Patch Clamp Las grabaciones de las células embrionarias de pez cebra Mauthner
Summary
Hemos desarrollado una preparación espinal cerebral espinal intacta para registrar y monitorear la actividad eléctrica a través de la grabación de patch clamp de las neuronas y otras células de Mauthner reticulospinal en embriones de pez cebra. Por lo tanto, somos capaces de registrar las corrientes sinápticas excitatorias e inhibitorias, la actividad del canal dependiente de voltaje y los potenciales de acción de las neuronas clave en un embrión en desarrollo.
Abstract
Células de Mauthner (células M) son grandes neuronas reticulospinal ubicados en la parte posterior del cerebro de los peces teleósteos. Son neuronas clave que participan en un comportamiento característico conocido como la respuesta C-iniciar o escapar que se produce cuando el organismo percibe una amenaza. La célula M ha sido ampliamente estudiado en peces de colores adulto donde se ha demostrado para recibir una amplia gama de excitador, señales inhibitorias y neuromoduladores 1. Hemos estado examinando la actividad de las células M en embriones de pez cebra para el estudio de los aspectos del desarrollo sináptico en una preparación de los vertebrados. A finales de 1990, Ali y sus colegas desarrollaron una preparación para patch clamp grabación desde M-células en embriones de pez cebra, en el que el SNC era 2,3,4 gran parte intacto. El objetivo en ese momento era para registrar la actividad sináptica de las neuronas del cerebro posterior, las neuronas de la médula espinal y el músculo esquelético del tronco, manteniendo las conexiones sinápticas funcionales dentro de una preparación espinal cerebral espinal intacta.Esta preparación se sigue utilizando en nuestro laboratorio hoy. Para examinar los mecanismos subyacentes a la plasticidad sináptica en el desarrollo, registramos excitatorio (mediada por NMDA y AMPA) 5,6 e inhibitorios (GABA y glicina) corrientes sinápticas de desarrollo de células-M. Es importante destacar que esta preparación única nos permite volver a la misma célula (células M) a partir de una preparación a examinar cuidadosamente la plasticidad sináptica y la neuro-desarrollo en un organismo embrionario. Los beneficios proporcionados por esta preparación incluyen 1) intacta, conexiones sinápticas funcionales en la célula M, 2) las preparaciones relativamente baratos, 3) una gran cantidad de embriones fácilmente disponibles 4) la capacidad para volver a la mismo tipo de célula (es decir, M- de células) en cada preparación, por lo que el desarrollo sináptica en el nivel de una célula individual puede ser examinado a partir de pescado para los peces, y 5) de formación de imágenes de las preparaciones de enteros debido a la naturaleza transparente de los embriones.
Introduction
Una de las cuestiones pendientes en la neurobiología del desarrollo se refiere al papel de los fenómenos de plasticidad sináptica durante la maduración sináptica. Nuestra investigación se centra en la comprensión de los mecanismos de plasticidad sináptica que subyacen en el desarrollo con un objetivo general de la comprensión del comportamiento de los animales en el contexto del desarrollo sináptico. Para ello, hemos desarrollado una preparación en gran parte intacto en un organismo (el pez cebra, Danio rerio), que ha alcanzado mucha tracción para estudios de desarrollo a finales de 1990.
El pez cebra ofrece varias ventajas para los estudios del desarrollo neurológico. Por ejemplo, su genoma es secuenciado y se puede llevar a cabo derribos morfolino y knockouts nucleasa dedo de zinc para silenciar la actividad de genes y expresión de proteínas. También se pueden realizar estudios de sobreexpresión y líneas transgénicas se pueden construir 7-9. Los embriones son relativamente fácil y abundante para adquirir yla naturaleza transparente del embrión se presta bien a la formación de imágenes y estudios opto-genética. Además, el análisis del comportamiento puede llevar a cabo, y los experimentos electrofisiológicos se puede realizar en las fibras musculares, las neuronas de la médula espinal y las neuronas del cerebro posterior en los organismos en gran parte intactas, permitiendo uno para examinar la función celular in vivo. Es importante destacar que estamos en condiciones de examinar la actividad sináptica en no sólo el mismo tipo de célula, pero en el mismo par de neuronas, desde la preparación hasta la preparación. En otras palabras, esta es una de las preparaciones de vertebrados raros en los que se puede volver a la misma neurona, in situ, para estudiar su desarrollo.
A fin de mantener los circuitos neuronales tan viable como sea posible, hemos desarrollado una preparación en la que la parte posterior del cerebro y la médula espinal se dejaron intactos, mientras que el parche de sujeción de las células-M. En esta preparación, los ojos, la mandíbula y la piel que recubre la cerebro se eliminan con suavidad y la parte posterior del cerebro es peeled lejos de la notocorda, permitiendo el acceso a la superficie ventral del cerebro posterior. Las neuronas reticulospinal se encuentran unos pocos micrómetros de profundidad y son relativamente de fácil acceso. En 48 h después de la fecundación (HPF; algunas abreviaturas se listan en la Tabla 1) las células son eléctricamente compacto y una fidelidad puede registrar la actividad sináptica (tanto excitatorios e inhibitorios corrientes), las corrientes de voltaje y los potenciales de acción de los mismos.
Nuestros hallazgos sugieren que se producen muchos aspectos del desarrollo y la maduración sináptica en el 24 horas antes de la eclosión, y por lo tanto gran parte de nuestra atención se centra en los organismos de edades comprendidas entre 24 a 72 HPF HPF. Sin embargo, por 72 HPF, células M son menos compacto eléctricamente y son difíciles de abrazadera adecuadamente espacio. La técnica se puede utilizar para grabar no sólo de las células M, sino también de sus homólogos, MID2 cm y MiD3 cm. En teoría, también se puede realizar grabaciones dobles, de un spneurona espinal inal como una neurona motora primaria y de la de las células M, pero esto es difícil y se podría argumentar que los beneficios que se obtienen a partir de una técnica tan difícil puede no valer la pena el esfuerzo extraordinario que se requiere.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo descrito anteriormente permite al parche de registro de sujeción de las células M y sus homólogos. La técnica es difícil y se debe tener cuidado en varias áreas clave durante todo el procedimiento. Ahora vamos a discutir algunas de estas áreas y ofrecerá consejos útiles para asegurar el éxito.
La construcción de la cámara de disección / grabación es un aspecto crítico del experimento. Las células M son difíciles de ver a menos que se utiliza contraste de interferencia diferencial. DIC Nomarski funciona mejor con cubreobjetos de vidrio limpio, pero hemos encontrado que una capa muy delgada de Sylgard (~ 1-2 mm) no distorsionar la CID en una medida tal que interfiere con la identificación de las células M. Por lo tanto, usamos una cámara de grabación que tiene un cubreobjetos de vidrio delgada en la parte inferior sobre la que se coloca una pequeña arandela de plástico (~ 5 mm de diámetro). Mezclamos Sylgard 184 en una placa de Petri y añadimos con cuidado el Sylgard líquido al interior de la lavadora con una pipeta Pasteur. El Sylgard se puede curar a temperatura ambiente durante un par de días o puede ser calentada por un curado rápido. La arandela puede ser retirado después de la Sylgard ha curado, aunque esto no es necesario. Una vez que la cámara de disección / grabación ha sido hecha, que puede ser utilizado por varias semanas antes de que se necesitaba un portaobjetos de vidrio Sylgard forrado fresco.
El siguiente paso en el procedimiento es para compensar todas las soluciones pertinentes en el día del experimento (Tabla 3). Soluciones intracelulares que contienen todo menos ATP y GTP se hacen por adelantado y se almacenan en 5 ml alícuotas a -20 ° C. En el día de la grabación de una parte alícuota se descongela a temperatura ambiente y ATP fresco y se añade GTP. La solución se ajusta a 280 mOsm y pH 7,4. En nuestras manos, nos encontramos con que la adición de ATP fresco y GTP en un diario los resultados básicos en buenas grabaciones. Todas las soluciones deben mantenerse estériles para tener mejores posibilidades de éxito.
Soluciones intracelulares deben filtrarse througja 0,22 micras filtro (Sigma) para eliminar las pequeñas partículas y desechos que puedan afectar a la grabación. Para ello, primero elaboramos la solución intracelular en una jeringa de 1 ml, colocar el filtro en el extremo de la jeringa y añadimos una punta de pipeta de plástico que se calentó y sacó a punta fina, en el extremo del filtro. Esto nos permite aplicar la solución intracelular filtrada directamente al interior de las pipetas de parche de cristal.
Una vez que las soluciones se preparan, el embrión puede ser anestesiado y se diseca. Antes de la disección, se debe tener cuidado para evaluar adecuadamente la edad del organismo. Cada embrión dentro de las edades de embrague a un ritmo ligeramente diferente. Por lo tanto, cuando la evaluación de la edad del organismo es importante hacerlo de acuerdo con los procedimientos establecidos 10,13, mediante el uso de señales fenotípicas tales como el número de somitas, la forma general del cuerpo y el momento de la fertilización del óvulo. Todas las disecciones se llevan a cabo con un Dumont # 5 fino par defórceps. Estos necesitan ser afiladas y en buenas condiciones de trabajo de lo contrario será muy difícil de quitar la piel que recubre la parte posterior del cerebro y cualquier tejido conectivo en la superficie ventral del cerebro posterior. A menudo tenemos que afilar las pinzas después de unas semanas de uso, y hacer esto a nosotros mismos con una piedra de afilar.
Para fijar el pescado a la fina capa de Sylgard, utilizamos los pins formadas de alambre de tungsteno fino 0.001 pulgadas de diámetro. Las clavijas se cortan con un viejo, tijeras micro-disección bajo un microscopio de disección, y son lo suficientemente pequeños para caber a la derecha a través de la notocorda. Fijación de los embriones en cualquier otro punto no inmoviliza ellos y hace disecciones casi imposible de realizar. Cuando primero aprender a realizar las grabaciones, puede ser difícil para la identidad de las células M de sus homólogos (particularmente MID2 cm que se encuentra en el rombómero vecina – rombómero 5). En algunos embriones estos dos pares de células parecen similares en tamaño. El pro otolitoscionar un hito conveniente para ayudar en la identificación de células-M. A las 48 HPF las células M se encuentran justo al lado de los otolitos, ya pesar de que los otolitos se quitan durante la disección, se van detrás de una región lateral ligeramente dañada del cerebro posterior, que sirve como marcador de su posición original. Los peces transgénicos que expresan la GFP o algún otro marcador fluorescente en la célula M, proporcionan excelentes preparativos para nuevos experimentadores. En nuestras manos las células M tienen una capacitancia de la membrana de aproximadamente 18 a 24 pF a las 48 HPF, mientras que los homólogos más pequeños están más cerca de 12 a 14 pF. Las células con una mayor área de superficie tienen mayores valores de capacitancia de membrana (medidos en picofaradios (pF)) en comparación con las células más pequeñas. Por lo tanto, capacitancia de la membrana se puede utilizar como un indicador aproximado del tamaño de la célula, donde las células más grandes tienen valores de capacidad más grandes. Esta característica electrofisiológico sirve como otra propiedad por la que la célula M puede ser identificado a partir de sus homólogos. Por último, a menudo utilizamos Lucifer amarillo en nuestra grabación de soluciones (intracelulares), que nos permite realizar una identificación de la empresa del tipo de células bajo investigación el uso de imágenes de fluorescencia una vez que las grabaciones estén completas.
Resistencias punta de la pipeta en el rango de 3.5 a 4.5 MΩ son el mejor compromiso entre el tamaño de la punta y la resistencia a la baja de acceso, que suele oscilar entre 8 y 15 MΩ. Esto es particularmente importante para los eventos con cinética rápida; ~ 0,1 mseg (20-80%) tiempos de subida y ~ 0.5 exponencial mseg decae 12,14,15 (Figuras 3A y 3B). Los datos se adquieren a una tasa de digitalización de 50 a 100 kHz y se filtra con una frecuencia de paso bajo de 5 a 10 KHz. Con respecto a las pipetas de parche, hemos encontrado que no necesitan ser para obtener una grabación pulida al fuego, pero anecdóticamente, que parece ofrecer ligeramente mejor oportunidad de obtener buenas juntas en comparación con pipetas sin pulir. Dado que las puntas de las pipetas son relativamente grandes, no añadimos versióny presión mucho más positiva a la pipeta antes de entrar en la solución. Se necesita práctica decidir sobre la cantidad apropiada de presión positiva a aplicar como un exceso de presión se moverá la celda demasiado, y prevenir la formación de sello. También puede dañar los contactos sinápticos que la celda se desplaza suavemente desde su posición original. Por otro lado, muy pocos resultados de la presión en puntas sucias y no limpia la superficie de la célula lo suficientemente bien como para formar buenos sellos. Un término medio sólo se logra mediante la práctica y la experiencia significativa. La formación del sello puede ser mejorado con aplicaciones de voltajes negativos a la pipeta. Normalmente tenemos sellos de 1.2-2 GΩ, que son excelentes para los avances en todo el modo de célula.
Cuando los agentes farmacológicos necesitan ser aplicados a la citoplasma de la célula, los incluimos en la solución intracelular antes de llenar la pipeta. Se debe tener cuidado cuando se preparan las soluciones de pipeta para evitar la pérdida de los agentespor tener que se unen al filtro de 0,22 micras. Por lo tanto, vamos a filtrar el medio intracelular primero, y luego añadimos con cuidado el agente farmacológico para la solución filtrada. Aplicación de compuestos para el compartimento intracelular tiene su propio conjunto único de desafíos. Por ejemplo, la adición de medicamentos para el medio intracelular generalmente reduce las posibilidades de formación de un sello GΩ, pero no hasta el punto en que es un obstáculo importante para el experimento.
Uno debe darse cuenta de que la aplicación de agentes farmacológicos de esta manera no permite el experimentador para grabar el control más apropiado, ya que el agente tiene acceso inmediato a la célula desde el inicio de la configuración de células enteras. Por lo tanto, mientras grabamos los datos a través de este tipo de experimento, uno debe ser consciente de que el siguiente mejor control es la aplicación intracelular de una forma inactiva del agente. En muchos casos esto toma la forma de un compuesto inactivado por calor, un péptido o revueltosr un isómero inactivo obtenido del proveedor.
Adquirimos datos en la forma de las corrientes sinápticas (mPSCs), las corrientes de voltaje y los potenciales de acción. Corrientes en miniatura se pueden analizar por unos excelentes programas (pCLAMP, AxoGraph, etc), aunque preferimos utilizar AxoGraph X (John Clements). AxoGraph X se ejecuta en las plataformas Windows y Macintosh y se puede utilizar tanto para la adquisición y análisis de datos electrofisiológicos. mEPCs se adquieren con la ayuda de una plantilla de elección del experimentador, obtenido a partir de la grabación en sí. Las pruebas individuales se pueden analizar para propiedades tales como tiempo de subida, la amplitud, la mitad de la anchura y la decadencia del tiempo, etc Exportamos la hoja de cálculo de datos para Kaleidagraf (Synergy Software), donde podemos producir figuras, incluyendo copias de los seguimientos de sucesos de AxoGraph X.
Uno de los aspectos más difíciles de la experimento es determinar si la grabación se llevó a cabo lo suficientemente bien como para proporcionar limpio,datos fiables. Por ejemplo, los problemas de espacio de sujeción pueden surgir cuando se graba mPSCs de células M que tienen grandes axones y extensos procesos dendríticas. Cuando fijación de tensión, generalmente se puede controlar el voltaje en la punta de la pipeta razonablemente bien (especialmente si la resistencia de acceso (Ra) es baja), pero pueden no tener un control adecuado del potencial de membrana en procesos dendríticos o axones que están lejos lejos de la punta de la pipeta. Un método para determinar si la célula estaba debidamente sujeta espacio es para producir un gráfico de dispersión del tiempo de subida vs la amplitud de las mPSCs que se grabaron. Una correlación entre los datos es sugerente de insuficiente espacio de sujeción. En otras palabras, si la abrazadera de espacio es pobre, entonces mPSCs que se producen cerca de la pipeta se tienen tiempos de subida más rápido y amplitudes mayores que los eventos que ocurren a cierta distancia de la pipeta. Si no existe una correlación, entonces los datos es problemático y no se puede utilizar.
Otro aspectode registros electrofisiológicos que es necesario abordar es el de las corrientes de fuga. Esto es especialmente cierto cuando el voltaje de una célula de sujeción con el fin de registrar las corrientes de voltaje tales como Na + o K + corrientes. Cuando el potencial de membrana se desvió del resto, las corrientes de fuga se pueden grabar junto con la actividad dependiente de voltaje. Corrientes de fuga (I L), una combinación de potasio (I K), sodio (I Na) y cloruro de (I Cl) corriente a través de los canales que no son dependientes de voltaje se oscurecer la actividad de interés y deben restarse de la grabación. El amplificador es capaz de realizar esta función en línea durante la grabación mediante la ejecución de lo que se suele llamar un protocolo P / N. Durante un protocolo P / N del amplificador se ejecutará varias despolarizaciones pequeños (o hyperpolarizations) desde el reposo y registrará la corriente de fuga resultante que se produce. Es importante la utilización de pequeños impulsos suficientes que no activan los canales dependientes de voltaje. El actuals que se producen durante estos impulsos se registran y se promedia para que estas corrientes de fuga pueden ser sustraídos de la actividad de los canales dependientes de voltaje.
Por último, hay que tener en cuenta el potencial de unión, que se produce en la punta del electrodo entre el intracelular y soluciones extracelulares. Soluciones intracelulares y extracelulares se componen típicamente de diferentes iones, con diferentes actividades y movilidades. Iones más grandes con movilidades inferiores ofrecerá una mayor resistividad al movimiento de iones que los más pequeños y esto puede resultar en una pequeña pero significativa diferencia de potencial en la unión de las soluciones. Este potencial de unión debe tenerse en cuenta al determinar los voltajes apropiados experimentado por la célula.
La técnica presentada aquí es uno utilizado por nuestro laboratorio durante muchos años. Sin embargo, hay métodos alternativos para la grabación de la célula M. Más notablemente, Joseph Fletcho y sus colegas han desarrollared una excelente preparación en la que se puede grabar desde las células M de las larvas mayores (4-5 días) de una manera menos invasiva que se presenta aquí, donde la célula M se aborda desde la superficie dorsal 16. Se ha intentado una técnica similar pero encontrado que es más fácil para acercarse a la de las células M de la parte ventral del cerebro posterior, donde la célula está más cerca de la superficie del cerebro, en particular en los peces jóvenes (es decir, 24 a 72 HPF HPF). Además, un enfoque de la superficie dorsal por lo general requiere el uso de una línea transgénica que expresa una etiqueta fluorescente en la célula M, que tiene el potencial de introducir variables adicionales en la grabación. Este problema no está presente cuando se utiliza el tipo de pescado salvaje. Sin embargo, con la técnica que aquí se presenta, estamos limitados a estudiar los animales más jóvenes (24 a 72 HPF HPF). Así, cada método tiene sus ventajas y limitaciones.
Prueba t de Student se puede usar para comparar dos grupos de datos, mientras que un análisis de VarianCe (ANOVA) se puede utilizar para comparar varios grupos. Se debe tener cuidado al elegir el test post-hoc apropiado para paramétrica vs datos no paramétricos.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por becas de Ciencias Naturales e Ingeniería de Investigación de Canadá (NSERC) y la Fundación Canadiense para la Innovación (CFI) para DWA.
Materials
| Equipment Name | Company | Catalogue Number |
| Dissecting Dish | Warner Instruments | 64-0291 |
| 0.001″ Tungsten Wire | Scientific Instruments Services Inc. | W406 |
| Dissecting microscope | Leica Microsystems | MZ9.5 |
| Pipette Puller | Sutter Instruments Co. | P-97 |
| Microforge | Narishige Group | MF-900 |
| Upright Patch clamp microscope | Leica Microsystems | DMLFSA |
| Micromanipulator | Siskiyou Inc. | MX7500 |
| Digidata | Molecular Devices | 1322A |
| Amplifier | Molecular Devices | 200B |
| Acquisition software | Molecular Devices | pClamp9 |
| Axograph X | Axograph | Axograph X |
References
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