Микроинъекция раны Анализ и<em> В естественных условиях</em> Локализация эпидермального ран реагирования журналистам в<em> Дрозофилы</em> Эмбрионы.

Протокол дрозофилы эмбриональных рана могут быть сведены в пять этапов: (1) сбор эмбрионов, (2) Эмбрион Подготовка (3) Эмбрион Ранение, (4) Эмбрион Микроинъекция, и (5) Эмбрион Фиксация. 1. Эмбрионов Соберите взрослых мух, через 2-3 дня после eclosing, добавить 50 женщин и 25 мужчин к отбору эмбрионов клетки. Поставьте свежий яблочный сок агар плюс дрожжевой тарелку каждое утро в течение 3-х дней. Примечания: для оптимального по отбору эмбрионов, цикла мухи на 12 час суточного графика в инкубаторе 25 ° C (5:00 фары "ON" и 17:00 огни "OFF"); женские мухи реагировать на изменения в световом цикле и сдаст большее количество яиц во время перехода от огней "ON" на огни "OFF" 10,11. Во второй половине дня Дня-3, место свежего яблочного сока плюс дрожжевой агар пластины на клетке и собирать эмбрионов в течение 2 часов. Установите новую дрожжей пластину на клетке и сохранить2 коллекция ч пластины. Храните сбора пластина для дополнительного 14 ч при 25 ° С с возрастом эмбрионов. Примечания: Заживление ран можно анализировать на любом этапе развития Drosophila, рана-индуцированной транскрипции репортеры, описанные в данном документе, имеют оптимальную активность между этапами 15-16 12. К концу стадии 17, эмбрион слишком стар, чтобы легко проколоть созревания кутикулу и эффективно активировать раны журналистам или обнаружить раны, вызванной транскрипцию. Чтобы дать время сбор и ранение время происходят во время пика лабораторных часов, мы следуем график отбора эмбрионов в течение 2 часов (16:00-18:00), обменять сбора тарелку с новой пластинкой в ​​18:00, возраст сбор пластина при 25 ° С в течение 14 ч (в течение ночи), и наматывают эмбрионов в 08:00 (на следующий день). 2. Эмбрион Подготовка Примечания: Этот протокол включает в себя использование многих инструментов и объектов, которые находятся острые или из гдевушка. Обращайтесь со всеми острыми инструментами и стеклянные объекты с осторожностью, чтобы избежать травм. Аккуратно удалите эмбрионы из коллекции пластинок с кистью, добавляя 2-3 мл воды к пластине и закрученного. Перевести воду и эмбрионов от пластины к нейлоновая сетка и сбор трубки. Добавить 4-5 мл отбеливателя на крышке пластиковой чашке Петри пластины и выдержите сетки покрытый конец коллекции пробирку, содержащую эмбрионов в отбеливателя в течение 2 мин; который удаляет внешнюю скорлупу эмбриона. Вручную поверните пробирку пару раз, чтобы предотвратить эмбрионы из слипания в отбеливатель. Промыть эмбрионы с водой в 10 раз и высушите сетки покрыта пробирку, содержащую dechorionated эмбрионов на бумажное полотенце. Используйте рассекает иглу передать ~ 50 эмбрионов из нейлона сетка с агаром. Мы добавляем зеленый пищевой краситель в агаром добавить контраста и помощь в выравнивании эмбриона. Под микроскопом рассекает, сделать два параллельных ряда ~ 25 эмбрионов, совместив ЭмбриOS на слайде так, что они будут находиться под прямым углом к ​​пункционной иглы на микроинъекции аппарата. Оставьте немного места (около 1 длина эмбриона) между эмбрионов для газообмена целей. Два параллельных ряда должна быть примерно 5 мм друг от друга. Поместите слайд с двойным скотча на верхней части выровненных эмбрионов и осторожно нажмите слайд для передачи эмбрионов с зеленой пластиной к каретке. Тогда воздух сухой эмбрионов ~ 25 мин для снижения внутреннего давления на эмбрион и предотвратить взрыв, когда ранив. Поместите 2-3 капли галоидоуглеводородов смеси нефти за эмбрионов, чтобы предотвратить дальнейшее обезвоживание. 3. Эмбрион Ранение Поместите эмбриона слайд в стадии впрыска микроскопа. Найти эмбрионов в поле зрения и практики перемещения этап инвертированного микроскопа. Примечания: Перед началом работы с иглой, сосредоточены на средней плоскости зародыша вдоль дорсовентральной оси. Для обеспечения эффективного ранениявыравненные эмбрионы, начинают ранение строку ближе к устройству иглы. Перемещение на сцену, чтобы привести в верхней части строки из выровненных эмбрионов в поле зрения. Аккуратно положите и закрепите тушеной-иглу в иглодержатель. Используйте микроманипулятор для перемещения иглы вниз к слайду. Совместите стрелку с эмбриона, в то же фокальной плоскости. Как только игла находится в фокусе с эмбриона, не переместить иглу с микроманипулятора. Перемещение на сцену, чтобы проколоть эмбрион насквозь, а затем перейти к следующему эмбриона в строке. Если все сделано ранив первую строку, используйте микроманипулятор для перемещения иглы полностью вверх и в сторону от сцены до переезда слайд; вручную повернуть слайд на 180 ° и ранить второго ряда. Храните эмбрионов под галоидоуглеводородов масла при комнатной температуре и заполните эмбриона фиксации, если делать в гибридизация или окрашивания антител (см. процедуру шаг 5). Кроме того, хранить эмбрионы в течение 4-6 ч.под галоидоуглеводородов нефти и приступить к раневой транскрипции люминесцентные репортер визуализации (репрезентативные результаты). Примечания: Для визуализации флуоресцентного репортера, мы обезболить эмбрионов, используя 50% 1-фенокси-2-пропанол 13. Эмбрионы удаляются из фторо-углеродное масло и помещали на новый слайд. Мы размещаем стеклянные бусы вокруг эмбрионов, добавить несколько капель анестетика, и место покровное стекло на эмбрионах. 4. Эмбрион Микроинъекция Примечания: микроинъекции аппарат, который мы используем в протоколе не автоматизирован, чтобы доставить удельный объем во время теста. Мы добавляем краситель к решению визуализировать микроинъекции и попытаться нормализовать объем доставлено. Если слишком много раствор вводят в эмбрионе, желточной оболочки лопнет. Нагрузка игла с тыла с 1 мкл химическим раствором плюс красителя (например, 0,6 М H 2 O 2). Разрешить капиллярДействие обратить химического раствора к наконечнику иглы. Чтобы сломать иглу, место покровное стекло под углом на слайде и пальто края со смесью нефти галоидоуглеводородов. Принесите установленный иглу в фокусе с краю под углом покровным и осторожно двигаться покровным край через кончике иглы, пока не нарушена. Надавите на микроинъекции аппарата и убедитесь, что химический раствор плюс краситель течет иглу. Поместите слайд, содержащий выровненные эмбрионов на столике микроскопа. Продолжать сосредоточиться эмбрион и иглу в одной плоскости. Одновременно проколу и microinject химический раствор плюс красить в каждого эмбриона. Примечания: Засорение иглы происходят часто; сломать новую иглу, чтобы избежать неполного микроинъекции. Чаевые тупой иглой не ранит, как чисто, как под углом кончика иглы. Регулировка покровное к не углом 90 ° в течение поломки является оптимальным для получения углом кончик иглы. 5. Формальдегид Fixation Примечания: Химические вещества, используемые в этой фиксации Drosophila вредны. Используйте средства индивидуальной защиты (например, перчатки, лабораторный халат и защитные очки) при обращении с химическими веществами. Следуйте отдельные институциональные рекомендации по утилизации регулируемых химических веществ. После ранения, подождите 15, 30, 60, или более минут для активации транскрипции раны, вызванной генов произойти. Для удаления эмбрионы из нагнетательных горками, тщательно слейте смесь масла Галокарбоновое из слайдов, опереться слайд против стойку и промокните конец с Kimwipe. Используйте стеклянную пипетку, чтобы ополоснуть гептан над горкой и мыть полоскания жидкость в стеклянную чашку Петри. Гептан растворится ленту и отпустите эмбрионов. Продолжайте промывать, пока все эмбрионы не будут удалены из слайда. Перейдите к следующему слайду, пока все эмбрионы не будут удалены из слайдов. Перенести гептан плюс решение эмбриона от стеклянную посуду в 20 мл научноntillation флакон. Встряхните флакон в течение 2-3 мин, снять гептан и добавить 5 мл свежей гептана. Добавьте 5 мл свежей, фиксирующем растворе (см. список реагентов для рецепта). Закройте флакон крышкой и прикрепить к орбитальной платформы шейкере. Встряхните флакон, содержащий зародыши для 25 мин при 220-230 оборотов в минуту. После встряхивания, пускать пузыри на границе поп-музыки. Полностью удалить нижнюю водную фазу, с помощью пипетки, избегая подтягивания эмбрионов. Нижний слой состоит из фиксирующего раствора и должны быть утилизированы должным образом. Добавьте 5 мл метанола, колпачок флакона и энергично встряхивают вручную в течение 20-30 сек, водоворот и поместить его на скамейке запасных. Раненые эмбрионы останется в интерфазе и не будет опускаться на дно. Примечание: После фиксации желточной оболочки из эмбриона без ран, как правило, взрыв во время стадии дегидратации с метанолом. Тем не менее, желточной оболочки в раненой эмбриона уже сломан, и шаг обезвоживание не будет удалять желточной коррране. Рука-devitellinzation для ее завершения требуется протокол фиксации. Осторожно снимите верхний слой гептан, а затем добавить 5 мл свежим метанолом. Встряхните флакон и эмбрионы должны тонуть. Удалите метанол плюс решение эмбриона с стекло пипетки и собрать в нейлоновой сеткой пробирку в стеклянную посуду. Удалите метанол и промойте эмбрионов с раствором 1x PBS. Перенесите эмбрионы из нейлоновой сетки с соком пластины яблоко. Распространение эмбрионов вдоль поверхности пластины. Перенесите эмбрионы в двойной скотч стекло. Покройте эмбрионов с 1x PBS. Примечания: Эмбрионы, как правило, комок из-за желточной оболочки. Использование место сок яблочный позволяет быстро разделения слипаются эмбрионов. Эмбрионы должны быть удалены с пластинки и переносили в двойной скотч стекло, потому что эмбрионы погружаются в чашки с агаром при приложении силы, чтобы удалить из эмбрионажелточной оболочки. Осторожно вставьте эмбрионов с препаровальной иглы "поп" желточной оболочки. Эмбрион должен тонуть в PBS. С помощью стеклянной пипетки для передачи 1X PBS плюс эмбрионов в 1,5 мл трубки. Промыть эмбрионы с 1x PBS и хранить при температуре 4 ° С. Перейдите к обезвоживанию эмбрионов, используя этанол: Series PBS и продолжить в гибридизация или Иммунолокализация протокола 14.