Nucleofection من القوارض Neuroblasts لدراسة الهجرة أرومة عصبية<em> في المختبر</em
Summary
الهجرة أرومة عصبية هو خطوة حاسمة في تكوين الخلايا العصبية بعد الولادة. وصف بروتوكول هنا يمكن أن تستخدم للتحقيق في دور المنظمين مرشح للهجرة أرومة عصبية من خلال توظيف DNA / RNA الصغيرة دبوس (shRNA) nucleofection ومقايسة 3D الهجرة مع neuroblasts معزولة عن القوارض بعد الولادة منقاري تيار المهاجرة.
Abstract
منطقة subventricular (SVZ) الموجود في الجدار الجانبي من البطينين الوحشي يلعب دورا أساسيا في تكوين الخلايا العصبية الكبار. في هذه المنطقة المحظورة من الدماغ، والخلايا الجذعية العصبية تتكاثر وتولد باستمرار neuroblasts التي تهاجر بشكل طفيف في سلاسل على طول تيار المهاجرة منقاري (RMS) لتصل إلى البصلة الشمية (OB). مرة واحدة في OB، neuroblasts التحول إلى الهجرة شعاعي ثم تفرق في الخلايا العصبية الناضجة قادرة على أن تدرج في الشبكة العصبية الموجودة مسبقا. الهجرة أرومة عصبية الصحيح هو خطوة أساسية في تكوين الخلايا العصبية، وضمان نضوج وظيفية الصحيح من الخلايا العصبية الوليد. ونظرا لقدرة neuroblasts SVZ المستمدة من استهداف المناطق المصابة في الدماغ، والتحقيق في الآليات داخل الخلايا الكامنة وراء الحركة التي لن تعزز فقط فهم تكوين الخلايا العصبية ولكن أيضا يمكن أن تعزز وضع استراتيجيات neuroregenerative.
يصف هذا المخطوط مفصلةبروتوكول لترنسفكأيشن من القوارض الأولية RMS neuroblasts بعد الولادة وتحليل حركية بهم باستخدام 3D في المختبر فحص الهجرة تلخص طريقتهم في الهجرة لوحظت في الجسم الحي. ويمكن لكل من الجرذان والفئران neuroblasts تكون بسرعة وكفاءة transfected عبر nucleofection مع أي الحمض النووي البلازميد، دبوس صغير (ش) RNA أو قصيرة التدخل (الاشتراكية) oligos RNA استهداف الجينات في المصالح. لتحليل الهجرة، وreaggregated الخلايا nucleofected في 'قطرات شنقا' وبعد ذلك جزءا لا يتجزأ في مصفوفة ثلاثية الأبعاد. Nucleofection في حد ذاته لا يضعف بشكل كبير من الهجرة من neuroblasts. ويمكن أيضا العلاج الدوائي من neuroblasts nucleofected وreaggregated أن يؤديها لدراسة دور مسارات الإشارات التي تنطوي عليها الهجرة أرومة عصبية.
Introduction
في الثدييات بعد الولادة الدماغ، وتوليد خلايا عصبية جديدة (تكوين الخلايا العصبية) ويحدث في جميع مراحل الحياة ويقتصر على اثنين من منافذ العصبية: منطقة subventricular (SVZ) من البطينين الوحشي والمنطقة جزئي التحبب من التلفيف المسنن من الحصين 1. وقد أظهرت العديد من الدراسات الحديثة على الدور الهام للتكوين الخلايا العصبية الكبار في تسهيل مهام التعلم والذاكرة 2،3. علاوة على ذلك، دليل على انتشار وتجنيد الأسلاف العصبية التالية إصابات الدماغ 4-7 يثير إمكانية تفعيل الدوائية من تكوين الخلايا العصبية في إصلاح العصبية.
وينظم تكوين الخلايا العصبية بعد الولادة بدقة في جميع مراحلها، والتي تشمل انتشار العصبية السلف، والهجرة، والتمايز والبقاء، والتكامل متشابك النهائي من الخلايا العصبية المولود حديثا 8. الأسلاف العصبية (neuroblasts) المشتقة من الخلايا الجذعية في SVZ الهجرة على مسافة كبيرة من خلال المهاجرة منقاريتيار (RMS) نحو البصلة الشمية (OB) حيث تنضج الخلايا العصبية الوظيفية في 9. neuroblasts المهاجرة في الغالب أحادي القطب، مع خلايا الجسم ممدود تمتد عملية رائدة واحد. هذه الخلايا تتحرك في سلاسل بطريقة جماعية، ينزلق أكثر من 10 آخرين. الهجرة هي خطوة حاسمة لنضوج اللاحقة من الأسلاف SVZ المستمدة من الخلايا العصبية الوظيفية في 11 وتسيطر عليها عوامل متعددة والجزيئات التوجيه بما في ذلك: polysialylated العصبية جزيء التصاق الخلية (PSA-NCAM) 12، 13 Ephrins، لل integrins 14، 15 الشقوق، عوامل النمو 16 و 17 الناقلات العصبية، ولكن الآليات الجزيئية الكامنة وراء هذه العملية ليست مفهومة تماما. وسوف تحقق في مسارات الإشارات داخل الخلايا تنظيم الهجرة أرومة عصبية ليس فقط توفير فهم أفضل لتكوين الخلايا العصبية الكبار، ولكن سوف تسهم أيضا في تطوير علاجية جديدةالنهج لتعزيز إصلاح الدماغ.
يصف هذا المخطوط بروتوكول مفصلة لدراسة دور المنظمين مرشح للهجرة أرومة عصبية في المختبر باستخدام nucleofection ومقايسة الهجرة 3D. Nucleofection هو أسلوب ترنسفكأيشن الخلية يعتمد على طريقة محسنة من التثقيب الكهربائي. خلية من نوع التيار الكهربائي محددة والحل nucleofection السماح بنقل الجزيئات polyanionic مثل الحمض النووي وناقلات shRNA وأليغنوكليوتيد سيرنا مباشرة في نواة الخلية وترنسفكأيشن تصريح تقسيم ببطء أو ميتوتيكلي الخلايا الخاملة مثل الخلايا العصبية الجنينية والثدييات 18. هذا الأسلوب هو سريعة وسهلة نسبيا لأداء ونتائج في ترنسفكأيشن تكرار للغاية من مجموعة واسعة من أنواع الخلايا بما في ذلك الخلايا العصبية الابتدائية وneuroblasts 19-21.
تفكك الأنسجة RMS يسمح عزلة neuroblasts المهاجرة، والتي يمكن nucleofected بنجاح مع الحمض النووي / SHRناقلات NA أو oligos سيرنا استهداف الجينات في المصالح. nucleofection التالية، يتم reaggregated neuroblasts في شنقا قطرات وجزءا لا يتجزأ في وقت لاحق في Matrigel مصفوفة ثلاثية الأبعاد. هذه الظروف تسمح neuroblasts إلى الهجرة من المجاميع الخلية تلخص وضع الهجرة لوحظت في الجسم الحي، وبالتالي توفير نظام نموذجا ممتازا للتحقيق في مسارات الإشارات التي تنطوي عليها الهجرة وأرومة عصبية لتقييم تأثير العلاجات الدوائية على حركية هذه الخلايا.
Protocol
Representative Results
Discussion
هجرة neuroblasts على طول RMS إلى الموقع النهائي في OB هو خطوة أساسية في تكوين الخلايا العصبية بعد الولادة. ومع ذلك، فإن آليات الجزيئية التي تتحكم في هذه العملية المعقدة بعيدة كل البعد عن أن يكون مفهوما بشكل كامل.
إجراء التجارب وصفها هنا يسمح للدراسة الهجرة أرومة عصبية في المختبر. تكيفنا بروتوكول نشرت سابقا لعزل RMS neuroblasts من المبكر بعد الولادة الماوس أو الفئران 25. لتحقيق أفضل النتائج من المهم لإتقان الخطوة تشريح، لأنه أمر حاسم للحفاظ على الفاصل الزمني بين التشريح وnucleofection إلى الحد الأدنى. بعد nucleofection، neuroblasts يمكن reaggregated، جزءا لا يتجزأ في مصفوفة ثلاثية الأبعاد وغادر إلى الهجرة خلال فترة 24 ساعة. بدلا من ذلك، لأغراض أخرى غير الهجرة (على سبيل المثال المناعي أو تحليل لطخة غربية)، وخلايا يمكن مطلي مباشرة بعد nucleofection على polyornithine/laminin-coverslips المغلفة، حيث يعيش ما يصل إلى 4-5 أيام. الفأر والفئران تهاجر neuroblasts في Matrigel إلى حد مماثلة، ولكن تظهر خلايا فأر لديهم ميل إلى الهجرة أقوى في سلاسل من خلايا الفئران.
اعتمادا على الهدف من هذه الدراسة، neuroblasts يمكن nucleofected مع البلازميدات مختلفة ترميز البروتينات الفلورية أو نوع / متحولة البروتينات البرية من الفائدة. لأفضل البلازميدات البروتين التعبير مع المروج CAG (β أكتين المروج مع محسن CMV وغلوبين بولي β-A الذيل) ويوصى بشدة 26. علاوة على ذلك، oligos سيرنا أو البلازميدات shRNA يمكن nucleofected لضربة قاضية من الأهداف الفائدة. استنزاف البروتين فعالة يمكن تصور بواسطة المناعي أو لطخة غربية (عادة lysing المجاميع جزءا لا يتجزأ من 1 الفئران الجرو مع 50 ميكرولتر من العازلة تحلل قياسي).
Nucleofection هي طريقة بسيطة نسبيا لبالنقل neuroblasts الأولية، ويقدم بديلا أسهل وأسرع لالسادسراؤول بوساطة ناقلات ترنسفكأيشن، ويمكن تحقيق عالية (~ 70-80٪) كفاءة ترنسفكأيشن. فمن الأهمية بمكان أن تعمل بسرعة أثناء إجراء nucleofection، منذ ان ترك neuroblasts في حل nucleofection لفترة طويلة يقلل بشكل كبير بقاء الخلية.
ومتوسط العائد خلية من RMS تشريح منخفضة نسبيا بالنسبة للفئران P7 (~ 5 × 10 5 خلية / الدماغ) بالمقارنة مع الفئران P7 (~ 1 × 10 6 خلية / الدماغ) ويطلب من لا يقل عن 3 × 10 6 خلايا في nucleofection لتحقيق الكفاءة ترنسفكأيشن مع ~ 50٪. علاوة على ذلك، تظهر neuroblasts الفئران لمقاومة أفضل للnucleofection مقارنة neuroblasts الماوس. وبالتالي، الجراء بعد الولادة المبكرة (P6-P7) الفئران قد تمثل مصدرا أرومة عصبية مريحة، معتبرا أيضا أن تنظيم الجرذان والفئران RMS هي سيمي بشكل ملحوظلار 27 وأن مدى الجرذان والفئران في المختبر أرومة عصبية الهجرة هي أيضا قابلة للمقارنة. فإنه من المستحسن عدم إبقاء الكتل reaggregated من neuroblasts nucleofected في التعليق لمدة أطول من 48 ساعة لتجنب آثار غير طبيعية على التشكل الخلية والهجرة (الملاحظات غير منشورة لدينا).
مقايسة 3D الموصوفة هنا يمكن أن تستخدم لقياس الهجرة أرومة عصبية عند نقطة زمنية محددة بعد التضمين في المصفوفة (على سبيل المثال 24 ساعة). مجاميع من أحجام مختلفة يمكن استخدامها في التحليل، حيث لا يوجد ارتباط كبير بين حجم الركام وبعد الهجرة (الملاحظات غير منشورة لدينا). لتصور ومواصلة التحقيق في ديناميات الهجرة أرومة عصبية، ويمكن استخدام الوقت الفاصل بين التصوير. فمن المستحسن لإجراء التحليل الهجرة ضمن فاصل زمني 24 ساعة بعد التضمين، منذ سرعة neuroblasts يبدو أن ينخفض بشكل كبير في نقاط زمنية أطول (الملاحظات غير منشورة لدينا). </ ع>
هناك بعض القيود على هذا البروتوكول. الأولى، nucleofection يمكن أن تستخدم حتى الآن في أوائل neuroblasts القوارض بعد الولادة، في حين العدوى الفيروسية مع نواقل يبقى الأسلوب الأكثر فعالية لترنسفكأيشن neuroblasts الكبار 28. الثانية، في المختبر فحص الهجرة لا تتكاثر بشكل كامل العمارة المعقدة للRMS لوحظت في الجسم الحي. في الواقع، على الرغم من neuroblasts الحفاظ على القدرة على الهجرة بطريقة مماثلة لنظيراتها في الجسم الحي، في الإعداد التجريبية وصفها هنا أنها تفتقر إلى التفاعل مع غيرها من مكونات RMS مثل الخلايا النجمية والأوعية الدموية، والتي تسهم أيضا في تنظيم الحركة على 9،29، 30. ويمكن معالجة هذه المسألة في المستقبل عن طريق الاستفادة المثلى من نظم نموذج coculture ثلاثية الأبعاد.
في الختام، والجمع بين nucleofection مع مقايسة الهجرة 3D يمثل أداة قيمة لفهم أفضل للآليات الجزيئية الكامنة وراءالهجرة أرومة عصبية. يوفر هذا الإجراء التجريبي وسيلة أولية وسريعة وبسيطة نسبيا لتقييم دور المنظمين مرشح للهجرة أرومة عصبية، والتي يمكن التحقق من صحتها عن طريق مزيد من المناهج الأخرى مثل التثقيب الكهربائي في الجسم الحي بعد الولادة والوقت الفاصل بين التصوير من الثقافات شريحة الدماغ 28،31،32 .
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم تمويل هذا العمل من قبل ويلكوم ترست مشروع المنح منحت لPD وGL (089236/Z/09/Z). وأيد من قبل SG التكنولوجيا الحيوية والدكتوراه مجلس بحوث العلوم البيولوجية studentship. نشكر ماتيو Vermeren للهدية نوع من ناقلات shRNA وجنيفر لShieh النصائح القيمة على أرومة عصبية nucleofection.
Materials
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Invitrogen Life Technologies | 14175129 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-25G | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen Life Technologies | 15140-122 | |
| 2.5% Trypsin-EDTA (10x) | Gibco | 15090-046 | store 200 µl aliquots at -20 °C |
| DNAse I Vial (D2) | Worthington | LK003170 | ≥1,000 units per vial; store 50 µl aliquots at -20 °C |
| Dulbecco Modified Eagle's Medium (DMEM) | Gibco | 11960-044 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Hyclone | SH3007902 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| B27 supplement | Invitrogen Life Technologies | 17504044 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Invitrogen Life Technologies | 25030-081 | |
| D-(+)-Glucose solution (45%) | Sigma-Aldrich | G8769 | |
| Matrigel Basement Membrane Matrix, Growth Factor Reduced (GFR), Phenol Red-free, 10 ml, LDEV-Free | BD Biosciences | 356231 | prepare 120 µl aliquots at 4 °C, then store at -80 °C |
| PFA | Sigma-Aldrich | 441242 | |
| Sucrose | BDH | 102745C | |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | 69023 | |
| Triton X-100 | VWR International Ltd. | 306324N | |
| BSA | Fisher Chemical | BPE9701-100 | |
| Dako fluorescence mounting medium | Dako | S3023 | |
| Rat neuron nucleofection kit | Lonza | VPG-1003 | |
| Mouse neuron nucleofection kit | Lonza | VPG-1001 | |
| Microsurgical knife | Angiotech | 7516 | |
| McIlwain tissue chopper | The Mickle Laboratory Engineering Company | ||
| Nucleofector II | Lonza |
References
- Ming, G. L., Song, H. J. Adult Neurogenesis in the Mammalian Brain: Significant Answers and Significant Questions. Neuron. 70, 687-702 (2011).
- Alonso, M., et al. Activation of adult-born neurons facilitates learning and and memory. Nat. Neurosci. 15, 897-U127 (2012).
- Lazarini, F., Lledo, P. M. Is adult neurogenesis essential for olfaction?. Trends Neurosci. 34, 20-30 (2011).
- Arvidsson, A., Collin, T., Kirik, D., Kokaia, Z., Lindvall, O. Neuronal replacement from endogenous precursors in the adult brain after stroke. Nat. Med. 8, 963-970 (2002).
- Jin, K. L., et al. Evidence for stroke-induced neurogenesis in the human brain. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 13198-13202 (2006).
- Kim, Y., Szele, F. G. Activation of subventricular zone stem cells after neuronal injury. Cell Tissue Res. 331, 337-345 (2008).
- Massouh, M., Saghatelyan, A. De-routing neuronal precursors in the adult brain to sites of injury: Role of the vasculature. Neuropharmacology. 58, 877-883 (2010).
- Pathania, M., Yan, L. D., Bordey, A. A symphony of signals conducts early and late stages of adult neurogenesis. Neuropharmacology. 58, 865-876 (2010).
- Lois, C., Alvarez-Buylla, A. Long-Distance Neuronal Migration in the Adult Mammalian Brain. Science. 264, 1145-1148 (1994).
- Lois, C., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. Chain migration of neuronal precursors. Science. 271, 978-981 (1996).
- Belvindrah, R., Nissant, A., Lledo, P. M. Abnormal Neuronal Migration Changes the Fate of Developing Neurons in the Postnatal Olfactory Bulb. J. Neurosci. 31, 7551-7562 (2011).
- Battista, D., Rutishauser, U. Removal of Polysialic Acid Triggers Dispersion of Subventricularly Derived Neuroblasts into Surrounding CNS Tissues. J .Neurosci. 30, 3995-4003 (2010).
- Conover, J. C., et al. Disruption of Eph/ephrin signaling affects migration and proliferation in the adult subventricular zone. Nat. Neurosci. 3, 1091-1097 (2000).
- Mobley, A. K., McCarty, J. H. beta 8 Integrin is Essential for Neuroblast Migration in the Rostral Migratory Stream. Glia. 59, 1579-1587 (2011).
- Nguyen-Ba-Charvet, K. T., et al. Multiple roles for slits in the control of cell migration in the rostral migratory stream. J. Neurosci. 24, 1497-1506 (2004).
- Garzotto, D., Giacobini, P., Crepaldi, T., Fasolo, A., De Marchis, S. Hepatocyte growth factor regulates migration of olfactory interneuron precursors in the rostral migratory stream through Met-Grb2 coupling. J. Neurosci. 28, 5901-5909 (2008).
- Platel, J. C., Stamboulian, S., Nguyen, I., Bordey, A. Neurotransmitter signaling in postnatal neurogenesis: The first leg. Brain Res. Rev. 63, 60-71 (2010).
- Dityateva, G., et al. Rapid and efficient electroporation-based gene transfer into primary dissociated neurons. J. Neurosci. Meth. 130, 65-73 (2003).
- Shieh, J. C., Schaar, B. T., Srinivasan, K., Brodsky, F. M., McConnell, S. K. Endocytosis Regulates Cell Soma Translocation and the Distribution of Adhesion Proteins in Migrating Neurons. PloS One. 6, (2011).
- Viesselmann, C., Ballweg, J., Lumbard, D., Dent, E. W. Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons. J. Vis. Exp. , e2373 (2011).
- Gartner, A., Collin, L., Lalli, G. Nucleofection of primary neurons. Method Enzymol. 406 (06), 374-388 (2006).
- Causeret, F., et al. The p21-Activated Kinase Is Required for Neuronal Migration in the Cerebral Cortex. Cereb. Cortex. 19, 861-875 (2009).
- Bron, R., Eickholt, B. J., Vermeren, M., Fragale, N., Cohen, J. Functional knockdown of neuropilin-1 in the developing chick nervous system by siRNA hairpins phenocopies genetic ablation in the mouse. Dev. Dynam. 230, 299-308 (2004).
- Sonego, M., et al. Fascin regulates the migration of subventricular zone-derived neuroblasts in the postnatal brain. J. Neurosci. 33, 12171-12185 (2013).
- Ward, M., Rao, Y. Investigations of neuronal migration in the central nervous system. Methods Mol. Biol. 294, 137-156 (2005).
- Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient Selection for High-Expression Transfectants with a Novel Eukaryotic Vector. Gene. 108, 193-199 (1991).
- Peretto, P., Giachino, C., Aimar, P., Fasolo, A., Bonfanti, L. Chain formation and glial tube assembly in the shift from neonatal to adult subventricular zone of the rodent forebrain. J. Comp. Neurol. 487, 407-427 (2005).
- Khlghatyan, J., Saghatelyan, A. Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain. J. Vis. Exp. , e4061 (2012).
- Bozoyan, L., Khlghatyan, J., Saghatelyan, A. Astrocytes Control the Development of the Migration-Promoting Vasculature Scaffold in the Postnatal Brain via VEGF Signaling. J. Neurosci. 32, 1687-1704 (2012).
- Whitman, M. C., Fan, W., Rela, L., Rodriguez-Gil, D. J., Greer, C. A. Blood Vessels Form a Migratory Scaffold in the Rostral Migratory Stream. J. Comp. Neurol. 516, 94-104 (2009).
- Sonego, M., Ya, Z., Oudin, M. J., Doherty, P., Lalli, G. In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain. J. Vis. Exp. , (2013).
- Feliciano, D. M., Lafourcade, C. A., Bordey, A., lique, Neonatal Subventricular Zone Electroporation. J. Vis. Exp. , e50197 (2013).
