung: Ziege Blocklösung (50 ml) Phosphat-gepufferte Saline (PBS) – 5 ml Goat Serum – 7,5 ml 10% Triton X-100 – 1,5 ml BSA – 50 mg H 2 O – 36 ml Filter und bei 4 ° C Bereiten Sie die Befestigungslösung: Fixier-Lösung (100 ml) Paraformaldehyd (PFA) – 4 g ACHTUNG: immer PFA Griff unter einer Haube Saccharose – 20 g (optional) PBS auf 100 ml Auf einer Heizplatte unter konstantem Rühren auflösen PFA in 80 ml PBS bei 65 ° C gehalten wird Sobald das PFA gelöst, mit 20 g Saccharose. PH-Wert auf7,4 (gewöhnlich durch Zugabe ~ 60 &mgr; l 1M NaOH pro 100 ml Lösung). Bringen bis zu einem Gesamtvolumen von 100 ml mit PBS. Immunfärbung Zeigen Deckgläser in einer 24-Well-Platte. Spülen Deckgläser mit PBS 2x. Befestigen Sie die RMS Neuroblast Aggregate mit Befestigungslösung für 45 Minuten bei Raumtemperatur. Spülen Deckgläser mit PBS 3x (5 min / Waschgang – auf einem Schaukel Plattform). Blockieren Sie für 30-60 min mit Ziegenblocklösung. Verdünnen Primärantikörper in Ziegen Block-Lösung und Inkubation über Nacht bei 4 ° C (Falls gewünscht, fluoreszierende Phalloidin (1:400) und Hoechst Farbstoff (1:10.000) kann auch auf die Primärantikörperlösung hinzugefügt und filamentöses Aktin Kerne sichtbar wird). Spülen Deckgläser mit PBS 3x (5 min / Waschgang). Verdünnen Sekundärantikörper Ziege in Block-Lösung und Inkubation für 2 Stunden bei Raumtemperatur. Spülen coverslips 3x mit PBS (5 min / Waschgang) Berg Deckgläser mit fluoreszierenden Montagemedium und lassen über Nacht bei Raumtemperatur trocknen. Migration Analysis Machen Sie Bilder von Fest RMS Neuroblast Aggregate mit einem Fluoreszenzmikroskop mit einer 10X-Objektiv. Fügen Sie eine Maßstabsleiste in einem Beispielbild. Um den Maßstab für die Quantifizierung, messen Sie den Maßstab in dem Bild, indem Sie die "Gerade"-Tool auf der ImageJ Werkzeugleiste. Wählen Sie die Option "Analysieren" und klicken Sie auf 'gesetzt der Skala ". In der Skala Fenster stellen Sie die "bekannte Strecke" und aktivieren Sie die "globale"-Box die gleichen Einstellungen für alle Messungen zu halten. Verwenden Sie die 'Segmentlinie "-Tool auf der ImageJ Werkzeugleiste, um den Abstand von der Kante des Aggregats an den weitesten migriert Neuroblast in 6 verschiedenen Bereichen rund um die gesamte Aggregat (3B) zu messen. Betrachten Sie nur isoliert agAggregate für die Analyse. Berechnen einer durchschnittlichen Laufstrecke von den 6-Werte für jedes Aggregat erhalten. Messen 10-20 Aggregate für jede Bedingung in jedem unabhängigen Versuch und Pool Ergebnisse aus mindestens drei unabhängigen Experimenten. Immer auch eine Nukleofektion Kontrolle (zB. GFP oder ein Steuer sh / siRNA).