Nucleofection de roedores neuroblastos para el Estudio de la Migración Neuroblast<em> In vitro</em

Este procedimiento es conforme a los reglamentos del RU Home Office (Ley de Procedimientos Científicos Animal, 1986). Los científicos deben seguir las directrices establecidas y aprobadas por sus órganos reguladores animales institucionales y nacionales. 1. Disección y disociación de rata RMS neuroblastos Preparar las soluciones necesarias para la disección RMS y disociación: Medio de disección (100 ml) Solución salina equilibrada de Hank (HBSS) – 98,5 ml 5 M de HEPES, pH 7,4 a 0,5 ml La penicilina-estreptomicina (10.000 unidades / ml y 10.000 g / ml) – 1 ml Medio de disociación (2 ml) HBSS – 1.760 ml 10x Tripsina (2,5%) – 200 l Dnase1 (1 mg / ml) – 40 l Dulbecco medio de Eagle modificado (DMEM) + 10% de suero de ternera fetal (FCS) (40 ml) DMEM -36 ml FCS – 4 ml El medio completo (12 ml) Medianas Neurobasal – 11,46 ml B27 Suplemento – 250 l L-Glutamina (200 mm) – 125 l Glucosa (45%) – 165 l 2. Filter-esterilizar el% de FCS DMEM + 10 y el medio completo y preequilibrate en un 37 ° C / 5% de CO 2 incubadora. Disección Sacrificar una camada de ratas P6-P7 (unos 12 cachorros) por dislocación cervical y decapitar con unas tijeras. Hacer una incisión anteroposterior en la piel a lo largo de la sutura sagital medial desde la nariz hasta el cerebelo con una hoja de bisturí. Pelar la piel y repita la misma incisión a lo largo del cráneo. Retire suavemente las aletas craneales con fórceps y retirar con cuidado el cerebro con una espátula, teniendo cuidado de incluir los bulbos olfatorios. Cortar el tercero más caudal del cerebro y lo descarta. Picar ªe tejido cerebral en 1,4 mm de espesor rebanadas coronales utilizando un cortador de tejidos. Coloque las rebanadas en platos que contenían medio disección fría y separe con cuidado usando una aguja. El RMS aparece como un triangular, zona translúcida en el centro de las secciones de obstetricia y como una pequeña área circular en rodajas de cerebro más caudales. Cortar las RMS de cada rebanada con un cuchillo microquirúrgico, teniendo cuidado de evitar la inclusión de tejido circundante. En crías de ratas P7, por lo general los ~ 8 rebanadas más rostral (incluyendo OB) contienen el RMS. Recoger los fragmentos de RMS con una pipeta Pasteur de plástico y colocarlos en un plato pequeño que contiene medio de disección en frío en hielo. Cuando la disección es completa, la transferencia de los fragmentos de RMS en un tubo de 15 ml con una pipeta de plástico. Deja fragmentos para ubicarse en la parte inferior del tubo. Disociación Sustituya el medio de disección con 2 ml de medio de disociación. Se tritura los fragmentos de RMS por suavemente pipetting la suspensión de fragmentos de arriba abajo sobre 10 veces con una pipeta P1000. Deje el tubo con los fragmentos de tejido en un 37 ° C baño de agua durante 2 min. Pipetear la solución de nuevo 10 veces y asegurarse de que los fragmentos han disociado (la suspensión debe enturbiarse). Inactivar la tripsina mediante la adición de 5 ml de DMEM precalentado + 10% de FCS. Centrifugar la suspensión de células a 433 xg durante 5 min. En la alícuota Mientras tanto, la cantidad requerida de ARNsi / ADN en tubos de Eppendorf (generalmente 3-5 g de ADN / shRNA o 5-9 ARNsi g oligo por nucleofection, sin embargo, la cantidad de ADN / ARNsi puede requerir optimización). Retire el exceso de medios y resuspender el botón celular por pipeteo suave en 5 ml de DMEM precalentado + 10% FCS. Realizar un recuento de células. Esperar ~ 1 × 10 6 células por rata cachorro cerebro. Se requiere un mínimo de 2,5 x 10 6 células por cada nucleofection, mientrasresultados óptimos se logran utilizando 3-4 x 10 6 células por nucleofection. Centrifugar la suspensión de células a 433 xg durante 5 min. Asegúrese de eliminar la mayor cantidad media de lo posible. 2. Nucleofection Inmediatamente resuspender el sedimento de células en ratas (o el ratón si el uso de células de ratón) solución nucleofection neurona previamente se incubó a temperatura ambiente. Utilice 100 l por nucleofection Nota:. Típicamente una camada de ratas de 12 crías es suficiente para llevar a cabo 4 nucleofections y una camada de ratón (12 cachorros) es suficiente para llevar a cabo 2 nucleofections. Transferir 100 l de la suspensión celular a cada tubo Eppendorf que contenía ARNsi / ADN y mezclar suavemente 2-3x por pipeteado con una pipeta P200. Añadir la muestra (suspensión cell-DNA/siRNA) a la parte inferior de la nucleofectioncuvette, teniendo cuidado de evitar burbujas. Nucleofect mediante el programa G-013 (para las células de rata) o O-005 (paracélulas de ratón). Uno nucleofection tarda aproximadamente 5 seg. Añadir rápidamente 1 ml de DMEM precalentado + 10% de FCS a la muestra nucleofected. Repita los pasos 2,4 y 2,5 para el resto de las muestras. Nota: para obtener resultados óptimos, todo el procedimiento nucleofection no debe durar más de 5 minutos. Transfiera cada muestra a un tubo de 15 ml que contiene 5 ml de DMEM precalentado + 10% de FCS utilizando la pipeta de plástico proporcionado por el kit nucleofection. Evitar la transferencia de cualquier residuo celular para el tubo. Centrifugar las muestras a 433 xg durante 5 min. Quite cuidadosamente todo exceso de medio y resuspender el precipitado en 25 a 30 l de precalentado DMEM + FCS al 10% utilizando una pipeta P20. No utilice más de 30 l de medio. Pipetear la suspensión como una gota en el lado interior de una tapa de la placa de p35. Invertir la tapa sobre el plato de p35 que contiene 2 ml de medio completo (véase también la Figura 1). Deja en la incubadora (37 ° C / 5% CO 2) durante almenos de 5 horas y un máximo de 7 horas. Un mayor tiempo de incubación permite una mejor reagregación de grupos de células. Transfiera las gotas que cuelgan de la tapa en el medio completo en el plato con una pipeta P1000 con una punta de corte. Se incuba a 37 ° C / 5% de CO2 durante 24 h para nucleofections de ADN y 48 h para nucleofections siRNA / shRNA. 3. Incorporación Preparar medio completo (25 ml) y preequilibrate que a 37 ° C / 5% de CO 2 durante unas pocas horas. Saque las alícuotas congeladas de la matriz de la membrana basal de -80 ° C congelador y descongelar en hielo en la cámara frigorífica. Para cada nucleofection preparar un plato de 6 cm que contiene hasta ocho 13 mm coverlips estériles. Colocar las cápsulas en una caja de hielo cubierta con papel film. Es importante mantener los cubreobjetos fresco para evitar la solidificación de la matriz durante el procedimiento de incrustación. Para mantener la humedad, coloque una tira de tejido húmedo dentro de un plato de 15 cm que wenfermo puede utilizar para almacenar hasta tres placas de 6 cm que contienen los neuroblastos embebidos. Añadir medio completo a la matriz descongelada en una relación de 01:03. Por ejemplo, mezclar 40 l de medio completo con 120 l de la matriz con la pipeta. Esta cantidad de matriz es suficiente para incrustar agregados en ocho cubreobjetos de 12 mm. La transferencia de los grupos de células reaggregated a un tubo de 15 ml y centrifugar a 433 xg durante 5 min. Retire el exceso de medios y resuspender el precipitado en 10 l de medio completo. Coloque 2 l de suspensión de agregados de células en cada cubreobjetos estéril y añadir 18 l de matriz / mezcla de medio completo. Use la punta de la pipeta para ampliar la matriz a través de todo el cubreobjetos. Colocar inmediatamente el recipiente de 6 cm que contiene los cubreobjetos en el plato de 15 cm y dejar en la incubadora (37 ° C / 5% CO 2) durante 15-20 min. Cuando la matriz se ha solidificado, añadir con cuidado 5 ml de medio completo a cada 6 cm plato toma el cuidado de empujarpor cualquier cubreobjetos flotante con una punta de pipeta. Incubar durante 24 horas a 37 ° C / 5% CO 2 para permitir que los neuroblastos migran fuera de los agregados celulares. 4. Ensayo de Migración 3D Preparar las soluciones necesarias para la inmunotinción. Prepare la solución de bloqueo: Solución de bloqueo de cabra (50 ml) Tampón fosfato salino (PBS) – 5 ml Suero de cabra – 7,5 ml 10% de Triton X-100 – 1,5 ml BSA – 50 mg H 2 O – 36 ml Se filtra y se almacena a 4 º C. Preparar la solución de fijación: La fijación de solución (100 ml) El paraformaldehído (PFA) – PRECAUCIÓN 4 g: siempre manejar PFA bajo una campana La sacarosa – 20 g (opcional) PBS hasta 100 ml En un plato caliente y con agitación constante disolver la PFA en 80 ml de PBS mantuvo a 65 ° C. Una vez que la PFA se haya disuelto, añadir 20 g de sacarosa. Ajustar el pH a7.4 (por lo general mediante la adición de ~ 60 l 1 M NaOH por 100 ml de solución). Llevar a un volumen total de 100 ml con PBS. La inmunotinción Coloque cubreobjetos en una placa de 24 pocillos. Enjuague cubreobjetos con PBS 2x. Fijar los agregados neuroblast RMS con solución fijadora durante 45 minutos a temperatura ambiente. Enjuague cubreobjetos con PBS 3 veces (5 min / lavado – en una plataforma oscilante). Bloquee durante 30-60 min con solución de bloqueo de cabra. Diluir anticuerpos primarios en solución de bloqueo de cabra e incubar durante la noche a 4 ° C. (Si se desea, faloidina fluorescente (1:400) y el colorante Hoechst (1:10.000) pueden también ser añadidos a la solución de anticuerpo primario para visualizar la actina filamentosa y núcleos). Enjuague cubreobjetos con PBS 3 veces (5 min / lavado). Diluir los anticuerpos secundarios de cabra en solución de bloqueo y se incuba durante 2 horas a temperatura ambiente. Enjuague coverslips con PBS 3 veces (5 min / lavado) Monte cubreobjetos con medio de montaje fluorescente y dejar secar al aire durante la noche a temperatura ambiente. Análisis de migración Captura de imágenes de agregados neuroblast RMS fijos con un microscopio de fluorescencia utilizando un objetivo de 10X. Incluye una barra de escala de la imagen de una muestra en. Para configurar la escala para la cuantificación, mida la barra de escala en la imagen mediante la selección de la herramienta 'Recta' en la barra de herramientas ImageJ. Elija la opción "Analizar" y haga clic en 'establecer la escala'. En la ventana de escala establecida la "distancia conocida" y marque la casilla "global" para mantener la misma configuración para todas las mediciones. Utilice la herramienta de línea segmentada "en la barra de herramientas ImageJ para medir la distancia desde el borde de la suma a la más lejana neuroblast migrado en 6 sectores diferentes alrededor de todo el conjunto (Figura 3B). Considere sólo aislados agagregados para su análisis. Calcular una distancia media de migración desde los 6 valores obtenidos para cada agregado. Mida 10-20 agregados para cada condición en cada experimento y piscina resultados independientes de un mínimo de tres experimentos independientes. Incluya siempre un control nucleofection (GFP o un sh / control siRNA por ejemplo.).