شبكية العين مفرزة النموذجي في القوارض بواسطة حقن تحت الشبكية من هيالورونات الصوديوم
Summary
إنشاء مفارز الشبكية التجريبية مع ارتفاع استنساخه ومستمرة من مفرزة، ودون نزف تحت الشبكية، المهم لدراسة الفيزيولوجيا المرضية لفقدان خلية مستقبلة للضوء في شبكية العين مرض وتقييم التدخلات العلاجية المحتملة. هنا، ونحن التقرير مثل هذا الأسلوب في التفاصيل.
Abstract
حقن تحت الشبكية من هيالورونات الصوديوم هو طريقة مقبولة على نطاق واسع على إحداث انفصال الشبكية (RD). ومع ذلك، فإن ارتفاع ومدة RD أو حدوث نزيف تحت الشبكية يمكن أن تؤثر على موت الخلايا المستقبلة للضوء في شبكية العين منفصلة. وبالتالي، فإنه من المفيد لخلق ال RDs استنساخه دون نزف تحت الشبكية لتقييم موت الخلايا المستقبلة للضوء. نحن تعديل طريقة ذكرت سابقا لخلق الفقاعي و RDS المستمرة في موقع استنساخه مع نادر الحدوث النزف تحت الشبكية. في خطوة حاسمة من هذه الطريقة تعديل هو خلق شق الصلبة الختم الذاتي، والتي يمكن منع تسرب هيالورونات الصوديوم بعد الحقن في الفضاء تحت الشبكية. لجعل شق الصلبة الختم الذاتي، يتم إنشاء نفق الصلبة، تليها الاختراق الصلبة في المشيمية مع 30 G الإبرة. على الرغم من أن نزف المشيمية قد تحدث خلال هذه الخطوة، قبض مع الرمح الجراحية يقلل من معدل تنحنح المشيميةorrhage. يسمح هذا الأسلوب نموذج أكثر استنساخه وموثوق بها للوفاة مبصرة في الأمراض التي تنطوي على مثل RD RD تشرمي المنشأ، واعتلال الشبكية من الخداج، واعتلال الشبكية السكري، واعتلال المشيمية و الشبكية المصلي المركزي، والضمور البقعي المرتبط بالعمر (AMD).
Introduction
يحدث موت الخلايا المستقبلة للضوء وانخفاض البصرية لاحقا عندما يتم فصل خلايا مستقبلة للضوء في شبكية العين من الأساسي الظهارة الصبغية. وينظر الفصل المادي بين المستقبلات الضوئية في مختلف اضطرابات الشبكية، بما في ذلك الضمور البقعي المرتبط بالعمر (AMD)، اعتلال المشيمية و الشبكية المصلي المركزي، واعتلال الشبكية السكري، واعتلال الشبكية الخداج، وكذلك تشرمي المنشأ (أي الناجم عن انقطاع في شبكية العين) انفصال الشبكية ( RD). حقن تحت الشبكية من هيالورونات الصوديوم هو النموذج المقبول على نطاق واسع لخلق RD الذي يؤدي إلى موت الخلايا المستقبلة للضوء، وتوفير نظرة ثاقبة على الفيزيولوجيا المرضية لمبصرة انحطاط 1-15.
تنكس مبصرة تحت الشبكية الناجم عن حقن هيالورونات الصوديوم، لأول مرة في عام 2001 7، في الاستفادة من دورة زمنية معقولة (أيام إلى أسابيع). ومع ذلك، يمكن أن يكون التباين كبيرا من فقدان خلية مستقبلة للضوء من الحيوان الى أنيمالتر بسبب اثنين من العوامل الرئيسية التي تؤثر على موت الخلايا المستقبلة للضوء بعد RD: 1) ارتفاع ومدة RD، و 2) وقوع نزف تحت الشبكية. هناك منحنى التعلم حاد التقنية إلى طريقة التي تساهم في كل من العوامل. زيادة انحطاط خلية مستقبلة للضوء مع ارتفاع RD، والمسافة بين الصباغ الظهارية في شبكية العين (RPE) وطبقة المستقبلات الضوئية يزيد 16-17. بما يتفق مع هذه التقارير، وأظهرت التجارب السابقة لدينا المزيد من الموت مبصرة في ال RDs الفقاعي من ال RDs الضحلة. وأفيد أيضا أن نزف تحت الشبكية هي سامة للخلايا مستقبلة للضوء ويؤثر موت الخلايا مبصرة 18-21. وبالمثل، لاحظنا المزيد من الموت مبصرة في ال RDs مع نزف تحت الشبكية من ال RDs دون نزف تحت الشبكية. وبالتالي، وتقنيات للحد من التباين لابد من التركيز على تحقيق ارتفاعات ثابت من RD مع تجنب نزيف تحت الشبكية.
لدينا طريقة معدلة من فيducing RD يمكن أن تجعل الفقاعي استنساخه وRD الثابتة على نفس الموقف من العين مع نادر الحدوث النزف تحت الشبكية. أجرينا عملية جراحية باستخدام نهج الزمنية لأنه من الأسهل لتحقيق حقل المنطوق أوسع مقارنة مع المواقع الأخرى. بعد شق الملتحمة، يتم إجراء شق الصلبة الختم الذاتي باستخدام إبرة G 30. يتم إنشاء نفق الصلبة، تليها الاختراق الصلبة في المشيمية. في حالة حدوث نزيف المشيمية في هذه الخطوة، فإن النزف خروج العين من خلال الجرح الصلبة، والنزيف يمكن وقفها من قبل قبض مع الرمح الجراحية. ثم يتم إجراء ثقب الغرفة الأمامية من القرنية لتقليل ضغط العين. هذا هو خطوة مهمة لحقن تحت الشبكية وحدها سوف يؤدي إلى زيادة ضغط العين مع انسداد الشريان الشبكية الناتجة ونقص تروية الشبكية الداخلية. ثم يتم إدخال إبرة G 33 متصلة ميكرولتر حقنة هاميلتون 10 في الفضاء تحت الشبكية، و 3.5 μ؛ يتم حقن ل هيالورونات الصوديوم بلطف لفصل الشبكية العصبي الحسي من RPE الكامنة. وعلى النقيض من الأساليب الأخرى لحمل RD التي يتم تنفيذها تحت الملاحظة قاع، يتم تنفيذ هذه التقنية تحت الملاحظة المباشرة. منذ الجرح الصلبة هو الختم الذاتي، سوف هيالورونات الصوديوم لا يتسرب بعد الحقن. أخيرا، يتم وضع الغراء على الجرح الصلبة، ويتم تثبيتها الملتحمة إلى موقعها الأصلي. هذه الخطوات تستمر أيضا يقلل من خطر تسرب هيالورونات الصوديوم. حقن 3.5 ميكرولتر هيالورونات الصوديوم يخلق ال RDs استنساخه (50٪ من الشبكية) في أعين الفئران عمره 8 أسابيع. خلق الجرح الختم الذاتي هو الخطوة الأكثر أهمية في إجراء تعديل لدينا لأنه يمنع هيالورونات الصوديوم حقن من تسرب من العين، مما يسمح الفقاعي استنساخه و RDS الثابتة.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد تم الإبلاغ عن عدة طرق لإنشاء نموذج RD في عيون القوارض 3-15، 22. معظمهم من استخدام الحقن تحت الشبكية من هيالورونات الصوديوم لأنه هو مادة لزجة تستخدم عادة أثناء الجراحة العين في البشر، وليس أنه يرتبط مع أي سمية العين المعروف 1-15. هيالورونات الصوديوم، بدلا من المعتاد المالحة أو الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)، ويزيد من مدة RD.
الطرق للحقن تحت الشبكية من هيالورونات الصوديوم استخدام أحد النهجين: نهج transvitreal 3-6 أو نهج بطريق الصلبة 7-15. يتم تنفيذ كلتا الطريقتين مع المراقبة من قاع. في النهج transvitreal، هو عرض حاقن تحت الشبكية في تجويف الجسم الزجاجي، يتم إنشاء retinotomy في الشبكية الطرفية، ويتم حقن هيالورونات الصوديوم في الفضاء تحت الشبكية. في هذه الطريقة، يتم إجراء اثنين من الدموع في شبكية العين، مما يزيد من خطر الشبكيةل نزف التي قد تذهب الى الفضاء تحت الشبكية. بالإضافة إلى ذلك، هناك خطر الإصابة العدسة عند إنشاء retinotomy. هناك عدة طرق لتعديل النهج بطريق الصلبة. في معظم هذه الطرق 7-12، بعد تخفيض ضغط العين مع ثقب الغرفة الأمامية، وإبرة G 30 متصلة حقنة مليئة هيالورونات الصوديوم يتم إدراجها مباشرة في الفضاء تحت الشبكية من خلال الملتحمة، الصلبة، المشيمية، وRPE. ثم يتم حقن هيالورونات الصوديوم في الفضاء تحت الشبكية. خطر الشبكية المسيل للدموع وإصابة العدسة باستخدام هذا الأسلوب بطريق الصلبة أقل من أن استخدام النهج transvitreal. ومع ذلك، فإن ثقب المحرز في الصلبة بواسطة إبرة 30 G كبيرة، خصوصا للعيون الماوس، وهيالورونات الصوديوم حقنها في الفضاء تحت الشبكية تسرب بسهولة من العين من خلال الجرح الصلبة. هذا يؤدي إلى انخفاض، RD أقل الثابتة والمتغيرة أكثر موت الخلايا المستقبلة للضوء. وعلاوة على ذلك، في حال حدوث نزيف في المشيميةالخطوة ثقب الصلبة، فإن نزيف تنتشر في الفضاء تحت الشبكية لأن ضغط العين قد انخفض قبل حقن هيالورونات تحت الشبكية.
يمكن أن العديد من العوامل التي تؤثر تأثير RD على الشبكية منفصلة، بما في ذلك نزيف تحت الشبكية وارتفاع واستمرار RD 16-21. خلية مستقبلة للضوء الزيادات الموت مع ارتفاع متزايد من RD 16، 17، وتلف الخلايا المستقبلة للضوء قد تكون أكثر واسعة الانتشار بسبب انخفاض الأكسجين والعناصر الغذائية الأساسية من المشيماء الشعيرية مع ارتفاع RD مقارنة RD الضحلة. نزف تحت الشبكية هي أيضا سامة للخلايا مستقبلة للضوء 18-21؛ الآليات المحتملة لهذا التسمم في انفصال الشبكية وتشمل نقص الأكسجة واضطراب التمثيل الغذائي التي كتبها نزف تحت الشبكية كحاجز نشرها، والعصبية المباشرة الناجمة عن مكونات الدم (مثل الحديد). إصابة العدسة، والتي تم الإبلاغ عن أن يكون لها تأثير وقائي على RETIخلايا العقدة نال 23، قد تؤثر أيضا على موت الخلايا المستقبلة للضوء بعد تحريض RD. بالإضافة إلى ذلك، إذا لم يتم اغلاق موقع الجرح الدخول، هيالورونات الصوديوم قد يتسرب مع التلاعب العين أثناء قلع. هذا قد يؤدي إلى تصنيف خاطئ لRD الضحلة كما، والتي قد تؤثر بدورها على تفسير النتائج.
نحن تعديل طريقة بطريق الصلبة للحقن تحت الشبكية من هيالورونات الصوديوم لزيادة استنساخ المصمم وخفض معدل النزف تحت الشبكية. في خطوة حاسمة من هذا البروتوكول هو خلق شق الصلبة الختم الذاتي باستخدام إبرة G 30، والذي يمنع تسرب هيالورونات الصوديوم بعد الحقن. على عكس الطرق السابقة، يتم تنفيذ هذا البروتوكول من دون مراقبة من قاع بحيث يتم إيلاء اهتمام أكبر على الجرح الصلبة. تطبيق الغراء كما يمنع هيالورونات الصوديوم من تسرب من العين. في تجربتنا، فإن معدل النزف تحت الشبكية مع هذا البروتوكول ثكما أقل بكثير من تلك التي مع البروتوكولات الأخرى. في حالة حدوث نزيف المشيمية خلال الخطوة شق الصلبة، فإنه سيتم الخروج من العين من خلال الجرح الصلبة لأنه يتم تنفيذ هذه الخطوة قبل خفض ضغط العين. إذا نزف المشيمية يحدث بعد تخفيض ضغط العين وانفصال الشبكية العصبي الحسي، وتشريح الدم في الفضاء تحت الشبكية. وجدنا هذا أن يحدث في حوالي 5٪ من الحالات على النقيض من حوالي 10-20٪ مع غيرها من التقنيات. ينبغي استبعاد هذه الحيوانات من التحليل.
ويمكن أيضا أن تستخدم هذه التقنية للحقن تحت الشبكية من بوساطة ناقلات نقل الجينات لاستهداف خلايا مستقبلة للضوء أو RPE 24، 25. لأن السيارة النموذجية (PBS، المالحة) لهذه الحقن بشكل ملحوظ أقل لزوجة من هيالورونات الصوديوم، تعاني التقنيات القياسية بأكثر التسريبات. تقنية الموضحة هنا، عن طريق الحد من هذه المخاطر، ويجعل تجارب نقل ناقلات أكثر استنساخه ويمكن الاعتماد عليها.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر يندي تشاو لدعمها في استعراض نقدي. وأيد هذا العمل من قبل بوش ولومب الشبكية والجسم الزجاجي زمالة (HM)، ومنحة EY014104 المعهد الوطني للعيون (JWM)، بحوث لمنع العمى مؤسسة (DGV)، ليونز صندوق أبحاث العيون (DGV)، والتبرع السخي من عائلة Yeatts (JWM وDGV).
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketaject | Phoenix | 2010025 | |
| AnaSed | LLOYD | 4004821 | |
| 5% Phenylephrine / 0.5% Tropicamide | Massachusetts Eye and Ear Pharmacy | ||
| 0.5% Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution | AKORN | 17478-263-12 | |
| Provics | Alcon | 8065183085 | |
| Webglue | Patterson Veterinary | 07-8566128 | |
| Microscope | Leica | MG90 | |
| 30G1/2 PrecisionGlide Needle | BD | 305106 | |
| Weck-Cel Eye Spears | Beaver-Visitec | 0008685 | |
| 10 Microliter Syringe | Hamilton | 7635-01 | |
| 33 gauge, 0.5 inch needle | Hamilton | 7803-05 | |
| 18x18mm Cover Glass | Fisher Scientific | 18-548A |
References
- Anderson, D. H., Guerin, C. J., Erickson, P. A., Stern, W. H., Fisher, S. K. Morphological recovery in the reattached retina. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 27, 168-183 (1986).
- Cook, B., Lewis, G. P., Fisher, S. K., Adler, R. Apoptotic photoreceptor degeneration in experimental retinal detachment. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 36, 990-996 (1995).
- Zacks, D. N., et al. Caspase Activation in an Experimental Model of Retinal Detachment. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 44, 1262-1267 (2003).
- Zacks, D. N., Han, Y., Zeng, Y., Swaroop, A. Activation of Signaling Pathways and Stress-Response Genes in an Experimental Model of Retinal Detachment. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 47, 1691-1695 (2006).
- Nakazawa, T., et al. Characterization of cytokine responses to retinal detachment in rats. Mol. Vis. 12, 867-878 (2006).
- Nakazawa, T., et al. Tumor Necrosis Factor-Mediates Photoreceptor Death in a Rodent Model of Retinal Detachment. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 1384-1391 (2011).
- Hisatomi, T., et al. Relocalization of apoptosis-inducing factor in photoreceptor apoptosis induced by retinal detachment in vivo. Am. J. Pathol. 158, 1271-1278 (2001).
- Hisatomi, T., et al. Critical role of photoreceptor apoptosis in functional damage after retinal detachment. Curr. Eye Res. 24, 161-172 (2002).
- Nakazawa, T., et al. Monocyte chemoattractant protein 1 mediates retinal detachment-induced photoreceptor apoptosis. Proc. Natl. Acad. Sci. 104, 2425-2430 (2007).
- Trichonas, G., et al. Receptor interacting protein kinases mediate retinal detachment-induced photoreceptor necrosis and compensate for inhibition of apoptosis. Proc. Natl. Acad. Sci. 107, 21695-21700 (2010).
- Roh, M. I., Murakami, Y., Thanos, A., Vavvas, D. G., Miller, J. W. Edaravone, an ROS Scavenger, Ameliorates Photoreceptor Cell Death after Experimental Retinal Detachment. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 3825-3831 (2011).
- Mantopoulos, D., et al. Tauroursodeoxycholic acid (TUDCA) protects photoreceptors from cell death after experimental retinal detachment. PLoS One. 6, e24245 (2011).
- Yang, L., Bula, D., Arroyo, J. G., Chen, D. F. Preventing retinal detachment-associated photoreceptor cell loss in Bax-deficient mice. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 45, 648-654 (2004).
- Cebulla, C. M., Ruggeri, M., Murray, T. G., Feuer, W. J., Hernandez, E. Spectral domain optical coherence tomography in a murine retinal detachment model. Exp. Eye Res. 90, 521-527 (2010).
- Secondi, R., Kong, J., Blonska, A. M., Staurenghi, G., Sparrow, J. R. Fundus Autofluorescence Findings in a Mouse Model of Retinal Detachment. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 53, 5190-5197 (2012).
- Machemer, R. Experimental retinal detachment in the owl monkey. IV. The reattached retina. Am. J. Ophthalmol. 66, 1075-1091 (1968).
- Ross, W., Lavina, A., Russell, M., Maberley, D. The correlation between height of macular detachment and visual outcome in macula-off retinal detachments of < or = 7 days’ duration. Ophthalmology. 112, 1213-1217 (2005).
- Glatt, H., Machemer, R. Experimental subretinal hemorrhage in rabbits. Am. J. Ophthalmol. 94, 762-773 (1982).
- Toth, C. A., Morse, L. S., Hjelmeland, L. M., Landers, M. B. Fibrin directs early retinal damage after experimental subretinal hemorrhage. Arch. Ophthalmol. 109, 723-729 (1991).
- Benner, J. D., Hay, A., Landers, M. B., Hjelmeland, L. M., Morse, L. S. Fibrinolytic-assisted removal of experimental subretinal hemorrhage within 7 days reduces outer retinal degeneration. Ophthalmology. , 101-672 (1994).
- Bhisitkul, R. B., et al. Neuroprotective effect of intravitreal triamcinolone acetonide against photoreceptor apoptosis in a rabbit model of subretinal hemorrhage. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 49, 4071-4077 (2008).
- Zeng, R., Zhang, Y., Shi, F., Kong, F. A Novel Experimental Mouse Model of Retinal Detachment: Complete Functional and Histologic Recovery of the Retina. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 53, 1685-1695 (2012).
- Leon, S., Yin, Y., Nguyen, J., Irwin, N., Benowitz, L. I. Lens injury stimulates axon regeneration in the mature rat optic nerve. J. Neurosci. 20, 4615-4626 (2000).
- Murakami, Y., et al. Inhibition of choroidal neovascularization via brief subretinal exposure to a newly developed lentiviral vector pseudotyped with Sendai viral envelope proteins. Hum. Gene Ther. 21, 199-209 (2010).
- Kong, F., et al. Self-complementary AAV5 vector facilitates quicker transgene expression in photoreceptor and retinal pigment epithelial cells of normal mouse. Exp. Eye Res. 90, 546-554 (2010).
