Mikroenjeksiyon Yara Deneyi ve<em> In vivo</em> Epidermal lokalizasyonu Tepki Gazeteciler Yara<em> Drosophila</em> Embriyolar.

Drosophila embriyonik yara protokol beş adımda özetlenebilir: (1) Embriyo Collection, (2) Embriyo Hazırlama (3) Embriyo Yaralama, (4) Embriyo Mikroenjeksiyon, ve (5) Embriyo Fiksasyon. 1.. Embriyo Koleksiyonu , Yetişkin sinekleri toplayın 2-3 gün eclosing sonra, bir embriyo toplama kafesine 50 kadın ve 25 erkek ekleyin. 3 gün boyunca her sabah taze bir elma suyu agar artı mantar plaka koyun. Notlar: 25 ° C inkübatör, 12 saat gündüz tarifesi optimum embriyo toplama, çevrimi için sinekler (ve 17:00 ışıklar "OFF" "ON" 05:00 ışıkları); dişi sinekler ışık döngüsü değişikliklere yanıt ve ışıkları "OFF" 10,11 "ON" ışıkları bir geçiş sırasında yumurta büyük miktarlarda yatıracaktır. Day-3 öğleden sonra, kafes üzerinde bir taze elma suyu artı maya agar plaka koyun ve 2 saat boyunca embriyolar toplamak. Kafese yeni bir maya tabak yerleştirin ve kaydedin2 saat toplama plakası. Embriyoların yaş 25 ° C'de ek bir 14 saat boyunca toplama plakası saklayın. Notlar: Yara iyileşmesi Drosophila gelişimi sırasında herhangi bir aşamada analiz edilebilir, bu yazıda bahsedilen yara ile indüklenen transkripsiyonel raportörler, 15-16 Aralık aşamaları arasında optimum aktiviteye sahiptir. Geç evre 17 tarafından, embriyo kolayca olgunlaşan manikür delmek ve verimli bir yara gazetecilere etkinleştirmek veya yara kaynaklı transkripsiyonunu tespit etmek çok eski. Toplama zamanı ve yaralama zaman yoğun laboratuvar saatlerinde meydana izin vermek için, biz, saat 18:00 'de yeni bir plaka ile toplama plakası alışverişi, 2 saat (16:00-18.00) için embriyo toplama bir program takip yaş 14 saat (bir gece) 25 ° C'de bir toplama plakası ve (bir sonraki gün) 08:00 'da embriyolar yara. 2. Embriyo Hazırlık Notlar: Bu protokol, keskin veya g yapılmış birçok araç ve nesne kullanımını içerirkız. Yaralanmaları önlemek için itina ile tüm keskin ve cam nesneler tutun. Yavaşça plaka ve dönen 2-3 ml su eklenerek bir fırça ile toplama plakalardan embriyolar kaldırmak. Naylon örgü ve toplama tüpü için plaka su ve embriyolar transfer. Bir plastik Petri tabağı plakasının kap ağartıcı 4-5 ml ekleyin ve 2 dakika için ağartıcı embriyoları içeren toplama borusunun kapalı ucu örgü emmek, embriyonun dış yumurtaların kaldırır. Elle toplama tüpü beyazlatıcıya kümeleyerek embriyolar önlemek için birkaç kez döndürün. Su 10x'e ile embriyolar durulayın ve bir kağıt havlu üzerine dechorionated embriyoları içeren örgüyle kaplı toplama tüpü kurulayın. Bir agar plaka örgü naylon ~ 50 embriyolar transfer etmek için bir diseksiyon iğnesi kullanın. Biz embriyo hizada kontrast ve yardım eklemek için agar plaka yeşil gıda boyası ekleyin. Bir mikroskop altında, Embry'yi hizalama, ~ 25 embriyo, iki paralel satır yapmakslayt üzerinde os da mikroenjeksiyon aparatı üzerinde delme iğnesine doğru açıda olacak şekilde. Gaz değişimi amaçlı embriyolar arasında küçük bir boşluk (yaklaşık 1 embriyo uzunluğu) bırakın. Iki paralel sıra birbirinden yaklaşık 5 mm olmalıdır. Hizalanmış embriyoların üstüne çift kaset sopa ile bir slayt yerleştirin ve dikkatli bir slayt yeşil plaka embriyolar transfer slayt basın. Sonra hava embriyoların kuru ~ 25 dk embriyo üzerinde iç basıncı azaltmak ve yaralama zaman bir patlama önlemek için. Daha fazla su kaybını önlemek için embriyolar üzerinde halokarbonlu yağ karışımı 2-3 damla yerleştirin. 3. Embriyo Yaralama Enjeksiyon mikroskop aşamada taslak slayt yerleştirin. Görüş alanında embriyolar bulmak ve ters mikroskop sahne hareket uygulama. Notlar: iğne ile çalışmaya başlamadan önce, dorsoventral ekseni boyunca embriyonun orta düzlemine odaklanmak. Verimli yaraladığı için izin vermek içinhizalanmış embriyolar, yakın iğne aparatı satır yaralama başlar. Görüş alanı içine hizalanmış embriyoların satırın üst getirmek için sahne hareket ettirin. Dikkatlice yerleştirin ve iğne tutucu bir çekti-iğne sabitleyin. Slayt aşağı doğru iğne taşımak için mikromanipülatör kullanın. Aynı odak düzlemi, embriyo ile iğne hizalayın. Iğne embriyo ile odak sonra, mikromanipülatör ile iğne taşımak yok. Sonra üst üste sonraki embriyo taşımak, ve aracılığıyla embriyo delinme sahne taşıyın. İlk satırı yaralama Bittiğinde, slayt taşımadan önce aşamasından yukarı ve uzağa tamamen iğne taşımak için micromanipulator kullanmak, manuel slayt 180 ° döndürmek ve ikinci satır yara. Oda sıcaklığında halokarbonlu yağ altında embriyoların Mağaza ve embriyo sabitleme ile devam situ hibridizasyon veya antikor boyama yapıyor if (Prosedür adım 5). Seçenek olarak ise, 4-6 saat için embriyolar depolamakhalokarbonlu yağ altında ve yara transkripsiyon floresan muhabiri görselleştirme (Temsilcisi Sonuçlar) ile devam. Notlar: floresan haberci görselleştirilmesi için,% 50 1-fenoksi-2-propanol ile 13 embriyolar anestezi. Embriyolar halokarbon yağdan çıkarıldı ve yeni bir lam üzerine yerleştirilir. Biz, embriyoların etrafında cam boncuklar yer anestezik birkaç damla ekleyin ve embriyolar üzerinde bir kapak kayma yerleştirin. 4. Embriyo Mikroenjeksiyon Notlar: Biz protokol kullanmak mikroenjeksiyon aparatı tahlil sırasında belirli bir ses sunmak için otomatik değildir. Biz mikroenjeksiyon görselleştirmek ve teslim ses normalleştirmek için denemek için çözüm bir boya ekleyin. Çok fazla çözelti embriyonun içine enjekte edilir, vitellin zar patlar. Kimyasal çözeltinin ayrıca boya 1 ul arkadan yük iğne (örn. 0,6 MH 2 O 2). Kılcal iziniğnenin ucuna kimyasal çözüm çizmek için eylemi. Bir iğne kırmak için, bir slayt ve ceket halokarbonlu yağ karışımı ile kenar üzerinde bir açıyla bir kapak kayma yerleştirin. Açılı kapak kayma kenarı ile odak haline monte iğne getirin ve hafifçe kırık kadar iğne ucu genelinde kapak kayma kenarına taşıyın. Mikroenjeksiyon cihazları üzerinde baskı uygulayın ve kimyasal çözüm artı boya iğne dışarı aktığını kontrol edin. Mikroskop sahnede hizada embriyoları içeren slayt yerleştirin. Aynı düzlemde embriyo ve iğne odak geçin. Aynı anda delinme ve Microinject kimyasal çözelti artı her embriyo içine boya. Notlar: Tıkalı iğneler sık ​​sık meydana gelen; eksik mikroenjeksiyon önlemek için yeni bir iğne kırmak. Bir künt bir iğne ucu kadar temiz açılı bir iğne ucu kadar yara almaz. Kırılması sırasında olmayan 90 ° açı ile lamel ayarlanması açılı bir iğne ucu üretmek için en uygunudur. 5. Formaldehit Fixation Notlar: Bu Drosophila tespitte kullanılan kimyasallar zararlıdır. Kimyasalları kullanırken kişisel koruyucu ekipman (örn. eldiven, laboratuvar önlüğü ve koruyucu gözlük) kullanın. Düzenlenir kimyasalların atılması için bireysel, kurumsal yönergeleri izleyin. Yaralanma sonrasında ortaya yara-teşvik edilmiş genlerin transkripsiyonel aktivasyonu için 15, 30, 60, ya da daha fazla dakika bekleyin. Enjeksiyon slaytlar embriyolar kaldırmak için, dikkatli, slaytlardan halokarbonlu yağ karışımı boşaltın rafa karşı slayt yalın ve bir Kimwipe ucunu kurulayın. Slayt üzerinde heptan durulama ve bir cam Petri kabı içine sıvı durulama yıkamak için bir cam pipet kullanın. Heptane bandı çözülür ve embriyolar yayınlayacak. Tüm embriyolar slayt kaldırılana kadar çalkalamaya devam edin. Tüm embriyolar slaytlar kaldırılana kadar, bir sonraki slayta geçin. 20 ml'lik bir bilim içine cam çanak heptan çözeltisi artı embriyo transferntillation flakon. 2-3 dakika boyunca çalkalayınız, heptan kaldırmak ve taze heptan 5 ml ekleyin. Taze, fiksasyon solüsyonu 5 ml ekleyin (tarifi için reaktifler listesine bakınız). Kapatılır ve orbital çalkalama platformunda ekleyin. 220-230 rpm'de 25 dakika boyunca embriyoları içeren şişe çalkalayın. Çalkalanmış, arayüz pop da kabarcıklar sağlar. Tamamen embriyolar çekerek kaçınarak, bir pipet ile alt, sulu faz kaldırın. Alt tabaka, sabitleme çözeltisi oluşmaktadır ve uygun şekilde atılmalıdır. , Metanol 5 ml ekleyin, şişeyi kap ve 20-30 sn, girdap için elle kuvvetlice çalkalanır ve tezgah üzerine yerleştirin. Yaralı embriyolar interfaz kalacak ve dibe batar olmayacaktır. Notlar: Tespit edildikten sonra bir yaralı olmayan embriyo vitellin zar normal olarak metanol ile dehidrasyon aşaması esnasında patlar. Ancak, yaralı embriyo vitellin zar zaten kırılmış ve dehidratasyon adım vitellin memb kaldırmazrane. El devitellinzation tespit protokolü tamamlamak için gereklidir. Dikkatli bir şekilde üst heptan tabakayı kaldırmak ve sonra taze metanol 5 ml ekleyin. Şişeyi çalkalayın ve embriyolar lavabo olmalıdır. Bir cam aktarım pipet ile metanol artı embriyo çözüm çıkarın ve bir cam tabak içinde, naylon örgü toplama tüpü içinde toplar. Metanol çıkarın ve 1x PBS çözeltisi ile embriyolar yıkayın. Bir elma suyu plaka için naylon mesh embriyolar transfer. Levhanın yüzeyi boyunca embriyolar yayıldı. Bir çift sopa bant cam slayt embriyolar transfer. 1x PBS ile embriyolar örtün. Notlar: Embriyolar nedeniyle vitellin membran gelme eğilimindedir. Bir elma suyu kullanarak yer topaklaşmış embriyoların hızlı bir şekilde ayrılmasına izin verir. Kuvvet embriyo kaldırmak için uygulandığı zaman embriyolar agar plakası gömülmek için embriyolar, levhadan kaldırılır ve bir çift çubuk bant cam slayt aktarılmalıdırvitellin membran. Dikkatle vitellin membran "pop" bir diseksiyon iğne ile embriyolar itin. Embriyo PBS içinde lavabo olmalıdır. Bir 1.5 ml tüp 1x PBS ve embriyo transferi için bir cam pipet kullanın. 4 ° C'de 1x PBS ve mağaza ile embriyolar durulayın PBS serisi ve in situ hibridizasyon veya bağışık protokolü 14 devam: Bir Etanol kullanılarak embriyolar kurutmak geçin.