Nucleofection di roditori neuroblasti per studiare neuroblasti migrazione<em> In vitro</em

Questa procedura è in conformità con i regolamenti interni del Regno Unito Office (Procedure di animale scientifici Act, 1986). Gli scienziati devono seguire le linee guida stabilite e approvate dalle loro organizzazioni di regolamentazione nazionali o istituzionali animali. 1. Dissezione e dissociazione di Rat RMS neuroblasti Preparare le soluzioni necessarie per RMS dissezione e la dissociazione: Medio Dissection (100 ml) Soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) – 98.5 ml 5 M HEPES pH 7,4-0,5 ml Penicillina-streptomicina (10.000 unità / ml e 10.000 mg / ml) – 1 ml Medio dissociazione (2 ml) HBSS – 1.760 ml 10x tripsina (2,5%) – 200 ml DNAse1 (1 mg / ml) – 40 microlitri Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) + 10% Fetal Calf Serum (FCS) (40 ml) DMEM -36 ml FCS – 4 ml Terreno completo (12 ml) Medie Neurobasal – 11,46 ml Supplemento B27 – 250 microlitri L-glutammina (200 mm) – 125 microlitri Glucosio (45%) – 165 microlitri 2. Filtro-sterilizzare l'% FCS DMEM + 10 e il mezzo completo e preequilibrate in un C / 5% CO 2 incubatore 37 °. Dissezione Sacrifica un ratto cucciolata P6-P7 (circa 12 cuccioli) per dislocazione cervicale e decapitare con le forbici. Fare un'incisione antero-posteriore in pelle lungo la sutura sagittale dal naso al cervelletto con una lama da bisturi. Sbucciare la pelle fuori e ripetere la stessa incisione lungo il cranio. Rimuovere delicatamente i lembi cranici con una pinza e rimuovere con attenzione il cervello con una spatola, avendo cura di includere i bulbi olfattivi. Tagliare il terzo più caudale del cervello e scartarla. Tritare the tessuto cerebrale in 1,4 millimetri di spessore fette coronali con un chopper tessuto. Mettere le fette in piatti contenenti medio dissezione a freddo e separare con cura utilizzando un ago. Il RMS appare come triangolare, zona traslucida nel centro di sezioni OB e come una piccola area circolare in più sezioni cerebrali caudale. Tagliare i RMS su ogni fetta con un coltello microchirurgico, avendo cura di evitare compreso il tessuto circostante. In P7 cuccioli di ratto, di solito i ~ 8 fette più rostrale (compresi OB) contengono RMS. Raccogliere i frammenti RMS con una pipetta Pasteur di plastica e metterli in un piccolo piatto contenente il mezzo di dissezione a freddo sul ghiaccio. Quando la dissezione è completa, trasferire i frammenti RMS in una provetta da 15 ml con una pipetta di plastica. Lasciare frammenti di stabilirsi sul fondo della provetta. Dissociazione Sostituire il mezzo dissezione con 2 ml di terreno dissociazione. Triturare i frammenti RMS delicatamente pipetting la sospensione frammento su e giù circa 10x con una pipetta P1000. Lasciare il tubo con i frammenti di tessuto in un bagno d'acqua a 37 ° per 2 min. Pipettare la soluzione nuovamente 10x e garantire che i frammenti si sono dissociati (la sospensione dovrebbe diventare torbida). Inattivare la tripsina aggiungendo 5 ml di preriscaldata DMEM + 10% FCS. Centrifugare la sospensione cellulare a 433 xg per 5 min. Nel un'aliquota frattempo la quantità necessaria di siRNA / DNA in provette Eppendorf (di solito 3-5 mg DNA / shRNA o 5-9 mg oligo siRNA per nucleofection, tuttavia la quantità di DNA / siRNA può richiedere ottimizzazione). Rimuovere eccesso di terreno e risospendere il pellet cellulare pipettando delicatamente in 5 ml di preriscaldata DMEM + 10% FCS. Eseguire un conteggio delle cellule. Aspettatevi ~ 1 x 10 6 cellule per piccoli dei ratti cervello. Un minimo di 2,5 x 10 6 cellule sono necessari per ogni nucleofection, mentrerisultati ottimali si ottengono con 3-4 x 10 6 cellule per nucleofection. Centrifugare la sospensione cellulare a 433 xg per 5 min. Assicurarsi di rimuovere quanto più mezzo possibile. 2. Nucleofection Subito risospendere il pellet cellulare in ratto (o il mouse se usando cellule di topo) soluzione nucleofection neurone precedentemente incubate a temperatura ambiente. Utilizzare 100 ml per nucleofection. Nota: in genere una cucciolata di 12 cuccioli di ratto è sufficiente per eseguire 4 nucleofections e una cucciolata mouse (12 cuccioli) è sufficiente per eseguire 2 nucleofections. Trasferire 100 microlitri della sospensione cellulare a ciascuna provetta Eppendorf contenente siRNA / DNA e mescolare delicatamente 2-3x pipettando con una pipetta P200. Aggiungere il campione (sospensione cell-DNA/siRNA) al fondo della nucleofectioncuvette, avendo cura di evitare bolle. Nucleofect utilizzando il programma G-013 (per le cellule di ratto) o O-005 (percellule di topo). Un nucleofection richiede circa 5 sec. Aggiungere rapidamente 1 ml di preriscaldata DMEM + 10% FCS al campione nucleofected. Ripetere i punti 2.4 e 2.5 per tutti gli altri campioni. Nota: per ottenere risultati ottimali, l'intera procedura nucleofection non dovrebbe durare più di 5 minuti. Trasferire ciascun campione in una provetta da 15 ml contenente 5 ml di preriscaldata DMEM + 10% FCS con la pipetta di plastica fornita dal kit nucleofection. Evitare il trasferimento delle eventuali detriti cellulari al tubo. Centrifugare i campioni a 433 xg per 5 min. Rimuovere con cautela tutta eccesso di terreno e risospendere il pellet in 25-30 ml di preriscaldata DMEM + 10% FCS con una pipetta P20. Non usare più di 30 ml di mezzo. Pipettare sospensione come una goccia sul lato interno di un coperchio piatto p35. Invertire il coperchio sopra il piatto p35 contenente 2 ml di mezzo completo (vedi anche figura 1). Lasciare in incubatrice (37 ° C / 5% di CO 2) peralmeno 5 ore e fino a 7 ore. Tempo di incubazione più lungo consente una migliore riaggregazione di gruppi di cellule. Trasferire le gocce che pendono dal coperchio in terreno completo nel piatto con una pipetta P1000 con una punta tagliata. Incubare a 37 ° C / 5% di CO 2 per 24 ore per nucleofections DNA e 48 ore per nucleofections siRNA / shRNA. 3. Incorporare Preparare mezzo completo (25 ml) e preequilibrate è a 37 ° C / 5% di CO 2 per alcune ore. Estrarre le aliquote congelate di matrice membrana basale da -80 ° C freezer e scongelare sul ghiaccio in camera fredda. Per ogni Nucleofection preparare un piatto di 6 centimetri che contiene fino a otto 13 millimetri coverlips sterili. Porre le capsule in una scatola di ghiaccio coperto con pellicola trasparente. E 'importante mantenere i coprioggetti fresco per prevenire solidificazione matrice durante la procedura di incorporamento. Per mantenere l'umidità, mettere una striscia di tessuto umido in un piatto di 15 centimetri che will essere utilizzato per contenere fino a tre piatti 6 centimetri contenenti i neuroblasti incorporati. Aggiungere mezzo completo alla matrice scongelato in un rapporto 1:3. Ad esempio, miscelare 40 ml di terreno completo con 120 ml di matrice pipettando. Questa quantità di matrice è sufficiente per l'incorporamento aggregati su otto coprioggetto 12 mm. Trasferire i gruppi di cellule reaggregated una provetta da 15 ml e centrifugare a 433 xg per 5 min. Rimuovere eccesso di terreno e risospendere il pellet in 10 ml di terreno completo. Mettere 2 ml di cellule di sospensione aggregato su ogni vetrino sterile e aggiungere 18 ml di matrice / medio impasto completo. Utilizzare la punta della pipetta per diffondere la matrice su tutta vetrino. Porre immediatamente la capsula di 6 cm contenente i coprioggetti nel piatto 15 centimetri e lasciare in incubatore (37 ° C / 5% di CO 2) per 15-20 minuti. Quando la matrice è solidificato, aggiungere delicatamente 5 ml di terreno completo per ogni sei centimetri assunzione piatto cura di spingeregiù qualsiasi vetrino galleggiante con una punta della pipetta. Incubare per 24 ore a 37 ° C / 5% di CO 2 per far neuroblasti migrano degli aggregati cellulari. 4. 3D migrazione Assay Preparare le soluzioni necessarie per immunoistochimica. Preparare la soluzione del blocco: Soluzione blocco Capra (50 ml) Soluzione tampone fosfato (PBS) – 5 ml Siero di capra – 7,5 ml 10% Triton X-100 – 1,5 ml BSA – 50 mg H 2 O – 36 ml Filtrare e conservare a 4 ° C. Preparare la soluzione di fissaggio: Soluzione di fissaggio (100 ml) Paraformaldeide (PFA) – 4 g ATTENZIONE: maneggiare sempre PFA sotto una cappa Saccarosio – 20 g (opzionale) PBS fino a 100 ml Su una piastra calda e sotto costante agitazione sciogliere il PFA in 80 ml di PBS mantenuta a 65 ° C. Una volta che il PFA è sciolta, aggiungere 20 g di saccarosio. Regolare il pH a7.4 (di solito con l'aggiunta di 60 microlitri ~ 1 M NaOH per 100 ml di soluzione). Portare a un volume totale di 100 ml con PBS. Immunostaining Mettere coprioggetto in una piastra da 24 pozzetti. Risciacquare coprioggetto con PBS 2x. Fissare gli aggregati neuroblasti RMS con soluzione di fissaggio per 45 minuti a temperatura ambiente. Risciacquare coprioggetto con PBS 3x (5 min / lavaggio – su una piattaforma oscillante). Bloccare per 30-60 min con la soluzione del blocco di capra. Diluire gli anticorpi primari in soluzione blocco di capra e incubare una notte a 4 ° C. (Se lo si desidera, falloidina fluorescente (1:400) e colorante Hoechst (1:10.000) possono anche essere aggiunti alla soluzione di anticorpo primario per visualizzare actina filamentosa e nuclei). Risciacquare coprioggetto con PBS 3x (5 min / lavaggio). Diluire anticorpi secondari in soluzione blocco capra e incubare per 2 ore a temperatura ambiente. Risciacquare coverslips con PBS 3x (5 min / lavaggio) Mount coprioggetto con mezzo di montaggio fluorescenti e lasciare asciugare per una notte a temperatura ambiente. Analisi di migrazione Cattura immagini di aggregati fissi neuroblasti RMS con un microscopio a fluorescenza con obiettivo 10X. Include una barra di scala un'immagine campione in. Per impostare la scala per quantificare, misurare la barra della scala nell'immagine selezionando lo strumento 'Retta' nella barra degli strumenti ImageJ. Scegliere l'opzione 'Analizza' e cliccare su 'impostare la scala'. Nella finestra scala di impostare la 'distanza nota' e spuntare la casella 'globale' per mantenere le stesse impostazioni per tutte le misurazioni. Utilizzare lo strumento 'linea segmentata' sulla barra degli strumenti ImageJ per misurare la distanza dal bordo dell'aggregato al lontano neuroblast migrato in 6 diversi settori in tutto l'intero aggregato (Figura 3B). Considerare solo isolato aggregates per l'analisi. Calcolare una distanza media migrazione dai valori 6 ottenuti per ciascun aggregato. Misura 10-20 aggregati per ciascuna condizione in ogni esperimento e piscina indipendenti risultati da un minimo di tre esperimenti indipendenti. Sempre includere un controllo nucleofection (ad es. GFP o un sh controllo / siRNA).