Nucleofectie van knaagdieren neuroblasts om neuroblast Migratie Studie<em> In vitro</em

Deze procedure is in overeenstemming met de UK Home Office Verordeningen (Animal Wetenschappelijke Procedures Act, 1986). Wetenschappers zouden de gevestigde en door hun institutionele en nationale dier regelgevende organisaties goedgekeurde richtlijnen te volgen. 1. Dissectie en dissociatie van Rat RMS neuroblasts Bereid de voor RMS dissectie en dissociatie oplossingen: Dissectie medium (100 ml) Hank's gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) – 98.5 ml 5 M HEPES pH 7,4-0,5 ml Penicilline-streptomycine (10.000 eenheden / ml en 10.000 pg / ml) – 1 ml Dissociatie medium (2 ml) HBSS – 1.760 ml 10x trypsine (2,5%) – 200 pl DNAse1 (1 mg / ml) – 40 pl Dulbecco Modified Eagle's Medium (DMEM) + 10% foetaal kalfsserum (FCS) (40 ml) DMEM -36 ml FCS – 4 ml Compleet medium (12 ml) Neurobasal medium – 11.46 ml B27 supplement – 250 pl L-glutamine (200 mM) – 125 pl Glucose (45%) – 165 pl 2. Filter-steriliseer de DMEM + 10% FCS en compleet medium en preequilibrate ze in een 37 ° C / 5% CO2 incubator. Ontleding Offer een P6-P7 rat nest (ongeveer 12 pups) door cervicale dislocatie en onthoofden met een schaar. Maak een achterwaartse insnijding in de huid langs de mid-pijlnaad van de neus naar de kleine hersenen met een scalpel. Schil de huid uit en herhaal dezelfde incisie langs de schedel. Verwijder voorzichtig de craniale flappen met een tang en verwijder voorzichtig de hersenen met een spatel, zorg ervoor dat de olfactorische bollen bevatten. Snijd de meest caudale derde van de hersenen en gooi hem weg. Hak the hersenweefsel in 1,4 mm dikke coronale plakjes met een tissue chopper. Leg plakjes in gerechten met koud dissectie medium en ze voorzichtig los met behulp van een naald. De RMS verschijnt als een driehoekige, doorzichtige gebied in het centrum van OB secties en als een klein cirkelvormig gebied meer caudale hersencoupes. Snijd de RMS uit elk sneetje met een microchirurgische mes, zorg om te voorkomen inclusief omliggende weefsel. In P7 rattenpups, meestal de ~ 8 meest rostrale plakjes (inclusief OB) bevatten de RMS. Verzamel de RMS-fragmenten met een plastic Pasteur pipet en plaats ze in een kleine schotel met koud dissectie medium op ijs. Wanneer de dissectie is voltooid, breng de RMS fragmenten in een 15 ml buisje met een plastic pipet. Voeg fragmenten bezinken op de bodem van de buis. Dissociatie Vervang de dissectie medium met 2 ml dissociatie medium. Vermaal de RMS-fragmenten door zachtjes pipetting het fragment ophanging op en neer over 10x met behulp van een P1000 pipet. Laat de buis met het weefsel fragmenten in een 37 ° C waterbad gedurende 2 minuten. Pipetteer de oplossing weer 10x en ervoor te zorgen dat fragmenten hebben gedistantieerd (de suspensie moet troebel). Inactivatie van het trypsine door toevoeging 5 ml voorverwarmde DMEM + 10% FCS. Centrifugeer de celsuspensie bij 433 xg gedurende 5 minuten. Ondertussen monster de vereiste hoeveelheid siRNA / DNA in Eppendorf buisjes (meestal 3-5 ug DNA / shRNA of 5-9 ug siRNA oligo per nucleofection, maar de hoeveelheid DNA / siRNA kan optimalisering vereisen). Verwijder overtollig medium en resuspendeer de cel pellet door voorzichtig pipetteren in 5 ml voorverwarmde DMEM + 10% FCS. Voer een celgetal. Verwacht ~ 1 x 10 6 cellen per rat pup hersenen. Een minimum van 2,5 x 10 6 cellen voor elke nucleofection, terwijloptimale resultaten worden bereikt met behulp van 3-4 x 10 6 cellen per nucleofectie. Centrifugeer de celsuspensie bij 433 xg gedurende 5 minuten. Zorg ervoor dat u zo veel medium te verwijderen als mogelijk. 2. Nucleofectie Onmiddellijk resuspendeer de celpellet in ratten (of muizen bij gebruik muizencellen) neuron nucleofection oplossing die vooraf geïncubeerd bij kamertemperatuur. Gebruik 100 ul per nucleofectie. Opmerking: typisch een rat nest van 12 pups is voldoende om 4 nucleofections presteren en een muis nest (12 pups) is voldoende om 2 nucleofections voeren. Breng 100 pi van de celsuspensie aan elk Eppendorf buis met siRNA / DNA en meng voorzichtig 2-3x door pipetteren met een pipet P200. Voeg de steekproef (cell-DNA/siRNA schorsing) aan de onderkant van de nucleofectioncuvette, zorg om luchtbellen te voorkomen. Nucleofect behulp van het programma G-013 (voor cellen rat) of O-005 (voormuizencellen). Een nucleofectie duurt ongeveer 5 sec. Voeg snel 1 ml voorverwarmde DMEM + 10% FCS aan de nucleofected monster. Herhaal de stappen 2.4 en 2.5 voor alle andere monsters. Opmerking: voor een optimaal resultaat, dient de gehele nucleofectie procedure niet langer dan 5 minuten duren. Breng elk monster een 15 ml buis met 5 ml voorverwarmd DMEM + 10% FCS met de plastic pipet door de nucleofection kit. Vermijd de overdracht van eventuele cellulaire puin aan de buis. Centrifugeer monsters bij 433 xg gedurende 5 minuten. Verwijder voorzichtig alle overtollige medium en resuspendeer de pellet in 25-30 ul voorverwarmde DMEM + 10% FCS met een P20 pipet. Gebruik niet meer dan 30 pl medium. Pipetteer de suspensie als een druppel op de binnenzijde van een p35 schotel deksel. Inverteer de deksel via p35 schaaltje met 2 ml compleet medium (zie ook figuur 1). Laat in de incubator (37 ° C / 5% CO2) gedurendeminste 5 uur en maximaal 7 uur. Langere incubatietijd maakt een betere reaggregation van celgroepen. Breng de hangende druppels van het deksel in de compleet medium in de schotel met een P1000 pipet met een cut tip. Incubeer bij 37 ° C / 5% CO2 gedurende 24 uur voor DNA nucleofections en 48 uur voor siRNA / shRNA nucleofections. 3. Inbedding Bereid compleet medium (25 ml) en preequilibrate het bij 37 ° C / 5% CO2 gedurende enkele uren. Haal de bevroren monsters van basaal membraan matrix van -80 ° C vriezer en ontdooien op ijs in de koude kamer. Per nucleofection een 6 cm schaaltje met maximaal acht 13 mm steriel coverlips bereiden. Leg de gerechten op een ice box bedekt met plasticfolie. Het is belangrijk om de dekglaasjes koelen matrix stollen tijdens het inbedden procedure voorkomen. Om de vochtigheid te behouden, plaats een strook van vochtige weefsel in een 15 cm schotel die wziek worden gebruikt om maximaal drie 6 cm schalen met de embedded neuroblasts. Voeg compleet medium aan de ontdooide matrix in een 01:03 verhouding. Bijvoorbeeld, meng 40 pl compleet medium met 120 gl matrix door pipetteren. Deze hoeveelheid is voldoende voor matrix inbedden aggregaten acht 12 mm dekglaasjes. Breng het opnieuw geaggregeerde cel clusters aan een 15 ml buis en centrifugeer bij 433 xg gedurende 5 minuten. Verwijder overtollig medium en resuspendeer de pellet in 10 ul volledig medium. Plaats 2 pl cel totale schorsing op elke steriele dekglaasje en voeg 18 ul van matrix / volledig medium mengsel. Gebruik de pipet tip om de matrix over de gehele dekglaasje verspreid. Onmiddellijk de 6 cm schaaltje met de dekglaasjes in de 15 cm schaal en laat in de incubator (37 ° C / 5% CO2) gedurende 15-20 minuten. Als de matrix is ​​gestold, zachtjes voeg 5 ml compleet medium aan elk 6 cm schotel verzorgen te duwenonderaan een drijvend dekglaasje met een pipet tip. Incubeer 24 uur bij 37 ° C / 5% CO 2 te laten neuroblasts migreren uit de cel aggregaten. 4. 3D Migratie Assay Bereid de voor immunokleuring oplossingen. Bereid het blok oplossing: Geit blok-oplossing (50 ml) Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) – 5 ml Geitserum – 7,5 ml 10% Triton X-100 – 1,5 ml BSA – 50 mg H 2 O – 36 ml Filter en bewaar bij 4 ° C. Bereid de vaststelling oplossing: Bevestiging (100 ml) Paraformaldehyde (PFA) – 4 g LET OP: altijd behandelen PFA onder een kap Sucrose – 20 g (optioneel) PBS tot 100 ml Op een hete plaat en onder constant roeren opgelost PFA in 80 ml PBS gehouden op 65 ° C. Zodra de PFA is opgelost, voeg 20 g sucrose. Breng de pH op7.4 (gewoonlijk door toevoeging ~ 60 pi 1 M NaOH per 100 ml oplossing). Breng tot een totaal volume van 100 ml met PBS. Immunostaining Plaats dekglaasjes in een 24-well plaat. Spoel coverslips met PBS 2x. Bevestig de RMS neuroblast aggregaten met bevestigings oplossing gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur. Spoel coverslips met PBS 3x (5 min / wasbeurt – op een schommelende platform). Blok voor 30-60 min met geit blok oplossing. Verdun primaire antilichamen bij geiten blok-oplossing en incubeer overnacht bij 4 ° C. (Indien gewenst, fluorescent phalloidin (1:400) en Hoechst kleurstof (1:10.000) kan ook worden toegevoegd aan het primaire antilichaam oplossing filamenteuze actine en kernen zichtbaar). Spoel coverslips met PBS 3x (5 min / wasbeurt). Verdun secundaire antilichamen bij geiten blok-oplossing en incubeer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur geroerd. Spoel coverslips met PBS 3x (5 min / wasbeurt) Mount coverslips met fluorescerende montage medium en laat een nacht drogen bij kamertemperatuur. Migratie Analyse Beelden vastleggen van vaste RMS neuroblast aggregaten met een fluorescentiemicroscoop met een 10X objectief. Omvatten een schaal bar afbeelding een monster in. Voor het instellen van de schaal voor de kwantificering, meet de schaal bar in het beeld door het selecteren van de 'Rechte lijn' tool op de ImageJ werkbalk. Kies de optie 'Analyseren' en klik op 'zet de schaal'. In de schaal venster in te stellen de 'bekende afstand' en vink de 'global' box om dezelfde instellingen voor alle metingen te houden. Gebruik de 'Gesegmenteerde lijn' tool op de ImageJ werkbalk om de afstand te meten vanaf de rand van het aggregaat naar de verste gemigreerd neuroblast in 6 verschillende sectoren over de gehele aggregaat (Figuur 3B). Besteed alleen geïsoleerd aggregates voor analyse. Bereken een gemiddelde migratie afstand van de 6 waarden verkregen voor ieder aggregaat. Meet 10-20 aggregaten voor elke aandoening in elke onafhankelijke experiment en het zwembad de resultaten van een minimum van drie onafhankelijke experimenten. Vermeld altijd een nucleofectie controle (bv. GFP of een controle-sh / siRNA).