Kemirgen neuroblasts nucleofection Neuroblast Göç Eğitim için<em> In vitro</em
Summary
Neuroblast göç postnatal nörojenezindeki çok önemli bir adımdır. Protokol Burada açıklanan DNA / küçük firkete RNA (ShRNA) nucleofection ve kemirgen doğum sonrası rostral göçmen akımından izole nöroblast ile 3D göç deneyi kullanılarak neuroblast göç aday düzenleyicilerinin rolünü araştırmak için kullanılabilir.
Abstract
Lateral ventriküllerin lateral duvarında bulunan bölge subventricular (SVZ'una) yetişkin nöron temel bir rol oynar. Beynin bu kısıtlı alanda, nöral kök hücreler çoğalır ve sürekli koku ampul (OB) ulaşmak için rostral göçmen akışı (RMS) boyunca zincirlerinde teğet göç neuroblasts oluşturmak. Bir kez OB, Nöroblastlar radyal göç geçmek ve daha sonra önceden var olan nöronal ağ içine dahil etmek mümkün olgun nöronların içine ayırt. Uygun neuroblast göç yenidoğan nöronlarının fonksiyonel doğru olgunlaşmasını sağlamak, nöron temel bir adımdır. Hareketliliğini yatan hücre içi mekanizmaları araştıran, beyinde yaralı alanları hedef SVZ'una türetilmiş neuroblasts yeteneği verilen nöron anlayış geliştirmek değil, aynı zamanda nörorejeneratif stratejilerinin geliştirilmesini teşvik edebilir.
Bu el yazması ayrıntılı açıklarBirincil kemirgen transfeksiyonu için protokol sonrası neuroblasts ve in vivo olarak gözlenen göç bunların hareket mod yansıtan 3B, in vitro göçü deneyi kullanarak motilite analizi RMS. Her iki sıçan ve fare nöro plazmid DNA, küçük bir saç tokası (sh) RNA ya da kısa RNA oligo ilgi duyulan gen hedefleme (si) müdahale ile ya Nucleofection ile hızlı ve verimli bir şekilde transfekte edilmiş olabilir. Göç analiz etmek için, hücreler, nucleofected 'asılı damla "in reaggregated ve daha sonra üç boyutlu bir matris içinde yer almaktadır. Nucleofection başına anlamlı neuroblasts göç zarar vermez. Nucleofected ve reaggregated neuroblasts farmakolojik tedavi de neuroblast göç dahil sinyal yolları rolünü incelemek için yapılabilir.
Introduction
Yeni nöron (nöron) ve postnatal memeli beyin, nesil yaşam boyunca oluşur ve iki nörojenik nişler sınırlıdır: lateral ventriküllerin subventricular bölgesi (SVZ) ve hipokampus 1 kıvrımlarının subgranular bölge. Yapılan yeni çalışmalar, öğrenme ve hafıza görevleri 2,3 kolaylaştırmada yetişkin nöron önemli rolü olduğunu göstermiştir. Ayrıca, beyin hasarı 4-7 aşağıdaki sinir atalarıdır çoğalması ve işe kanıt nöral tamir nöron farmakolojik aktivasyon olasılığını yükseltir.
Doğum sonrası nöron kesinlikle nöral progenitör proliferasyon, göç, farklılaşma, hayatta kalma ve yeni doğan nöronlar 8 final sinaptik entegrasyon dahil tüm aşamaları, düzenlenir. SVZ'unda kök hücrelerinden elde edilen nöral atalarıdır (nöro) rostral göç ile büyük bir mesafe üzerinde göçişlevsel nöronlara 9 içine olgun koku ampul (OB) doğru akım (RMS). Göçmen Nöroblastlar tek bir lider süreci uzatılmış bir hücre gövdesi, ağırlıklı olarak tek kutuplu vardır. Bu hücreler bir başka 10 üzerinde kayar, toplu bir şekilde zincirleri hareket. Göç fonksiyonel nöronlar 11 içine SVZ'una türetilmiş atalarıdır sonraki olgunlaşması için çok önemli bir adımdır ve dahil olmak üzere birçok faktöre ve rehberlik moleküller tarafından kontrol edilir: polisialilatlanmış nöral hücre adezyon molekülü (PSA-NCAM) 12, Ephrins 13, 14 integrinlerin, yarıklar 15, büyüme faktörleri 16 ve 17 nörotransmitörlerinin, ancak bu sürecin altında yatan moleküler mekanizmalar tam olarak anlaşılmış değildir. Neuroblast göç düzenleyen hücre içi sinyal yollarını araştıran yetişkin nöron daha iyi anlaşılmasını sağlayacaktır değil sadece, aynı zamanda yeni tedavi gelişmesine katkı sağlayacakbeyin onarımı teşvik yaklaşır.
Bu makale Nucleofection ve 3D göç deneyi kullanılarak in vitro neuroblast göç aday düzenleyici rolünü incelemek için ayrıntılı bir protokol açıklar. Nucleofection elektroporasyon için geliştirilmiş bir yönteme göre, bir hücre transfeksiyon tekniktir. Hücre tipi özel elektrik akımı ve Nucleofection çözelti izin doğrudan hücre çekirdeği ve yavaş yavaş bölünmesi veya mitoz şeklinde memeli embriyonik ve nöron 18 gibi hareketsiz hücreleri içine transfeksiyonu izin bu DNA ve shRNA vektörler ve siRNA oligonükleotidler gibi polianyonik makromoleküllerin transferi. Bu yöntem, hızlı gerçekleştirmek için nispeten kolay ve primer neuroblasts ve nöron 19-21 dahil olmak üzere hücre tiplerinin geniş bir alanda yüksek oranda tekrarlanabilir olduğunu transfeksiyon ile sonuçlanır.
RMS doku ayrışma başarıyla DNA / SHR ile nucleofected olabilir göçmen neuroblasts izolasyonu sağlar,NA vektörler veya siRNA oligolar ilgi genleri hedef. Nucleofection sonra, nöro damla askıdaki reaggregated ve daha sonra üç boyutlu bir Matrigel matriksi içinde gömülü. Bu koşullar, böylece neuroblast göç katılan sinyal yolları araştırmak ve bu hücrelerin motilitesi üzerinde farmakolojik tedavilerin etkisini değerlendirmek için mükemmel bir model sistemi sağlayarak, nöro-vivo gözlenen göç modu yansıtan hücre agrega üzerinden geçiş için izin verir.
Protocol
Representative Results
Discussion
OB nihai konuma RMS boyunca neuroblasts göç postnatal nörojenezindeki temel bir adımdır. Ancak, bu karmaşık süreci kontrol eden moleküler mekanizmalar kadar tam olarak anlaşılmamıştır olmaktan vardır.
Burada tarif edilen deney prosedürü, in vitro neuroblast göç çalışma sağlar. Biz erken doğum sonrası fare veya sıçanın 25 RMS neuroblasts izole etmek için daha önce yayınlanan bir protokol adapte var. Bir asgari diseksiyonu ve nucleofection arasındaki zaman aralığını tutmak için çok önemlidir, çünkü en iyi sonuçları elde etmek için bu, diseksiyon adım master için önemlidir. Nucleofection sonra nöro-, reaggregated edilebilir üç boyutlu bir matris içine gömülmüş ve bir 24 saat süre boyunca ilerlemesine izin verilir. Seçenek olarak ise, taşıma (örneğin imüno-veya western blot analizi) başka amaçlar için, hücreler hemen polyornithine/laminin- on Nucleofection sonra kaplı olabilir4-5 güne kadar hayatta kaplı lamelleri. Fare ve sıçan nöro benzer ölçüde Matrigel göç, ancak fare hücreleri fare hücrelerinden daha zincirleri geçirmek için güçlü bir eğilimi göstermektedir.
Çalışmanın amacı bağlı olarak, nöro-floresan proteinleri veya ilgi duyulan vahşi tip / mutant proteinleri kodlayan farklı plazmitler ile nucleofected edilebilir. (CMV arttırıcı ve β-globin poli-A kuyruk ile β-aktin promoter) bir CAG promotör ile en iyi protein sentezleme plasmidleri için 26 derece tavsiye edilir. Ayrıca, siRNA veya oligos shRNA plasmidlerinin ilgilenilen hedefleri demonte nucleofected edilebilir. Etkin protein tükenmesi bağışıklık veya western blot (genellikle standart liziz tamponu 50 ul 1 sıçan yavru gömülü agregalar yokedici) ile görselleştirilebilir.
Nucleofection, birincil neuroblasts transfekte edilmesi için nispeten basit bir yöntemdir vi için daha kolay ve daha hızlı bir alternatifral vektör-aracılı transfeksiyon, ve yüksek (~% 70-80) transfeksiyon verimi elde edilebilir. Bu, büyük ölçüde hücre canlılığını azaltır uzun bir süre boyunca çözelti içerisinde Nucleofection neuroblasts bırakarak bu yana, Nucleofection işlem sırasında hızlı bir şekilde çalışması için önemlidir.
RMS diseksiyon ikinci ortalama hücre verimi P7 farelere kıyasla (~ 5 x 10 5 hücre / beyin) P7 fareler için nispeten düşüktür (~ 1 x 10 6 hücre / beyin) ve Nucleofection başına en az 3 x 10 6 hücre gerekmektedir % 50 verim ~ ile transfeksiyon elde etmek. Ayrıca, sıçan Nöroblastlar fare nöroblast göre nucleofection daha karşı görünür. Bu nedenle erken doğum sonrası (P6-P7) sıçan yavrular ayrıca fare ve sıçan RMS organizasyonu oldukça simi olduğunu düşünüyor, uygun bir neuroblast kaynağını temsil edebilirlar 27 ve in vitro olarak, sıçan ve fare neuroblast göç ölçüde da karşılaştırılabilir. Bu hücre morfolojisi ve göç (yayınlanmamış gözlemler) anormal etkileri önlemek için 48 saat daha uzun süre süspansiyon nucleofected neuroblasts reaggregated kümelerini tutmak için değil tavsiye edilir.
Burada tarif edilen deney, 3 boyutlu bir matris (örneğin,. 24 saat) gömme sonra sabit bir zaman noktasında neuroblast göç ölçmek için kullanılabilir. Agrega boyutu ve göç mesafesi (yayınlanmamış gözlemler) arasında anlamlı bir ilişki olduğu için farklı boyutlarda agrega, analizinde kullanılabilir. Görselleştirmek ve daha neuroblast göç dinamiklerini incelemek için, zaman atlamalı görüntüleme kullanılabilir. Bu neuroblasts hızı büyük ölçüde uzun zaman noktalarında (yayınlanmamış gözlemler) azaltmak için görünür beri, gömme sonra 24 saat aralığında göç analizi yürütmek için tavsiye edilir. </ P>
Bu protokol için bazı sınırlamalar vardır. Viral vektörler ile enfeksiyon yetişkin neuroblasts 28 için en etkili transfeksiyon yöntemi kalırken İlk olarak, Nucleofection kadar, erken doğum sonrası kemirgen neuroblasts için kullanılabilir. İkinci olarak, in vitro göçü deneyi tam olarak, in vivo olarak gözlenen RMS karmaşık mimarisini yeniden değildir. Gerçekten de, bu tür nöro da hareketliliğini 9,29 düzenleyen katkı astrositler ve kan damarları gibi diğer RMS bileşenlerle etkileşimi eksikliği burada açıklanan deney sisteminde, in vivo meslektaşları benzer bir şekilde geçirmek için yeteneğini korumak da, 30. Bu sorun üç boyutlu kokültürü modeli sistemlerinin optimizasyonu ile gelecekte ele alınabilir.
Sonuç olarak, 3D göç deneyi ile nucleofection birleştirerek daha altında yatan moleküler mekanizmaları anlamak için değerli bir aracı temsilneuroblast göç. Bu deneysel prosedür ayrıca in vivo doğum sonrası elektroporasyon ve beyin dilim kültürlerin time-lapse görüntüleme gibi diğer yaklaşımlarla valide edilebilir neuroblast göç aday regülatörleri, rolünü değerlendirmek için bir başlangıç, hızlı ve nispeten basit bir yöntem sağlar 28,31,32 .
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma PD ve GL verilen bir Wellcome Trust Projesi Grant (089236/Z/09/Z) tarafından finanse edildi. SG Bir Biyoteknoloji ve Biyolojik Bilimler Araştırma Konseyi Doktora öğrencilikle tarafından desteklenmiştir. Biz neuroblast nucleofection değerli tavsiye için ShRNA vektör ve Jennifer Shieh tür hediye için Matthieu Vermeren teşekkür ederim.
Materials
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Invitrogen Life Technologies | 14175129 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-25G | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen Life Technologies | 15140-122 | |
| 2.5% Trypsin-EDTA (10x) | Gibco | 15090-046 | store 200 µl aliquots at -20 °C |
| DNAse I Vial (D2) | Worthington | LK003170 | ≥1,000 units per vial; store 50 µl aliquots at -20 °C |
| Dulbecco Modified Eagle's Medium (DMEM) | Gibco | 11960-044 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Hyclone | SH3007902 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| B27 supplement | Invitrogen Life Technologies | 17504044 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Invitrogen Life Technologies | 25030-081 | |
| D-(+)-Glucose solution (45%) | Sigma-Aldrich | G8769 | |
| Matrigel Basement Membrane Matrix, Growth Factor Reduced (GFR), Phenol Red-free, 10 ml, LDEV-Free | BD Biosciences | 356231 | prepare 120 µl aliquots at 4 °C, then store at -80 °C |
| PFA | Sigma-Aldrich | 441242 | |
| Sucrose | BDH | 102745C | |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | 69023 | |
| Triton X-100 | VWR International Ltd. | 306324N | |
| BSA | Fisher Chemical | BPE9701-100 | |
| Dako fluorescence mounting medium | Dako | S3023 | |
| Rat neuron nucleofection kit | Lonza | VPG-1003 | |
| Mouse neuron nucleofection kit | Lonza | VPG-1001 | |
| Microsurgical knife | Angiotech | 7516 | |
| McIlwain tissue chopper | The Mickle Laboratory Engineering Company | ||
| Nucleofector II | Lonza |
References
- Ming, G. L., Song, H. J. Adult Neurogenesis in the Mammalian Brain: Significant Answers and Significant Questions. Neuron. 70, 687-702 (2011).
- Alonso, M., et al. Activation of adult-born neurons facilitates learning and and memory. Nat. Neurosci. 15, 897-U127 (2012).
- Lazarini, F., Lledo, P. M. Is adult neurogenesis essential for olfaction?. Trends Neurosci. 34, 20-30 (2011).
- Arvidsson, A., Collin, T., Kirik, D., Kokaia, Z., Lindvall, O. Neuronal replacement from endogenous precursors in the adult brain after stroke. Nat. Med. 8, 963-970 (2002).
- Jin, K. L., et al. Evidence for stroke-induced neurogenesis in the human brain. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 13198-13202 (2006).
- Kim, Y., Szele, F. G. Activation of subventricular zone stem cells after neuronal injury. Cell Tissue Res. 331, 337-345 (2008).
- Massouh, M., Saghatelyan, A. De-routing neuronal precursors in the adult brain to sites of injury: Role of the vasculature. Neuropharmacology. 58, 877-883 (2010).
- Pathania, M., Yan, L. D., Bordey, A. A symphony of signals conducts early and late stages of adult neurogenesis. Neuropharmacology. 58, 865-876 (2010).
- Lois, C., Alvarez-Buylla, A. Long-Distance Neuronal Migration in the Adult Mammalian Brain. Science. 264, 1145-1148 (1994).
- Lois, C., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. Chain migration of neuronal precursors. Science. 271, 978-981 (1996).
- Belvindrah, R., Nissant, A., Lledo, P. M. Abnormal Neuronal Migration Changes the Fate of Developing Neurons in the Postnatal Olfactory Bulb. J. Neurosci. 31, 7551-7562 (2011).
- Battista, D., Rutishauser, U. Removal of Polysialic Acid Triggers Dispersion of Subventricularly Derived Neuroblasts into Surrounding CNS Tissues. J .Neurosci. 30, 3995-4003 (2010).
- Conover, J. C., et al. Disruption of Eph/ephrin signaling affects migration and proliferation in the adult subventricular zone. Nat. Neurosci. 3, 1091-1097 (2000).
- Mobley, A. K., McCarty, J. H. beta 8 Integrin is Essential for Neuroblast Migration in the Rostral Migratory Stream. Glia. 59, 1579-1587 (2011).
- Nguyen-Ba-Charvet, K. T., et al. Multiple roles for slits in the control of cell migration in the rostral migratory stream. J. Neurosci. 24, 1497-1506 (2004).
- Garzotto, D., Giacobini, P., Crepaldi, T., Fasolo, A., De Marchis, S. Hepatocyte growth factor regulates migration of olfactory interneuron precursors in the rostral migratory stream through Met-Grb2 coupling. J. Neurosci. 28, 5901-5909 (2008).
- Platel, J. C., Stamboulian, S., Nguyen, I., Bordey, A. Neurotransmitter signaling in postnatal neurogenesis: The first leg. Brain Res. Rev. 63, 60-71 (2010).
- Dityateva, G., et al. Rapid and efficient electroporation-based gene transfer into primary dissociated neurons. J. Neurosci. Meth. 130, 65-73 (2003).
- Shieh, J. C., Schaar, B. T., Srinivasan, K., Brodsky, F. M., McConnell, S. K. Endocytosis Regulates Cell Soma Translocation and the Distribution of Adhesion Proteins in Migrating Neurons. PloS One. 6, (2011).
- Viesselmann, C., Ballweg, J., Lumbard, D., Dent, E. W. Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons. J. Vis. Exp. , e2373 (2011).
- Gartner, A., Collin, L., Lalli, G. Nucleofection of primary neurons. Method Enzymol. 406 (06), 374-388 (2006).
- Causeret, F., et al. The p21-Activated Kinase Is Required for Neuronal Migration in the Cerebral Cortex. Cereb. Cortex. 19, 861-875 (2009).
- Bron, R., Eickholt, B. J., Vermeren, M., Fragale, N., Cohen, J. Functional knockdown of neuropilin-1 in the developing chick nervous system by siRNA hairpins phenocopies genetic ablation in the mouse. Dev. Dynam. 230, 299-308 (2004).
- Sonego, M., et al. Fascin regulates the migration of subventricular zone-derived neuroblasts in the postnatal brain. J. Neurosci. 33, 12171-12185 (2013).
- Ward, M., Rao, Y. Investigations of neuronal migration in the central nervous system. Methods Mol. Biol. 294, 137-156 (2005).
- Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient Selection for High-Expression Transfectants with a Novel Eukaryotic Vector. Gene. 108, 193-199 (1991).
- Peretto, P., Giachino, C., Aimar, P., Fasolo, A., Bonfanti, L. Chain formation and glial tube assembly in the shift from neonatal to adult subventricular zone of the rodent forebrain. J. Comp. Neurol. 487, 407-427 (2005).
- Khlghatyan, J., Saghatelyan, A. Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain. J. Vis. Exp. , e4061 (2012).
- Bozoyan, L., Khlghatyan, J., Saghatelyan, A. Astrocytes Control the Development of the Migration-Promoting Vasculature Scaffold in the Postnatal Brain via VEGF Signaling. J. Neurosci. 32, 1687-1704 (2012).
- Whitman, M. C., Fan, W., Rela, L., Rodriguez-Gil, D. J., Greer, C. A. Blood Vessels Form a Migratory Scaffold in the Rostral Migratory Stream. J. Comp. Neurol. 516, 94-104 (2009).
- Sonego, M., Ya, Z., Oudin, M. J., Doherty, P., Lalli, G. In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain. J. Vis. Exp. , (2013).
- Feliciano, D. M., Lafourcade, C. A., Bordey, A., lique, Neonatal Subventricular Zone Electroporation. J. Vis. Exp. , e50197 (2013).
