Nucléofection de rongeurs Neuroblastes à étudier neuroblaste migrations<em> In vitro</em

Cette procédure est conforme à Accueil Règlement Royaume-Uni bureau (ACT des procédures scientifiques des animaux, 1986). Les scientifiques doivent suivre les lignes directrices établies et approuvées par leurs organismes de réglementation animaux institutionnelles et nationales. Une. Dissection et de dissociation de Rat RMS Neuroblastes Préparer les solutions nécessaires pour la dissection RMS et dissociation: milieu de dissection (100 ml) Solution saline équilibrée de Hank (HBSS) – 98,5 ml 5 M de HEPES pH 7,4 à 0,5 ml Pénicilline-streptomycine (10 000 unités / ml et 10 000 pg / ml) – 1 ml milieu de dissociation (2 ml) HBSS – 1.760 ml 10x trypsine (2,5%) – 200 pl DNAse1 (1 mg / ml) – 40 pl Dulbecco modification moyenne de Eagle (DMEM) + 10% sérum de veau foetal (FCS) (40 ml) DMEM -36 ml FCS – 4 ml Le milieu complet (12 ml) Moyennes Neurobasal – 11,46 ml B27 Supplément – 250 pi L-glutamine (200 mM) – 125 pl Glucose (45%) – 165 pl 2. Filtre à stériliser le% de FCS DMEM + 10 et le milieu complet et preequilibrate eux dans un rapport C / 5% de CO 2 incubateur à 37 °. Dissection Sacrifiez une litière de rat P6-P7 (environ 12 chiots) par dislocation cervicale et décapiter avec des ciseaux. Faire une incision antéro-postérieur à la peau le long de la suture mi-sagittal du nez au cervelet avec une lame de scalpel. Peler la peau et répéter la même incision le long du crâne. Retirez délicatement les volets crâniens avec une pince et retirer délicatement le cerveau d'une spatule, en prenant soin d'inclure les bulbes olfactifs. Couper la troisième plus caudale du cerveau et le jeter. Hacher ee tissu cérébral en 1,4 mm d'épaisseur à l'aide de coupes coronales un hachoir de tissu. Placer les tranches dans des boîtes contenant du milieu de dissection froide et les séparer soigneusement à l'aide d'une aiguille. Le RMS apparaît comme une triangulaire, zone translucide au centre de sections de OB et comme une petite zone circulaire en plus des tranches de cerveau caudale. Couper les RMS sur chaque tranche avec un couteau de microchirurgie, en prenant soin d'éviter d'inclure les tissus environnants. Dans les ratons P7, généralement les ~ 8 tranches les plus rostrales (y compris OB) contiennent les RMS. Recueillir les fragments RMS avec une pipette Pasteur en plastique et placez-les dans un petit plat contenant un milieu de dissection froide sur la glace. Lorsque la dissection est terminé, le transfert des fragments RMS dans un tube de 15 ml avec une pipette en plastique. Laissez fragments à se déposer au fond du tube. Dissociation Remplacer le milieu de dissection avec 2 ml de milieu de dissociation. Triturer les fragments RMS par doucement pipetting la suspension de haut en bas fragment environ 10x en utilisant une pipette P1000. Laisser le tube avec les fragments de tissus dans un bain d'eau à 37 ° pendant 2 min. Introduire à la pipette la solution de nouveau 10x et veiller à ce que les fragments ont dissocié (la suspension doit devenir trouble). Inactiver la trypsine en ajoutant 5 ml de DMEM préchauffé + 10% de FCS. Centrifuger la suspension de cellules à 433 xg pendant 5 min. Dans l'entre-temps aliquote de la quantité requise de siRNA / ADN dans des tubes Eppendorf (habituellement 3-5 pg d'ADN / shRNA ou 9.5 ug par siRNA oligo nucléofection cependant, la quantité d'ADN / siRNA peut nécessiter une optimisation). Retirer l'excès de milieu et remettre en suspension le culot cellulaire par pipetage doux dans 5 ml de DMEM préchauffé + 10% de FCS. Effectuer une numération cellulaire. Attendez ~ 1 x 10 6 cellules par rat chiot cerveau. Un minimum de 2,5 x 10 6 cellules sont nécessaires pour chaque nucléofection, tandis queles meilleurs résultats sont obtenus en utilisant 3-4 x 10 6 cellules par nucléofection. Centrifuger la suspension de cellules à 433 xg pendant 5 min. Assurez-vous d'enlever autant de support que possible. 2. Nucléofection Remettre en suspension immédiatement le culot cellulaire chez le rat (souris ou si l'on utilise des cellules de souris) solution de nucléofection neuronal préalablement incubé à la température ambiante. Utilisez 100 pi par nucléofection Remarque:. Généralement une portée de rat de 12 chiots est suffisante pour effectuer 4 nucleofections et une portée de souris (12 chiots) est suffisante pour effectuer 2 nucleofections. Transférer 100 ul de la suspension cellulaire dans chaque tube Eppendorf contenant siRNA / ADN et mélanger délicatement 2-3x par pipetage avec une pipette P200. Ajouter l'échantillon (cell-DNA/siRNA suspension) à la partie inférieure de la nucleofectioncuvette, en prenant soin d'éviter les bulles. Nucleofect utilisant le programme G-013 (pour les cellules de rat) ou O-005 (pourdes cellules de souris). Un nucléofection prend environ 5 sec. Ajouter rapidement 1 ml de DMEM préchauffé + 10% de FCS à l'échantillon nucleofected. Répétez les étapes 2.4 et 2.5 pour tous les autres échantillons. Remarque: pour des résultats optimaux, la procédure de nucléofection ensemble ne devrait pas durer plus de 5 minutes. Transférer chaque échantillon dans un tube de 15 ml contenant 5 ml de DMEM préchauffé + FCS à 10% en utilisant la pipette en plastique fourni par le kit de nucléofection. Éviter le transfert de tout débris cellulaire au tube. Centrifuger les échantillons à 433 g pendant 5 min. Retirez soigneusement tout excès de milieu et remettre le culot en 25-30 ul de DMEM préchauffé + 10% de FCS à l'aide d'une pipette P20. Ne pas utiliser plus de 30 pi de milieu. Introduire à la pipette la suspension comme une goutte sur la face intérieure d'un couvercle plat de p35. Inversez le couvercle sur le plat de p35 contenant 2 ml de milieu complet (voir aussi la figure 1). Ajouter dans l'incubateur (37 ° C / 5% CO 2) pendant aumoins 5 h et jusqu'à 7 h. Plus de temps d'incubation permet une meilleure ré-agrégation d'amas cellulaires. Transférer les gouttes de suspension du couvercle dans le milieu complet dans le plat à l'aide d'une pipette P1000 avec une pointe de coupe. Incuber à 37 ° C / 5% de CO 2 pendant 24 heures pour nucleofections d'ADN et 48 h pour nucleofections siRNA / shRNA. 3. Incorporation Préparer un milieu complet (25 ml) et il preequilibrate à 37 ° C / 5% CO 2 pendant quelques heures. Sortez les aliquotes congelées de la matrice de la membrane basale de -80 ° C congélateur et décongeler sur la glace dans la chambre froide. Pour chaque nucléofection préparer un plat de 6 cm contenant jusqu'à huit 13 mm coverlips stériles. Placez les plats sur une boîte de glace recouverte d'une pellicule de plastique. Il est important de maintenir les lamelles fraîche pour empêcher la solidification matrice durant la procédure d'enrobage. Pour maintenir l'humidité, placer une bande de tissu humide dans un plat de 15 cm que wmal être utilisés pour contenir jusqu'à trois plats 6 cm contenant les neuroblastes embarqués. Ajouter milieu complet à la matrice décongelé dans un rapport 1:3. Par exemple, mélanger 40 pi de milieu complet avec 120 pi de matrice à la pipette. Cette quantité de matrice est suffisante pour intégrer des agrégats sur huit 12 mm lamelles. Transférer les groupes de cellules agrégés de nouveau à un tube de 15 ml et centrifuger à 433 xg pendant 5 min. Retirer l'excès de milieu et remettre le culot dans 10 ul de milieu complet. Placez 2 pi de suspension cellulaire total sur chaque lamelle stérile et ajouter 18 ul de matrice / mélange milieu complet. Utilisez la pointe de la pipette pour répandre la matrice sur toute la lamelle. Placer immédiatement la capsule de 6 cm contenant les lamelles dans les 15 cm plat et laisser dans l'incubateur (37 ° C / 5% CO 2) pendant 15-20 min. Lorsque la matrice est solidifié, ajouter doucement 5 ml de milieu complet à chaque 6 cm prise de plat soins à pousserbas tout lamelle flottant avec une pointe de pipette. Incuber pendant 24 heures à 37 ° C / 5% CO 2 pour laisser neuroblastes migrent hors des agrégats de cellules. 4. 3D migrations Assay Préparer les solutions nécessaires pour immunologique. Préparer la solution de bloc: solution de bloc de chèvre (50 ml) Phosphate Buffered Saline (PBS) – 5 ml Sérum de chèvre – 7,5 ml 10% de Triton X-100 – 1,5 ml BSA – 50 mg H 2 O – 36 ml Filtrer et conserver à 4 ° C. Préparer la solution de fixation: Solution de fixation (100 ml) Paraformaldéhyde (PFA) – 4 g ATTENTION: manipulez toujours PFA sous une hotte Saccharose – 20 g (en option) PBS à 100 ml Sur une plaque chauffante et sous agitation constante dissolution de la PFA dans 80 ml de PBS maintenue à 65 ° C. Une fois que le PFA a dissous, ajouter 20 g de saccharose. Ajuster le pH à7,4 (en général par l'addition de NaOH 60 M ~ 1 ul pour 100 ml de solution). Mettre à un volume total de 100 ml avec du PBS. Immunocoloration Placez les lamelles dans une plaque de 24 puits. Rincer les lamelles avec du PBS 2x. Fixer les neuroblastes agrégats RMS avec une solution de fixation pendant 45 min à température ambiante. Rincer les lamelles avec du PBS 3x (5 min / lavage – sur une plate-forme à bascule). Bloquer pendant 30-60 minutes avec une solution de bloc de chèvre. Diluer anticorps primaires dans la solution de bloc de chèvre et incuber pendant une nuit à 4 ° C. (Si on le souhaite, la phalloïdine fluorescente (1:400) et le colorant Hoechst (1:10000) peuvent également être ajoutés à la solution d'anticorps primaire à visualiser l'actine filamenteuse et des noyaux). Rincer les lamelles avec du PBS 3x (5 min / lavage). Diluer les anticorps secondaires dans la solution de bloc de chèvre et incuber pendant 2 heures à température ambiante. Rincer coverslips avec du PBS 3x (5 min / lavage) Mont lamelles couvre avec un milieu de montage fluorescent et laisser sécher une nuit à température ambiante. Analyse de la migration Capturez des images d'agrégats de neuroblastes RMS fixes avec un microscope à fluorescence en utilisant un objectif 10X. Inclure une barre d'échelle dans une image de l'échantillon. Pour configurer l'échelle de quantification, de mesurer la barre d'échelle dans l'image en sélectionnant la «ligne droite» outil sur la barre d'outils de ImageJ. Choisissez l'option «Analyser» et cliquez sur «définir l'échelle». Dans la fenêtre de l'échelle définir la «distance connue» et cochez la case «globale» de garder les mêmes paramètres pour toutes les mesures. Utilisez l'outil «ligne segmentée» sur la barre d'outils de ImageJ pour mesurer la distance entre le bord de l'ensemble de la neuroblaste le plus migré dans 6 secteurs différents autour de l'ensemble du total (figure 3B). Considérons seulement ag isolégregates pour analyse. Calculer une distance moyenne de 6 valeurs obtenues pour chaque agrégat de migration. Mesurer 10-20 agrégats pour chaque condition dans chaque expérience et piscine résultats indépendants d'un minimum de trois expériences indépendantes. Toujours inclure un contrôle nucléofection (p. ex. GFP ou une sh de contrôle / siRNA).