Microiniezione Wound Assay e<em> In vivo</em> Localizzazione di Epidermal Wound risposta Giornalisti a<em> Drosophila</em> Embrioni.
Summary
L'epidermide embrionali di fase molto avanzata di Drosophila embrioni fornisce un sistema in vivo per l'analisi rapida risposta puntura ferita e possono essere combinati con manipolazioni genetiche o trattamenti chimici microiniezione per avanzare gli studi nella guarigione delle ferite per la traduzione in modelli di mammiferi.
Abstract
Drosophila sviluppa uno strato epidermico robusto che serve sia per proteggere le cellule interne da un ambiente esterno duro e per mantenere l'omeostasi cellulare. Lesioni puntura con aghi di vetro fornisce un metodo diretto per innescare una rapida risposta epidermica ferita che attiva ferita reporter trascrizionali, che possono essere visualizzati da un segnale giornalista localizzata in embrioni vivi o larve. Lesione di puntura o laser fornisce anche i segnali che promuovono l'assunzione di emociti al sito della ferita. Sorprendentemente, grave (fino in fondo) lesioni puntura in embrioni fase avanzata interrompe solo raramente normale sviluppo embrionale, come maggiore del 90% di tali embrioni feriti sopravvivere adulta quando embrioni vengono iniettati in un mezzo di olio che minimizza la perdita immediata di emolinfa da siti di puntura . La procedura ferita richiede micromanipolazione degli embrioni di Drosophila, include l'allineamento manuale degli embrioni in agPiastre Ar e trasferimento degli embrioni allineati vetrini da microscopio. Il test di risposta epidermica ferita Drosophila fornisce un sistema rapido per testare i requisiti genetici di una varietà di funzioni biologiche che promuovono la guarigione delle ferite, così come un modo per schermare per potenziali composti chimici che promuovono la guarigione delle ferite. Il ciclo di vita breve e semplice routine di coltura fanno Drosophila un potente organismo modello. Drosophila pulita la guarigione delle ferite appare per coordinare la risposta rigenerativa epidermica, con la risposta immunitaria innata, in modi che sono ancora oggetto di indagine, che fornisce un ottimo sistema per trovare conservato normativo meccanismi comuni di Drosophila e mammiferi epidermica ferimento.
Introduction
Manipolazione di embrioni di Drosophila utilizzando una tecnica di microiniezione è un'analisi consolidata 1. Il significato del metodo epidermica ferita risposta giornalista è di combinare il protocollo per puntura / microiniezione con reporter fluorescenti e visualizzare una risposta in vivo di danno epidermico in embrioni di Drosophila. L'obiettivo di questo metodo è quello di consentire una più ampia gamma di scienziati di utilizzare Drosophila come strumento per studiare i processi che regolano la risposta trascrizionale di danno epidermico puntura. L'epidermide singoli strati in Drosophila offre un sistema semplice per studiare una risposta epidermica ferita dopo un infortunio puntura 2. L'embrione Drosophila è un sistema modello robusto per geneticamente sezionare le fasi di riparazione delle ferite, compresa la risposta ferita, infiammazione e riepitelizzazione 3. Questo è in parte perché molti o più zigotiche mutanti sopravvivono alla fine del embryogenesè e sviluppare le barriere epidermiche anche quando patterning di sviluppo va profondamente storto. Caratterizzazione precedente di un fattore di trascrizione testa granulare ben conservato (Grh), hanno identificato che i geni Grh bersaglio Dopa decarbossilasi (DDC) e tirosina idrossilasi (PLE) sono trascrizionale attivati intorno ai siti di lesione 4. Drosophila come organismo modello per la risposta della ferita fornisce una linea complementare di indagine per avanzare gli studi in mammiferi guarigione delle ferite 5. Studi successivi hanno identificato i geni aggiuntivi ferita indotta Drosophila e sviluppato un "toolkit" di molti giornalisti ferita fluorescenti per monitorare la vivo epidermica risposta ferita a pulire ferendone 6. Recenti rapporti sulla regolazione della guarigione della ferita Drosophila sono concentrati sul fenotipo chiusura della ferita, permettendo la scoperta di molte vie che regolano la migrazione delle cellule 7,8. Con l'analisi dellareporter ferita fluorescenti, i nostri studi hanno identificato una nuova serie di geni necessari per l'espressione localizzata di epidermiche geni ferita inducibile 9. Uno dei meriti del metodo di risposta ferita giornalista è che i risultati forniscono un quadro più chiaro in un meccanismo di come i segnali vengono trasdotte dal sito di lesione alle cellule vicine. Tuttavia, uno dei demeriti del metodo di risposta ferita giornalista è che i risultati non collegano direttamente fenotipi nella guarigione o riparazione della ferita. Uso più ampio del protocollo ferita puntura pulito nelle schermate genetici e chimici consentirà nuovi regolatori della risposta trascrizionale di epidermiche ferendo essere identificati e altre eventuali la traduzione di guarigione delle ferite scoperte in modelli di mammiferi di trattamenti di pregiudizio.
Protocol
Representative Results
Discussion
Una risposta trascrizionale di regolamentazione immediata a stimoli esterni permette alle cellule di coordinare una risposta localizzata a stimoli extracellulari, che possono includere lo stress, danni o infezioni. Il controllo improprio di una risposta localizzata può avere effetti dannosi sulle cellule vicine, nonché uno spreco di risorse per riparare il danno. L'embrione di Drosophila offre un ottimo sistema per condurre esperimenti di base guarigione della ferita in un poco costoso e facile da mantenere organismo modello. Il potenziale di collaborazioni tra ricerca in altri organismi modello e Drosophila offre un'opportunità unica di esplorare molte questioni biologiche.
Una tecnica aggiuntiva dei reporter ferita è la combinazione genetica di sfondi mutanti, prevedere un metodo efficace per testare il contributo dei nuovi geni per l'attivazione della via di risposta epidermica ferita. Abbiamo giornalisti epidermiche ferita indotta trascrizionali available sia il 2 e 3 cromosomi rd 5. In questo studio utilizziamo UAS e sistemi GAL4 di sovraespressione 16. Per gli studi con letali alleli mutanti determiniamo il background genetico utilizzando un cromosoma bilanciatore fluorescente, ad esempio Kruppel-GFP 17. Abbiamo analizzato la localizzazione ferita giornalista in diversi background genetici (Tabella 1).
Una eventuale modifica della tecnica è quella di combinare microiniezione e ferimento. Microiniezione può essere utilizzato per introdurre una soluzione chimica nell'embrione. Diversi composti chimici sono stati testati e sono stati trovati a disciplinare l'attività dei giornalisti epidermica ferita 9. Questo metodo di ferimento simultanea e microiniezione può essere utile per aumentare il numero di cellule in Drosophila che risponde un segnale ferita e può essere utilizzato direttamente per monitorare cambiamenti di espressione genica dopo ferendo 18. Una futura applicazione della tecnica microiniezione sarà quello di testare nuove sostanze chimiche per la regolazione della risposta epidermica ferita.
Drosophila come sistema modello per studi genetici offre una vasta gamma di protocolli semplici per affrontare efficacemente questioni complesse. Recenti rapporti sulla fattibilità di tecniche di Drosophila mette in evidenza l'uso di hemocyte migrazione 19 e parassitarie vespa infezione 20 come un mezzo per ampliare ulteriormente l'impatto della comunità di ricerca Drosophila. Oltre agli studi di riparazione della ferita, Drosophila fornisce un modello classico per la rigenerazione del sistema disco immaginale 21,22. I progressi combinati negli studi di rigenerazione del disco immaginali e puntura / microiniezione ferimento offre un ottimo sistema per scoprire i componenti ben conservati di riparazione dei tessuti.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo protocollo è stato sviluppato in collaborazione con i precedenti membri del McGinnis Lab, Kim A. Mace e Joseph C. Pearson. Ringraziamo i continui sforzi da parte Bloomington Drosophila Stock Center per il loro lavoro per organizzare e distribuire le scorte di valore. Questo lavoro è stato sostenuto da un finanziamento dal National Institutes of Health (R01 GM077197 e K12 GM68524) e la famiglia di Herbert Stern. MTJ è attualmente supportato da Grant Numero 5G12RR003060-26 dal Centro Nazionale per le Risorse della Ricerca e Grant Numero 8G12MD7603-27 dal National Institute on Minoranza Salute e disparità di salute. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiali dell'Istituto Nazionale su Salubrità di Minoranza e disparità di salute o il National Institutes of Health.
Materials
| yeast | Sigma Aldrich | 51475 | |
| apple juice | Generic | ||
| agar | Fisher Scientific | 50-824-297 | |
| bleach | Generic | ||
| halocarbon oil, 700 W | Sigma Aldrich | H8898 | |
| halocarbon oil, 27 W | Sigma Aldrich | H8773 | |
| 1-phenoxy-2-propanol | Sigma Aldrich | 484423 | |
| hydrogen peroxide | Fisher Scientific | H324 | |
| methyl-β-cyclodextrin | Sigma Aldrich | C4555 | |
| toluidine blue | Sigma Aldrich | 89640 | |
| formaldehyde, 16% | Polysciences, Inc | 18814-20 | toxic chemical |
| heptane | Fisher Scientific | H360-1 | toxic chemical |
| methanol | Fisher Scientific | A412-1 | toxic chemical |
| 10x PBS | Fisher Scientific | 50-899-90013 | |
| 0.5 M EGTA | Fisher Scientific | 50-255-956 | |
| RNase free H2O | Fisher Scientific | BP2819-100 | |
| Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila incubator | Genessee Scientific | 59-197 | |
| fly cage | Genessee Scientific | 59-100 | |
| embryo collection tube | Genessee Scientific | 46-101 | |
| plastic Petri dish | Fisher Scientific | 50-202-037 | |
| double-stick tape | Generic | ||
| paintbrush | Generic | ||
| dissection needle | Fisher Scientific | 08-965A | sharp object |
| glass cover slip | Thermo Scientific | 3306 | sharp object |
| microscope slide | Thermo Scientific | 4445 | sharp object |
| dissecting microscope | Carl Zeiss | Stemi-2000 | |
| capillary needle | FHC | 30-30-1 | sharp object |
| needle puller | Narishige | PC10 | |
| microinjection needle holder | Narishige | MINJ4 | |
| micromanipulator | Narishige | MN151 | |
| inverted microscope | Carl Zeiss | Primo-Vert | |
| glass Petri dish | Fisher Scientific | 08-747A | sharp object |
| glass Pasteur pipette | Fisher Scientific | 22-063-172 | sharp object |
| transfer bulb | Fisher Scientific | 03-448-25 | |
| Kimwipe | Fisher Scientific | 06-666A | |
| scintillation vial | Fisher Scientific | 03-337-7 | sharp object |
| orbital shaker | Fisher Scientific | 14-259-260 | |
| 1.5 ml tube | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| laser scanning confocal | Leica | SP2 | |
| fixation solution | (5 ml) | ||
| 16% formaldehyde | 2.5 ml | toxic chemical | |
| 10x PBS | 0.5 ml | ||
| 0.5 M EGTA | 0.5 ml | ||
| RNase free H2O | 1.5 ml | ||
| Halocarbon oil mix | (10 ml) | ||
| halocarbon oil, 700 W | 5 ml | ||
| halocarbon oil, 27 W | 5 ml |
References
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