Assay וMicroinjection פצע<em> בvivo</em> לוקליזציה של עוריות פצע הכתבים תגובה ב<em> דרוזופילה</em> עוברים.
Summary
האפידרמיס העוברי של עוברי דרוזופילה שלב מאוחר מאוד מספק מערכת vivo בתגובה לניתוח פצע מהיר ויכול להיות משולב עם מניפולציות גנטיות או טיפולי microinjection כימיים לקידום מחקרים בריפוי פצעים לתרגום למודלים של יונקים.
Abstract
עובר דרוזופילה מפתחת שכבת האפידרמיס חזק המשמשת גם להגנה על התאים הפנימיים מסביבה חיצונית קשה, כמו גם לשמור על הומאוסטזיס הסלולר. פציעה לנקב עם מחטי זכוכית מספקת שיטה ישירה כדי לעורר תגובת אפידרמיס פצע מהירה שמפעילה כתבי תעתיק פצע, אשר ניתן דמיינו ידי אות כתב מקומית בעוברים או זחלי חיים. פציעה לנקב או לייזר מספקת גם אותות המקדמים הגיוס של hemocytes לאתר הפצע. באופן מפתיע, פציעה לנקב חמור (ולפנים) בעוברים בשלב מאוחר רק לעתים רחוקות משבשת התפתחות עוברית נורמלית, כמו יותר מ 90% מעוברים נפצעו כזה לשרוד לבגרות, כאשר עוברים מוזרקים במדיום שמן שממזער זליגה מיידית של hemolymph מאתרים לנקב . הליך הפצע דורש המיקרומניפולציה של עוברי דרוזופילה, כוללים יישור ידני של העוברים על AGצלחות ar והעברת העוברים המיושרים לשקופיות מיקרוסקופ. Assay תגובת פצע אפידרמיס דרוזופילה מספק מערכת מהירה כדי לבדוק את הדרישות הגנטיות של מגוון רחב של תפקודים ביולוגיים המקדמים ריפוי פצע, כמו גם דרך מסך עבור תרכובות כימיות פוטנציאליות המקדמות ריפוי פצע. מחזור החיים הקצר והשגרתי culturing קל לעשות דרוזופילה אורגניזם מודל רב עוצמה. ריפוי פצע נקי דרוזופילה מופיע לתאם את תגובת משובי אפידרמיס, עם התגובה החיסונית המולדת, בדרכים שנמצאות עדיין בחקירה, המספקת מערכת מצוינת למצוא שימור רגולציה מנגנונים נפוצים לדרוזופילה ופציעת אפידרמיס יונקים.
Introduction
מניפולציה של עוברי דרוזופילה בטכניקת microinjection היא assay מבוסס היטב 1. המשמעות של שיטת כתב תגובת פצע אפידרמיס היא לשלב את הפרוטוקול ללנקב / microinjection עם כתבי ניאון ולדמיין תגובת in vivo לפגיעה באפידרמיס בעוברי דרוזופילה. מטרתה של שיטה זו היא לאפשר למגוון רחב יותר של מדענים להשתמש דרוזופילה ככלי לחקור את התהליכים המווסתים את תגובת תעתיק לפציעה לנקב באפידרמיס. האפידרמיס חד שכבתי בדרוזופילה מספק מערכת פשוטה ללמוד תגובת פצע אפידרמיס לאחר פציעה לנקב 2. עובר דרוזופילה הוא מערכת מודל חזקה גנטי לנתח את השלבים של תיקון פצע, לרבות תגובת פצע, דלקת, וreepithelialization 3. מדובר בין שאר משום שרבים או zygotic רוב מוטציות לשרוד עד סוף embryogenesהוא ולפתח מחסומי אפידרמיס גם כאשר דפוסים התפתחותיים הולך עמוק השתבש. אפיון קודם של ראש נשמרים היטב גורם שעתוק מגורען (Grh), זיהה כי גנים Grh יעד decarboxylase דופא (DDC) וhydroxylase טירוזין (ple) מופעלים תעתיק מסביב לאתרים של פגיעה 4. דרוזופילה כאורגניזם מודל לתגובת פצע מספק קו משלים של חקירה כדי לקדם מחקרים בריפוי פצע יונקים 5. מחקרים מאוחרים יותר זיהו גנים הנגרמים פצע דרוזופילה נוספים ופיתחו "ארגז כלים" של רבים כתבי פצע ניאון כדי לפקח על in vivo תגובת פצע אפידרמיס לנקות פצע 6. דיווחים אחרונים על הרגולציה של ריפוי פצע דרוזופילה התמקדו בפנוטיפ סגירת פצע, ומאפשרים גילוי של מסלולים רבים המסדירים תא הגירה 7,8. עם הניתוח שלכתבי פצע ניאון, המחקרים שלנו זיהו סט רומן של גנים הנדרשים לביטוי המקומיים של גנים פצע מושרה אפידרמיס 9. אחד היתרונות של שיטת כתב תגובת הפצע הוא שהתוצאות מספקות תובנה רבה יותר על מנגנון של כמה אותות transduced מהאתר של פגיעה בתאים השכנים. עם זאת, אחד החסרונות של שיטת כתב תגובת הפצע הוא שהתוצאות לא לקשר ישירות לפנוטיפים בריפוי או תיקון פצע. שימוש רחב יותר של הפרוטוקול לנקב פצע הנקי במסכים גנטיים וכימיים יאפשר רגולטורים חדשים של תגובת תעתיק לאפידרמיס ופצעו להיות מזוהים ולקדם את התרגום של תגליות ריפוי פצע לתוך מודלים של יונקים של טיפולי פציעה.
Protocol
Representative Results
Discussion
תגובת רגולציה תעתיק מיידית לרמזים חיצוניים מאפשרת לתאים כדי לתאם את תגובה מקומית לגירויים תאיים, אשר יכול לכלול מתח, נזק, או זיהום. השליטה לא נכונה של תגובה מקומית יכולה להיות השפעה מזיקה על תאי שכנים, כמו גם בזבוז של משאבים כדי לתקן את הפציעה. עובר דרוזופילה מספק מערכת מצוינת לבצע ניסויי ריפוי פצע בסיסיים באורגניזם מודל-to-לשמור קל זול ו. הפוטנציאל לשיתופי פעולה בין המחקר באורגניזמים מודל אחרים ודרוזופילה מספק הזדמנות ייחודית לחקור שאלות רבות ביולוגיות.
טכניקה נוספת של כתבי הפצע היא שילוב הגנטי של רקע מוטציה, המספקת שיטה יעילה לבדיקת תרומתם של גנים חדשים להפעלה של מסלול תגובת הפצע באפידרמיס. יש לנו כתבי תעתיק מושרה פצע אפידרמיס אבailable בשני nd 2 ו 3 rd כרומוזומים 5. במחקר זה אנו משתמשים בכלי טייס ומערכות GAL4 של ביטוי יתר 16. ללימודים עם אללים מוטציה קטלניים אנו קובעים רקע הגנטי באמצעות כרומוזום איזון ניאון, למשל Kruppel-GFP 17. יש לנו ניתחנו את לוקליזציה כתב פצע בכמה רקע גנטי (טבלה 1).
שינוי אפשרי של הטכניקה הוא לשלב microinjection ופציעתם. Microinjection ניתן להשתמש כדי להציג את הפתרון כימי לעובר. כמה תרכובות כימיות נבדקו ונמצאו להסדיר את פעילותם של כתבי פצע אפידרמיס 9. שיטה זו של פציעה וmicroinjection בו זמנית יכולה להיות שימושית כדי להגדיל את מספר התאים בעובר דרוזופילה שיגיב אות פצע וניתן להשתמש בם ישירות כדי לעקוב אחר שינויי ביטוי גנים לאחר פצע 18. יישום עתידי של טכניקת microinjection יהיה לבחון כימיקלים חדשניים לויסות תגובת הפצע באפידרמיס.
דרוזופילה כמערכת מודל למחקרים גנטיים מציעה מגוון רחב של פרוטוקולים פשוטים כדי לטפל ביעילות בשאלות מורכבות. הדיווחים אחרונים על ההיתכנות של טכניקות דרוזופילה מדגיש את השימוש של הגירת hemocyte 19 וזיהום הצרעה טפילית 20 כאמצעי להרחבת השפעתה של קהילת מחקר דרוזופילה נוספת. בנוסף ללימודי תיקון פצע, דרוזופילה מספקת מודל קלאסי להתחדשות עם מערכת הדיסק דמותי 21,22. ההתקדמות בשילוב במחקרי התחדשות דיסק דמותי ופציעה לנקב / microinjection מספקת מערכת מצוינת לגלות רכיבים נשמרים היטב של תיקון רקמות.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
פרוטוקול זה פותח בשיתוף פעולה עם חברים קודמים של המעבדה מקגיניס, קים א מייס ויוסף ג פירסון. אנו מודים להמשך מאמצים על ידי מרכז מניות דרוזופילה Bloomington עבור עבודתם לארגן ולהפיץ מניות ערך. עבודה זו נתמכה על ידי מימון מהמכונים הלאומיים לבריאות (R01 GM077197 וK12 GM68524) ומשפחתו של הרברט שטרן. MTJ נתמכת כיום על ידי גרנט מספר 5G12RR003060-26 מהמרכז הלאומי למשאבי מחקר וגרנט מספר 8G12MD7603-27 מהמכון הלאומי לבריאות מיעוט ופערים בבריאות. התוכן הוא באחריות בלעדית של הכותבים ולא בהכרח מייצג את הדעות הרשמיות של המכון הלאומי על פערים בבריאות ובריאות מיעוט או המכון הלאומי לבריאות.
Materials
| yeast | Sigma Aldrich | 51475 | |
| apple juice | Generic | ||
| agar | Fisher Scientific | 50-824-297 | |
| bleach | Generic | ||
| halocarbon oil, 700 W | Sigma Aldrich | H8898 | |
| halocarbon oil, 27 W | Sigma Aldrich | H8773 | |
| 1-phenoxy-2-propanol | Sigma Aldrich | 484423 | |
| hydrogen peroxide | Fisher Scientific | H324 | |
| methyl-β-cyclodextrin | Sigma Aldrich | C4555 | |
| toluidine blue | Sigma Aldrich | 89640 | |
| formaldehyde, 16% | Polysciences, Inc | 18814-20 | toxic chemical |
| heptane | Fisher Scientific | H360-1 | toxic chemical |
| methanol | Fisher Scientific | A412-1 | toxic chemical |
| 10x PBS | Fisher Scientific | 50-899-90013 | |
| 0.5 M EGTA | Fisher Scientific | 50-255-956 | |
| RNase free H2O | Fisher Scientific | BP2819-100 | |
| Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila incubator | Genessee Scientific | 59-197 | |
| fly cage | Genessee Scientific | 59-100 | |
| embryo collection tube | Genessee Scientific | 46-101 | |
| plastic Petri dish | Fisher Scientific | 50-202-037 | |
| double-stick tape | Generic | ||
| paintbrush | Generic | ||
| dissection needle | Fisher Scientific | 08-965A | sharp object |
| glass cover slip | Thermo Scientific | 3306 | sharp object |
| microscope slide | Thermo Scientific | 4445 | sharp object |
| dissecting microscope | Carl Zeiss | Stemi-2000 | |
| capillary needle | FHC | 30-30-1 | sharp object |
| needle puller | Narishige | PC10 | |
| microinjection needle holder | Narishige | MINJ4 | |
| micromanipulator | Narishige | MN151 | |
| inverted microscope | Carl Zeiss | Primo-Vert | |
| glass Petri dish | Fisher Scientific | 08-747A | sharp object |
| glass Pasteur pipette | Fisher Scientific | 22-063-172 | sharp object |
| transfer bulb | Fisher Scientific | 03-448-25 | |
| Kimwipe | Fisher Scientific | 06-666A | |
| scintillation vial | Fisher Scientific | 03-337-7 | sharp object |
| orbital shaker | Fisher Scientific | 14-259-260 | |
| 1.5 ml tube | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| laser scanning confocal | Leica | SP2 | |
| fixation solution | (5 ml) | ||
| 16% formaldehyde | 2.5 ml | toxic chemical | |
| 10x PBS | 0.5 ml | ||
| 0.5 M EGTA | 0.5 ml | ||
| RNase free H2O | 1.5 ml | ||
| Halocarbon oil mix | (10 ml) | ||
| halocarbon oil, 700 W | 5 ml | ||
| halocarbon oil, 27 W | 5 ml |
References
- Germeraad, S. Genetic transformation in Drosophila by microinjection of DNA. Nature. 262 (5565), 229-231 (1976).
- Payre, F. Genetic control of epidermis differentiation in Drosophila. Int. J. Dev. Biol. 48 (2-3), 207-215 (2004).
- Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. Wound repair and regeneration. Nature. 453 (7193), 314-321 (2008).
- Mace, K. A., Pearson, J. C., McGinnis, W. An epidermal barrier wound repair pathway in Drosophila is mediated by grainy head. Science. 308 (5720), 381-385 (2005).
- Ting, S. B., Caddy, J., et al. A homolog of Drosophila grainy head is essential for epidermal integrity in mice. Science. 308 (5720), 411-413 (2005).
- Pearson, J. C., Juarez, M. T., Kim, M., Drivenes, &. #. 2. 1. 6. ;., McGinnis, W. Multiple transcription factor codes activate epidermal wound-response genes in Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (7), 2224-2229 (2009).
- Campos, I., Geiger, J. A., Santos, A. C., Carlos, V., Jacinto, A. Genetic screen in Drosophila melanogaster uncovers a novel set of genes required for embryonic epithelial repair. Genetics. 184 (1), 129-140 (2010).
- Lesch, C., Jo, J., Wu, Y., Fish, G. S., Galko, M. J. A targeted UAS-RNAi screen in Drosophila larvae identifies wound closure genes regulating distinct cellular processes. Genetics. 186 (3), 943-957 (2010).
- Juarez, M. T., Patterson, R. A., Sandoval-Guillen, E., McGinnis, W. Duox, Flotillin-2, and Src42A are required to activate or delimit the spread of the transcriptional response to epidermal wounds in Drosophila. PLoS Genet. 7 (12), e1002424 (2011).
- Allemand, R. Influence of light condition modification on the circadian rhythm of vitellogenesis and ovulation in Drosophila melanogaster. J. Insect Physiol. 22 (8), 1075-1080 (1976).
- Allemand, R. Rhythm of vitellogenesis and ovulation in photoperiod ld 12:12 of Drosophila melanogaster. Insect Physiol. 22 (7), 1031-1035 (1976).
- Pierre, S. E., Thurmond, J. FlyBase 101 – the basics of navigating FlyBase. Nucleic Acids Res. 40 (D1), D706-D714 (2012).
- Wyeth, R. C., Croll, R. P., Willows, A. O. D., Spencer, A. N. 1-Phenoxy-2-propanol is a useful anaesthetic for gastropods used in neurophysiology. J. Neurosci. Methods. 176 (2), 121-128 (2009).
- Kosman, D., Mizutani, C. M., Lemons, D., Cox, W. G., McGinnis, W., Bier, E. Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos. Science. 305 (5685), 846 (2004).
- Barolo, S., Castro, B., Posakony, J. W. New Drosophila transgenic reporters: insulated P-element vectors expressing fast-maturing RFP. BioTechniques. 36 (3), 436-440 (2004).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Casso, D., Ramírez-Weber, F., Kornberg, T. B. GFP-tagged balancer chromosomes for Drosophila melanogaster. Mech. Dev. 91 (1-2), 451-454 (2000).
- Patterson, R. A., Juarez, M. T., Hermann, A., Sasik, R., Hardiman, G., McGinnis, W. Serine proteolytic pathway activation reveals an expanded ensemble of wound response genes in Drosophila. PloS one. 8 (4), e61773 (2013).
- Evans, I. R., Zanet, J., Wood, W., Stramer, B. M. Live imaging of Drosophila melanogaster embryonic hemocyte migrations. J. Vis. Exp. (36), e1696 (2010).
- Small, C., Paddibhatla, I., Rajwani, R., Govind, S. An introduction to parasitic wasps of Drosophila and the antiparasite immune response. J. Vis. Exp. (63), e3347 (2012).
- Repiso, A., Bergantiños, C., Corominas, M., Serras, F. Tissue repair and regeneration in Drosophila imaginal discs. Dev. Growth Differ. 53 (2), 177-185 (2011).
- Worley, M. I., Setiawan, L., Hariharan, I. K. Regeneration and transdetermination in Drosophila imaginal discs. Annu. Rev. Genet. 46, 289-310 (2012).
