Mikroinjektion Wound Assay und<em> In-vivo-</em> Lokalisierung von Epidermal Wundreaktion Reporter in<em> Drosophila</em> Embryos.
Summary
Die embryonalen Epidermis der sehr späten Stadium Drosophila-Embryonen stellt eine in vivo-System für die schnelle Stichwunde Response-Analyse und kann mit genetischen Manipulationen oder chemische Mikroinjektion Behandlungen kombiniert, um Studien in der Wundheilung für die Übersetzung in Säugetier-Modelle voranzubringen.
Abstract
Die Drosophila-Embryo entwickelt eine robuste Epidermis, die sowohl die internen Zellen aus einer harten äußeren Umwelt zu schützen sowie die zellulären Homöostase dient. Stichverletzungen mit Nadeln Glas bietet eine direkte Methode, um eine schnelle Antwort, die epidermalen Wund Wunde Transkriptions-Reporter, der von einem lokalisierten Reportersignal in lebenden Embryonen oder Larven sichtbar gemacht werden kann aktiviert auslösen. Pannen-oder Laser Verletzungen liefert auch Signale, die die Rekrutierung von Blutzellen an der Wundstelle zu fördern. Überraschenderweise schwerer (durch und durch) Stichverletzung im späten Stadium Embryonen nur selten stört die normale Embryonalentwicklung, als mehr als 90% dieser verwundet Embryonen überleben bis ins Erwachsenenalter, wenn Embryonen werden in einer Öl-Medium, das sofortige Auslaufen der Hämolymphe von Punktionsstellen minimiert injiziert . Die Wunde Verfahren erfordert Mikromanipulation der Drosophila-Embryonen, einschließlich manuelle Ausrichtung der Embryonen auf agar Platten und den Transfer der Embryonen ausgerichtet auf Objektträger. Die Drosophila epidermalen Wundreaktion Assay bietet einen schnellen System, um die genetischen Anforderungen einer Vielzahl von biologischen Funktionen, die Wundheilung, sowie ein Weg, um für potenzielle chemische Verbindungen, die die Wundheilung fördern, fördern Bildschirm testen. Die kurze Lebensdauer und einfache Kultivierung Routine zu machen Drosophila ein leistungsfähiges Modellorganismus. Drosophila Wundheilung sauber erscheint, um die epidermale regenerative Reaktion zu koordinieren, mit der angeborenen Immunantwort, in einer Weise, die noch untersucht werden, die ein ausgezeichnetes System konservierten regulatorischen zu finden bietet Mechanismen gemeinsam Drosophila und Säugetieren epidermalen Verwundung.
Introduction
Manipulation von Drosophila-Embryonen mit einer Mikroinjektionstechnik ist eine gut etablierte Assay ein. Die Bedeutung der epidermalen Wundantwort Reporter Verfahren ist, das Protokoll für die Punktion / Mikroinjektion mit fluoreszierenden Reporter kombiniert und visualisiert eine in vivo Antwort auf epidermale Schädigung in Drosophila-Embryonen. Das Ziel dieser Methode ist es, eine breitere Gruppe von Wissenschaftlern ermöglichen, Drosophila als Werkzeug, um die Prozesse, die die Transkriptions Reaktion auf epidermalen Stichverletzung regeln untersuchen zu verwenden. Die einschichtige Epidermis in Drosophila stellt ein einfaches System, um einen epidermalen Wundreaktion nach einer Stichverletzung 2 zu studieren. Die Drosophila-Embryo ist eine robuste Modellsystem, um genetisch sezieren die Phasen der Wundheilung, einschließlich Wundreaktion, Entzündung und Reepithelialisierung 3. Dies ist zum Teil, weil viele oder die meisten zygotischen Mutanten überleben Ende embryogenesist und zu entwickeln epidermalen Barrieren, auch wenn Entwicklungs Strukturierung geht grundlegend schief. Zurück Charakterisierung eines gut erhaltenen Transkriptionsfaktor Körniger Kopf (Grh), festgestellt, dass Grh-Zielgene Dopa-Decarboxylase (DDC) und Tyrosin-Hydroxylase (PLE) transkriptionell rund um die Standorte der Verletzung 4 aktiviert. Drosophila als Modellorganismus für die Wundantwort bietet eine ergänzende Reihe von Untersuchungen, Studien in Säuger 5 Wundheilung voranzutreiben. Nachfolgende Studien haben zusätzliche Drosophila wundinduzierten Gene identifiziert und entwickelte ein "Toolkit" von vielen fluoreszierenden Reporter Wunde, um die in vivo epidermalen Wundreaktion überwachen zu reinigen Verwundung 6. Jüngste Berichte über die Regulierung der Drosophila-Wundheilung wurden auf der Wundverschluss Phänotyp konzentriert, so dass Entdeckung der vielen Wege Regulation der Zellmigration 7,8. Bei der Analyse derfluoreszierenden Reporter Wunde, haben unsere Untersuchungen einen neuen Satz von Genen für die lokalisierte Expression des epidermalen Wunden induzierbare Gene 9 erforderlich identifiziert. Einer der Vorzüge der Wundreaktion Reporter Verfahrens ist, daß die Ergebnisse mehr Einblick in einen Mechanismus, wie Signale von der Stelle der Verletzung zu den benachbarten Zellen transduziert. Allerdings ist einer der Nachteile der Wundreaktion Reporter Verfahren, dass die Ergebnisse nicht direkt verlinken auf Phänotypen bei der Wundheilung oder Reparatur. Breitere Nutzung der sauberen Wunde Punktion-Protokoll in der genetischen und chemischen Bildschirme ermöglichen neue Regulatoren der Transkriptions Reaktion auf epidermalen Verwundung identifiziert werden und ferner die Übersetzung von Wundheilungs Entdeckungen in Säugetiermodelle Verletzungsbehandlungen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Eine sofortige Transkriptionsregulations Reaktion auf externe Signale erlaubt den Zellen, eine lokalisierte Reaktion auf extrazelluläre Reize, die Stress, Schäden oder Infektion zählen kann koordinieren. Die unsachgemäße Kontrolle eines lokalisierten Antwort kann schädliche Auswirkungen auf die Nachbarzellen, sowie eine Verschwendung von Ressourcen, um die Schädigung zu reparieren. Die Drosophila-Embryo bietet ein ausgezeichnetes System, grundlegende Experimente in der Wundheilung eine kostengünstige und einfach zu pflegen Modellorganismus führen. Das Potenzial für Kooperationen zwischen Forschung in anderen Modellorganismen Drosophila und bietet eine einzigartige Gelegenheit, viele biologische Fragestellungen zu erforschen.
Eine weitere Technik der Wund Reporter ist die Kombination von mutierten genetischen Hintergründen, ein effizientes Verfahren zum Testen der Beitrag der neuen Gene in die Aktivierung des epidermalen Wundreaktionsweges. Wir haben epidermalen wundinduzierten Transkriptions Reportern avTENBLÄTTER sowohl am 2. und 3. 5 Chromosomen. In dieser Studie verwenden wir GAL4 UAS-Systeme und der Überexpression 16. Für Studien mit tödlichen mutierten Allele bestimmen wir den genetischen Hintergrund mit einem fluoreszierenden Balancer-Chromosom, zB Kruppel-GFP-17. Wir haben die Wunde Reporter Lokalisierung in mehreren genetischen Hintergründen (Tabelle 1) analysiert.
Eine mögliche Modifikation der Technik ist es, die Mikroinjektion und Verwundung zu kombinieren. Mikroinjektion kann verwendet werden, um eine chemische Lösung in den Embryo eingeführt werden. Mehrere chemische Verbindungen wurden getestet und es wurde gefunden, um die Aktivität der epidermalen Wund Reportern 9 regulieren. Dieses Verfahren der gleichzeitigen Verwundung und Mikroinjektion kann nützlich sein, um die Anzahl der Zellen in der Drosophila-Embryo, der eine Wunde Signal reagieren und kann direkt auf Veränderungen der Genexpression überwacht werden nach der Verwundung 18 zu erhöhen. Eine zukünftige Anwendung der Mikroinjektionstechnik wird es sein, neue Chemikalien zur Regulierung des epidermalen Wundreaktion zu testen.
Drosophila als Modellsystem für genetische Studien bietet eine breite Palette von einfachen bis zu komplexen Fragen Protokolle effizient anzugehen. Jüngste Berichte über die Durchführbarkeit der Drosophila Techniken unterstreicht die Verwendung von hemocyte Migration 19 und 20 Schlupfwespe Infektion als ein Mittel, um die Auswirkungen der Drosophila-Forschung weiter auszubauen. Neben Wundheilung Studien, Drosophila bietet ein klassisches Modell für die Regeneration mit Imaginalscheibe System 21,22. Die kombinierten Fortschritte in Imaginalscheibe Regeneration Studien-und Stich / Mikroinjektion Verwundung bietet ein ausgezeichnetes System zur gut erhaltenen Komponenten des Gewebereparatur zu entdecken.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dieses Protokoll wurde in Zusammenarbeit mit der bisherigen Mitglieder des McGinnis Lab, Kim A. Mace und Joseph C. Pearson entwickelt. Wir danken den fortgesetzten Bemühungen der Bloomington Drosophila Stock Center für ihre Arbeit zu organisieren und zu verteilen wertvolle Bestände. Diese Arbeit wurde durch Mittel aus dem National Institutes of Health (R01 und K12 GM077197 GM68524) und die Familie von Herbert Stern unterstützt. MTJ wird derzeit von Grant Number 5G12RR003060-26 aus dem National Center for Research Resources und Grant Number 8G12MD7603-27 aus dem Nationalen Institut für Minderheiten Gesundheit und Gesundheit Disparitäten unterstützt. Der Inhalt ist ausschließlich der Verantwortung der Autoren und nicht notwendigerweise die offizielle Meinung des Nationalen Instituts für Minderheiten Gesundheit und Gesundheit Disparitäten oder den National Institutes of Health.
Materials
| yeast | Sigma Aldrich | 51475 | |
| apple juice | Generic | ||
| agar | Fisher Scientific | 50-824-297 | |
| bleach | Generic | ||
| halocarbon oil, 700 W | Sigma Aldrich | H8898 | |
| halocarbon oil, 27 W | Sigma Aldrich | H8773 | |
| 1-phenoxy-2-propanol | Sigma Aldrich | 484423 | |
| hydrogen peroxide | Fisher Scientific | H324 | |
| methyl-β-cyclodextrin | Sigma Aldrich | C4555 | |
| toluidine blue | Sigma Aldrich | 89640 | |
| formaldehyde, 16% | Polysciences, Inc | 18814-20 | toxic chemical |
| heptane | Fisher Scientific | H360-1 | toxic chemical |
| methanol | Fisher Scientific | A412-1 | toxic chemical |
| 10x PBS | Fisher Scientific | 50-899-90013 | |
| 0.5 M EGTA | Fisher Scientific | 50-255-956 | |
| RNase free H2O | Fisher Scientific | BP2819-100 | |
| Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila incubator | Genessee Scientific | 59-197 | |
| fly cage | Genessee Scientific | 59-100 | |
| embryo collection tube | Genessee Scientific | 46-101 | |
| plastic Petri dish | Fisher Scientific | 50-202-037 | |
| double-stick tape | Generic | ||
| paintbrush | Generic | ||
| dissection needle | Fisher Scientific | 08-965A | sharp object |
| glass cover slip | Thermo Scientific | 3306 | sharp object |
| microscope slide | Thermo Scientific | 4445 | sharp object |
| dissecting microscope | Carl Zeiss | Stemi-2000 | |
| capillary needle | FHC | 30-30-1 | sharp object |
| needle puller | Narishige | PC10 | |
| microinjection needle holder | Narishige | MINJ4 | |
| micromanipulator | Narishige | MN151 | |
| inverted microscope | Carl Zeiss | Primo-Vert | |
| glass Petri dish | Fisher Scientific | 08-747A | sharp object |
| glass Pasteur pipette | Fisher Scientific | 22-063-172 | sharp object |
| transfer bulb | Fisher Scientific | 03-448-25 | |
| Kimwipe | Fisher Scientific | 06-666A | |
| scintillation vial | Fisher Scientific | 03-337-7 | sharp object |
| orbital shaker | Fisher Scientific | 14-259-260 | |
| 1.5 ml tube | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| laser scanning confocal | Leica | SP2 | |
| fixation solution | (5 ml) | ||
| 16% formaldehyde | 2.5 ml | toxic chemical | |
| 10x PBS | 0.5 ml | ||
| 0.5 M EGTA | 0.5 ml | ||
| RNase free H2O | 1.5 ml | ||
| Halocarbon oil mix | (10 ml) | ||
| halocarbon oil, 700 W | 5 ml | ||
| halocarbon oil, 27 W | 5 ml |
References
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