マイクロインジェクションアッセイをキズや<em>インビボ</em>表皮の局在は、応答記者傷<em>ショウジョウバエ</em>胚。

ショウジョウバエ胚性創傷プロトコルは、5つのステップに要約することができる：（1）胚収集、（2）胚の調製（3）胚負傷（4）胚のマイクロインジェクション、および（5）胚固定。 1。胚コレクション 2〜3日後にeclosing、大人のハエを集め、胚収集ケージに50人の女性と25人の男性を追加します。 3日間、毎朝、新鮮なリンゴジュース寒天プラス酵母プレートを置きます。 （注）25℃のインキュベーターで12時間昼間のスケジュールで最適な胚収集、サイクルのためのハエ（17:00ライト「OFF」「ON」5時点灯）、女性のハエは、明サイクルの変化に対応し、光を"OFF" 10,11 "ON"ラ ​​イトから切り替え中の卵の大きな数量を堆積する。 デイ3の午後には、ケージの新鮮なリンゴジュースを加えた酵母寒天プレートを配置し、2時間の胚を収集します。ケージに新しい酵母プレートを配置し、保存2時間の回収プレート。 胚を熟成25℃でさらに14時間回収プレートを保管してください。 注：創傷治癒はショウジョウバエの開発中にどの段階でアッセイすることができるが、このホワイトペーパーで説明した損傷誘発性の転写レポーターは、ステージ15〜16 12の間で最適な活性を有する。後期17で、胚は簡単に成熟キューティクルを貫通し、効率的に創傷の記者をアクティブまたは創傷誘導性転写を検出するにはあまりにも古いです。収集時間とピークラボ時間中に発生する創傷時間を確保するために、我々は2時間（16:00〜18:00）のための胚のコレクションのスケジュールに従う、18:00に新しいプレートとコレクションプレートを交換し、年齢コレクション·14時間（一晩）25℃でプレート、08:00（翌日）の胚を取った。 2。胚の準備注意事項：このプロトコルは、シャープで多くのツールと​​オブジェクトの使用を含むまたはGで作られた小娘。けがをしないように注意して、すべての鋭利とガラスのオブジェクトを処理します。 優しくプレートおよび旋回2-3 mLの水を添加することにより、絵筆を持つコレクションプレートから胚を取り出します。ナイロンメッシュとコレクションチューブにプレートから水や胚を移す。 プラスチックシャーレプレートのキャップに漂白剤4〜5 mlを添加し、2分間の漂白剤で胚を含むコレクションチューブのメッシュカバーの端を浸し、胚の外側の卵殻を除去する。手動でコレクションチューブを漂白剤にに凝集から胚を防ぐために、数回回転させます。水10倍で胚を洗浄し、ペーパータオルの上絨毛膜を除去した胚を含むメッシュカバーコレクションチューブを乾燥させます。 寒天プレートにナイロンメッシュから〜50胚を転送するために解剖針を使用してください。私たちは、胚の位置合わせのコントラストや助剤を添加する寒天プレートに緑色の食品着色料を追加します。解剖顕微鏡下で、エンブリーを揃える、〜25胚の2列を作るスライド上のOSそれらはマイクロインジェクション装​​置上の穿刺針に対して直角になるように。ガス交換の目的での胚の間に小さなスペース（約1胚の長さ）のまま。 2列は離れて約5ミリメートルである必要があります。 整列胚の上に両面接着テープでスライドを置き、慎重にスライドに緑のプレートから胚を転送するスライドを押してください。次いで、空気胚を乾燥〜25分間胚の内部の圧力を低下させ、創傷時バーストを防止する。 さらに脱水を防ぐために、胚の上にハロカーボンオイルミックスの2〜3滴を配置します。 3。胚創傷は注射顕微鏡ステージにおける胚のスライドを配置します。視野内の胚を見つけ、倒立顕微鏡のステージを移動練習。 注針で作業を始める前に、背腹軸に沿った胚の中央面に焦点を当てています。の効率的な創傷を可能にするために整列胚は、針装置に近い行を負傷させ始める。視野内に整列された胚の行の上端を持って、ステージを移動します。 慎重に配置して、針ホルダ引き込ま針を固定します。スライドに向かって針を移動するためにマイクロマニピュレーターを使用してください。同じ焦点面に、胚と針の位置を合わせます。針は胚に焦点が合っていると、マイクロマニピュレータで針を移動しないでください。 行の次の胚に移動して、根っから胚を穿刺する段階を移動します。最初の行が負傷し終わったら、スライドを移動する前の段階から持ち上げて完全に針を移動するためにマイクロマニピュレーターを使用して、手動でスライド180°回転し、二行目を取った。 （プロシージャのステップ5を参照）を室温でハロカーボンオイルの下で胚を保存し、in situハイブリダイゼーションまたは抗体染色でやっている場合、胚の固定を進める。代わりに、4〜6時間の胚を保存するハロカーボン油の下および創傷転写蛍光レポーターの可視化（代表的な結果）に進む。 注：蛍光レポーターの可視化のために、我々は50％の1 -フェノキシ-2 -プロパノール13を用いて胚を麻酔する。胚はハロカーボン油から除去し、新しいスライド上に配置されている。我々は、胚の周りにガラスビーズを置き、麻酔を数滴を追加し、胚にカバースリップを配置。 4。胚のマイクロインジェクション注：我々は、プロトコルで使用するマイクロインジェクション装​​置は、アッセイ中に特定のボリュームを提供するために自動化されていない。我々はマイクロインジェクションを視覚化し、配信ボリュームを正常化しようとするソリューションに染料を追加します。あまりにも多くの溶液を胚に注入されている場合は、卵黄膜が破裂します。 化学溶液を加えた色素の1μlのリアからのロード針（ 例えば 0.6 H 2 O 2）。毛細血管を許可する針の先端に薬液を描画する行動。 針を破るために、スライドとコートハロカーボンオイルミックスとエッジの角度でカバースリップを配置。角度のついたカバーガラスのエッジに焦点に取り付けられた針を持って、ゆっくりと壊れたまで針の先端間でカバースリップの端を移動します。マイクロインジェクション装​​置に圧力を適用し、化学溶液を加えた染料は、針を流出していることを確認してください。 顕微鏡ステージ上に整列した胚を含むスライドを置きます。胚と同じ平面内針を焦点に進みます。同時に穿刺し顕微注入する薬液を加えた各胚に染める。 注：詰まっ針が頻繁に発生し、不完全なマイクロインジェクションを回避するために、新しい針を破る。鈍針の先端のようにきれいに角度のついた針の先端のように巻かれていません。破損の際に非90°の角度にカバースリップを調整すると、角度のついた針の先端を製造することが最適である。 5。ホルムアルデヒドFiのxation 注意事項：このショウジョウバエの固定に使用される化学物質は有害である。化学薬品を取り扱う際の個人用保護具（ 例えば 、手袋、白衣、および安全ゴーグル）を使用します。規制化学物質の廃棄のための個々の施設のガイドラインに従ってください。 傷に誘導される遺伝子の転写活性化が起こるために負傷した後、15、30、60、またはそれ以上の分を待ちます。注入スライドから胚を削除するには、慎重に、スライドからハロカーボンオイルミックスを排出ラックに対してスライドリーンとキムワイプで終わりをブロット。 スライド上でヘプタンをすすぎ、ガラスペトリ皿にリンス液を洗浄するためにガラスピペットを使用してください。ヘプタンは、テープを溶解し、胚をリリースする予定。すべての胚をスライドから除去されるまで洗い流し続ける。すべての胚をスライドから除去されるまで、次のスライドに進みます。 20ミリリットルSCIにガラス皿からヘプタンを加えた胚ソリューションを転送ntillationバイアル。 2〜3分間バイアルを振る、ヘプタンを除去し、新鮮なヘプタン5ミリリットルを追加。 新鮮な固定液を5ミリリットルを追加します（レシピのための試薬のリストを参照）。バイアルに蓋をし、軌道プラットフォームシェーカーに接続します。 220〜230 rpmで25分間胚を含むバイアルを横に振る。 振盪後、インタフェースのポップで泡をしてみましょう。完全に胚を引き上げ避け、下、ピペットを用いて水相を除去します。底部層は、固定液で構成され、適切に配置されるべきである。 メタノール5ミリリットルを追加するバイアルにキャップをして、20〜30秒間、手でよく振る、スワールやベンチの上に置きます。負傷した胚は、間に滞在し、底に沈むことはありません。 注：固定後無傷の胚の卵黄膜は、通常、メタノールと脱水工程中に破裂します。しかし、負傷した胚における卵黄膜は、すでに分割され、脱水工程は、卵黄MEMBは削除されませんRANE。手devitellinzationは固定プロトコールを完了するために必要です。 慎重にトップヘプタン層を除去した後、新鮮な5mlのメタノールを加える。バイアルを振る、胚をシンクする必要があります。 ガラス転移ピペットを用いてメタノールプラス胚溶液を除去し、ガラス皿にナイロンメッシュコレクションチューブに集める。 メタノールを除去し、1×PBS溶液で胚をすすぐ。 リンゴジュースプレートにナイロンメッシュからの胚を転送します。プレートの表面に沿って胚を広げる。 ダブル粘着テープガラススライドに胚を移す。 1X PBSで胚をカバーしています。 注：胚が原因卵黄膜の凝集する傾向があります。リンゴジュースの場所を使用すると、凝集した胚の迅速な分離を可能にする。力から胚を除去するために適用されたときに胚を寒天プレートに沈むため、胚をプレートから除去し、両面接着テープをガラススライドに移されなければならない卵黄膜。 慎重に卵黄膜を「POP」する解剖針で胚を押してください。胚はPBS中に沈むはずです。 1.5ミリリットルチューブに1×PBSプラス胚を転送するためにガラスピペットを使用してください。 4℃で1×PBSおよびストアとの胚をすすぐエタノールを用いて胚を脱水するために進んでください：PBSシリーズ、in situハイブリダイゼーションや免疫局在プロトコル14 で続行します。