حقن مكروي الجرح الفحص و<em> في الجسم الحي</em> توطين البشرة الجرح مراسلون الاستجابة في<em> ذبابة الفاكهة</em> الأجنة.
Summary
البشرة الجنينية من الأجنة مرحلة متأخرة جدا ذبابة الفاكهة يوفر نظام في الجسم الحي لتحليل استجابة ثقب الجرح سريعا ويمكن دمجها مع التلاعب الجيني أو علاجات حقن مكروي الكيميائية للمضي قدما دراسات في التئام الجروح للترجمة في نماذج الثدييات.
Abstract
الجنين ذبابة الفاكهة يطور طبقة البشرة قوية يخدم على حد سواء لحماية الخلايا الداخلية من البيئة الخارجية القاسية وكذلك للحفاظ على التوازن الخلوية. إصابة ثقب الإبر مع الزجاج يوفر طريقة مباشرة لتحريك البشرة الجرح الاستجابة السريعة التي ينشط الجرح صحفيين النسخي، والتي يمكن أن تصور من قبل إشارة مراسل المترجمة في الأجنة الحية أو اليرقات. كما يوفر ثقب أو الليزر إصابة الإشارات التي تشجع على توظيف hemocytes إلى موقع الجرح. من المستغرب، شديدة (من خلال وعبر) إصابة الأجنة ثقب في مرحلة متأخرة إلا نادرا يعطل التطور الجنيني الطبيعي، وأكثر من 90٪ من هذه الأجنة الجرحى البقاء على قيد الحياة إلى مرحلة البلوغ عندما يتم حقن الأجنة في المتوسط للنفط التي تقلل من تسرب الفوري لالدملمف من مواقع ثقب . الإجراء الجرح لا تتطلب المجهرية للأجنة ذبابة الفاكهة، بما في ذلك المواءمة دليل للأجنة على آغلوحات ع ونقل الأجنة إلى محاذاة المجهر الشرائح. يوفر استجابة ذبابة الفاكهة البشرة الجرح فحص نظام سريع لاختبار متطلبات الوراثية من مجموعة متنوعة من الوظائف البيولوجية التي تعزز التئام الجروح، وكذلك وسيلة للكشف عن المركبات الكيميائية المحتملة التي تعزز التئام الجروح. دورة حياة قصيرة وسهلة زراعة الروتينية جعل ذبابة الفاكهة نموذج كائن قوية. يبدو ذبابة الفاكهة نظيفة التئام الجروح لتنسيق استجابة التجدد البشرة، مع الاستجابة المناعية الفطرية، في الطرق التي لا تزال قيد التحقيق، والذي يوفر نظام ممتاز للعثور على الحفظ التنظيمية آليات مشتركة لذبابة الفاكهة والثدييات البشرة جرح.
Introduction
التلاعب في الأجنة ذبابة الفاكهة باستخدام تقنية حقن مكروي هو مقايسة راسخة 1. أهمية أسلوب مراسل استجابة البشرة الجرح هو الجمع بين بروتوكول للثقب / حقن مكروي مع صحفيين الفلورسنت وتصور استجابة في الجسم الحي لإصابات البشرة في أجنة ذبابة الفاكهة. الهدف من هذا الأسلوب هو تمكين مجموعة أوسع من العلماء لاستخدام ذبابة الفاكهة كأداة للتحقيق في العمليات التي تنظم استجابة النسخي لإصابات البشرة ثقب. البشرة احدة الطبقات في ذبابة الفاكهة يوفر نظام بسيط لدراسة استجابة البشرة الجرح بعد إصابة ثقب 2. الجنين ذبابة الفاكهة هو نظام نموذجي قوية لتشريح وراثيا مراحل إصلاح الجرح، بما في ذلك الاستجابة الجرح، والالتهابات، وعودة التظهرن 3. هذا هو في جزء منه لأن العديد أو معظم لاقحي المسوخ البقاء على قيد الحياة حتى نهاية embryogenesهو وتطوير الحواجز البشرة حتى عندما يذهب الزخرفة التنموية منحرف عميقا. توصيف سابق من حفظها جيدا عامل النسخ رئيس محبب (GRH)، حدد أن الجينات المستهدفة GRH دوبا كربوكسيل (DDC) وهيدروكسيلاز التيروزين (التنوير القائل) يتم تنشيط transcriptionally حول مواقع الإصابة 4. ذبابة الفاكهة باعتباره النموذج الحي للاستجابة الجرح يوفر خط التكميلية التحقيق للمضي قدما في دراسات الثدييات التئام الجروح 5. وقد حددت الدراسات اللاحقة ذبابة الفاكهة جينات إضافية الناجم عن الجرح ووضع "أدوات" للعديد من الصحفيين الجرح الفلورسنت لرصد المجراة البشرة استجابة لتنظيف الجرح جرح 6. وقد ركزت التقارير الأخيرة بشأن تنظيم شفاء الجرح ذبابة الفاكهة على النمط الظاهري إغلاق الجرح، مما يسمح باكتشاف العديد من مسارات تنظيم الهجرة الخلية 7،8. مع تحليلالجرح صحفيين الفلورسنت، وقد حددت الدراسات لدينا مجموعة جديدة من الجينات المطلوبة للتعبير المترجمة من البشرة الجرح محرض الجينات 9. واحدة من مزايا أسلوب مراسل استجابة الجرح هو أن النتائج تقدم المزيد من التبصر في آلية لكيفية transduced إشارات من موقع الإصابة إلى الخلايا المجاورة. ومع ذلك، واحدة من عيوب أسلوب مراسل استجابة الجرح هو أن النتائج لا تصل مباشرة إلى الظواهر في التئام الجروح أو إصلاح. وتوسيع نطاق الاستفادة من بروتوكول الجرح ثقب نظيفة في شاشات الوراثية والكيميائية سماح المنظمين جديدة للاستجابة النسخي إلى البشرة مما أسفر عن إصابة الكشف عن هويته، وتعزيز التئام الجروح ترجمة الاكتشافات في نماذج الثدييات من العلاجات الاصابة.
Protocol
Representative Results
Discussion
استجابة فورية لالنسخي التنظيمية العظة الخارجية يسمح الخلايا لتنسيق الاستجابة للمحفزات محلية خارج الخلية، والتي يمكن أن تشمل الإجهاد، والضرر، أو العدوى. سيطرة غير السليم للاستجابة محلية يمكن أن يكون لها آثار ضارة على الخلايا المجاورة، فضلا عن هدر الموارد لإصلاح الضرر. يوفر الجنين ذبابة الفاكهة نظام ممتاز لإجراء تجارب التئام الجروح الأساسية في الحفاظ على لسهلة وغير مكلفة والنموذج الحي. إمكانية التعاون بين البحوث في الكائنات نموذج آخر وذبابة الفاكهة يوفر فرصة فريدة لاستكشاف العديد من الأسئلة البيولوجية.
تقنية إضافية للصحفيين الجرح هو مزيج من الخلفيات الوراثية متحولة، وتوفير وسيلة فعالة لاختبار الجينات مساهمة جديدة لتفعيل المسار استجابة البشرة الجرح. لدينا البشرة الناجم عن الجرح صحفيين النسخي AVailable على كل من الثانية 2 و 3 الكروموزومات الثالثة 5. في هذه الدراسة التي نستخدمها UAS ونظم GAL4 من 16 من overexpression. للدراسات مع الأليلات الطافرة قاتلة نحدد الخلفية الجينية باستخدام كروموسوم موازن الفلورسنت، على سبيل المثال Kruppel-GFP 17. قمنا بتحليل توطين مراسل الجرح في عدة خلفيات وراثية (TABLE1).
وهناك تعديل محتمل للتقنية هو الجمع بين حقن مكروي وجرح. حقن مكروي يمكن استخدامها لتقديم حل الكيميائية إلى الجنين. وقد تم اختبار العديد من المركبات الكيميائية وعثر لتنظيم نشاط للصحفيين البشرة الجرح 9. هذا الأسلوب من جرح وحقن مكروي في وقت واحد يمكن أن يكون مفيدا لزيادة عدد الخلايا في الجنين ذبابة الفاكهة التي تستجيب إشارة الجرح، ويمكن استخدامها مباشرة لرصد التغيرات في التعبير الجيني بعد اصابة 18. وسوف تطبيقها في المستقبل من تقنية حقن مكروي يكون لاختبار المواد الكيميائية الرواية لتنظيم استجابة البشرة الجرح.
ذبابة الفاكهة كنظام نموذج للدراسات الجينية يقدم مجموعة واسعة من بروتوكولات بسيط لمعالجة المسائل المعقدة بكفاءة. التقارير الأخيرة حول جدوى تقنيات ذبابة الفاكهة يسلط الضوء على استخدام الهجرة كرية دموية 19 وإصابة 20 دبور الطفيلية كوسيلة لتوسيع تأثير مجتمع البحوث ذبابة الفاكهة. بالإضافة إلى دراسات إصلاح الجرح، ويوفر ذبابة الفاكهة نموذجا الكلاسيكية للتجديد مع نظام القرص تخيلي 21،22. التقدم جنبا إلى جنب في الدراسات القرص تجديد تخيلي وثقب / حقن مكروي جرح يوفر نظام ممتاز لاكتشاف مكونات حفظها جيدا من إصلاح الأنسجة.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم تطوير هذا البروتوكول بالتعاون مع أعضاء السابقة للمختبر مغينس، كيم A. الصولجان وجوزيف جيم بيرسون. نشكر الجهود المتواصلة من قبل المركز الأسهم ذبابة الفاكهة بلومنجتون لعملهم لتنظيم وتوزيع أسهم القيمة. وأيد هذا العمل من خلال تمويل من المعاهد الوطنية للصحة (R01 GM077197 وK12 GM68524) وعائلة هربرت شتيرن. معتمد حاليا من قبل MTJ غرانت عدد 5G12RR003060-26 من المركز الوطني للبحوث الموارد والمنح عدد 8G12MD7603-27 من المعهد الوطني لصحة الأقليات والفوارق الصحية. المحتوى هو فقط من مسؤولية الكتاب ولا تمثل بالضرورة وجهة النظر الرسمية للمعهد الوطني في الأقلية الصحة والصحة التفاوت أو المعاهد الوطنية للصحة.
Materials
| yeast | Sigma Aldrich | 51475 | |
| apple juice | Generic | ||
| agar | Fisher Scientific | 50-824-297 | |
| bleach | Generic | ||
| halocarbon oil, 700 W | Sigma Aldrich | H8898 | |
| halocarbon oil, 27 W | Sigma Aldrich | H8773 | |
| 1-phenoxy-2-propanol | Sigma Aldrich | 484423 | |
| hydrogen peroxide | Fisher Scientific | H324 | |
| methyl-β-cyclodextrin | Sigma Aldrich | C4555 | |
| toluidine blue | Sigma Aldrich | 89640 | |
| formaldehyde, 16% | Polysciences, Inc | 18814-20 | toxic chemical |
| heptane | Fisher Scientific | H360-1 | toxic chemical |
| methanol | Fisher Scientific | A412-1 | toxic chemical |
| 10x PBS | Fisher Scientific | 50-899-90013 | |
| 0.5 M EGTA | Fisher Scientific | 50-255-956 | |
| RNase free H2O | Fisher Scientific | BP2819-100 | |
| Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila incubator | Genessee Scientific | 59-197 | |
| fly cage | Genessee Scientific | 59-100 | |
| embryo collection tube | Genessee Scientific | 46-101 | |
| plastic Petri dish | Fisher Scientific | 50-202-037 | |
| double-stick tape | Generic | ||
| paintbrush | Generic | ||
| dissection needle | Fisher Scientific | 08-965A | sharp object |
| glass cover slip | Thermo Scientific | 3306 | sharp object |
| microscope slide | Thermo Scientific | 4445 | sharp object |
| dissecting microscope | Carl Zeiss | Stemi-2000 | |
| capillary needle | FHC | 30-30-1 | sharp object |
| needle puller | Narishige | PC10 | |
| microinjection needle holder | Narishige | MINJ4 | |
| micromanipulator | Narishige | MN151 | |
| inverted microscope | Carl Zeiss | Primo-Vert | |
| glass Petri dish | Fisher Scientific | 08-747A | sharp object |
| glass Pasteur pipette | Fisher Scientific | 22-063-172 | sharp object |
| transfer bulb | Fisher Scientific | 03-448-25 | |
| Kimwipe | Fisher Scientific | 06-666A | |
| scintillation vial | Fisher Scientific | 03-337-7 | sharp object |
| orbital shaker | Fisher Scientific | 14-259-260 | |
| 1.5 ml tube | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| laser scanning confocal | Leica | SP2 | |
| fixation solution | (5 ml) | ||
| 16% formaldehyde | 2.5 ml | toxic chemical | |
| 10x PBS | 0.5 ml | ||
| 0.5 M EGTA | 0.5 ml | ||
| RNase free H2O | 1.5 ml | ||
| Halocarbon oil mix | (10 ml) | ||
| halocarbon oil, 700 W | 5 ml | ||
| halocarbon oil, 27 W | 5 ml |
References
- Germeraad, S. Genetic transformation in Drosophila by microinjection of DNA. Nature. 262 (5565), 229-231 (1976).
- Payre, F. Genetic control of epidermis differentiation in Drosophila. Int. J. Dev. Biol. 48 (2-3), 207-215 (2004).
- Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. Wound repair and regeneration. Nature. 453 (7193), 314-321 (2008).
- Mace, K. A., Pearson, J. C., McGinnis, W. An epidermal barrier wound repair pathway in Drosophila is mediated by grainy head. Science. 308 (5720), 381-385 (2005).
- Ting, S. B., Caddy, J., et al. A homolog of Drosophila grainy head is essential for epidermal integrity in mice. Science. 308 (5720), 411-413 (2005).
- Pearson, J. C., Juarez, M. T., Kim, M., Drivenes, &. #. 2. 1. 6. ;., McGinnis, W. Multiple transcription factor codes activate epidermal wound-response genes in Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (7), 2224-2229 (2009).
- Campos, I., Geiger, J. A., Santos, A. C., Carlos, V., Jacinto, A. Genetic screen in Drosophila melanogaster uncovers a novel set of genes required for embryonic epithelial repair. Genetics. 184 (1), 129-140 (2010).
- Lesch, C., Jo, J., Wu, Y., Fish, G. S., Galko, M. J. A targeted UAS-RNAi screen in Drosophila larvae identifies wound closure genes regulating distinct cellular processes. Genetics. 186 (3), 943-957 (2010).
- Juarez, M. T., Patterson, R. A., Sandoval-Guillen, E., McGinnis, W. Duox, Flotillin-2, and Src42A are required to activate or delimit the spread of the transcriptional response to epidermal wounds in Drosophila. PLoS Genet. 7 (12), e1002424 (2011).
- Allemand, R. Influence of light condition modification on the circadian rhythm of vitellogenesis and ovulation in Drosophila melanogaster. J. Insect Physiol. 22 (8), 1075-1080 (1976).
- Allemand, R. Rhythm of vitellogenesis and ovulation in photoperiod ld 12:12 of Drosophila melanogaster. Insect Physiol. 22 (7), 1031-1035 (1976).
- Pierre, S. E., Thurmond, J. FlyBase 101 – the basics of navigating FlyBase. Nucleic Acids Res. 40 (D1), D706-D714 (2012).
- Wyeth, R. C., Croll, R. P., Willows, A. O. D., Spencer, A. N. 1-Phenoxy-2-propanol is a useful anaesthetic for gastropods used in neurophysiology. J. Neurosci. Methods. 176 (2), 121-128 (2009).
- Kosman, D., Mizutani, C. M., Lemons, D., Cox, W. G., McGinnis, W., Bier, E. Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos. Science. 305 (5685), 846 (2004).
- Barolo, S., Castro, B., Posakony, J. W. New Drosophila transgenic reporters: insulated P-element vectors expressing fast-maturing RFP. BioTechniques. 36 (3), 436-440 (2004).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Casso, D., Ramírez-Weber, F., Kornberg, T. B. GFP-tagged balancer chromosomes for Drosophila melanogaster. Mech. Dev. 91 (1-2), 451-454 (2000).
- Patterson, R. A., Juarez, M. T., Hermann, A., Sasik, R., Hardiman, G., McGinnis, W. Serine proteolytic pathway activation reveals an expanded ensemble of wound response genes in Drosophila. PloS one. 8 (4), e61773 (2013).
- Evans, I. R., Zanet, J., Wood, W., Stramer, B. M. Live imaging of Drosophila melanogaster embryonic hemocyte migrations. J. Vis. Exp. (36), e1696 (2010).
- Small, C., Paddibhatla, I., Rajwani, R., Govind, S. An introduction to parasitic wasps of Drosophila and the antiparasite immune response. J. Vis. Exp. (63), e3347 (2012).
- Repiso, A., Bergantiños, C., Corominas, M., Serras, F. Tissue repair and regeneration in Drosophila imaginal discs. Dev. Growth Differ. 53 (2), 177-185 (2011).
- Worley, M. I., Setiawan, L., Hariharan, I. K. Regeneration and transdetermination in Drosophila imaginal discs. Annu. Rev. Genet. 46, 289-310 (2012).
