Patch-clamp enregistrements de cellules embryonnaires de poisson zèbre Mauthner

Le protocole décrit ci-dessus permet de patcher dossier de serrage des cellules M et ses homologues. La technique est difficile et il faut prendre soin dans plusieurs domaines clés tout au long de la procédure. Nous allons maintenant discuter de certains de ces domaines et offrira des conseils utiles pour assurer le succès.

La construction de la chambre de dissection / d'enregistrement est un aspect critique de l'expérience. Les cellules M sont difficiles à voir, sauf si le contraste d'interférence différentiel est utilisé. DIC Nomarski fonctionne mieux avec des lamelles de verre propre, mais nous avons trouvé qu'une très fine couche de Sylgard (~ 1-2 mm) ne sera pas fausser le DIC à un point tel que cela interfère avec l'identification des cellules M. Par conséquent, on utilise une chambre d'enregistrement qui a une mince lamelle de verre sur la partie inférieure sur laquelle est placée une petite rondelle de plastique (~ de 5 mm de diamètre). Nous mélangeons Sylgard 184 dans une boîte de Pétri et ajoute soigneusement le Sylgard de liquide à l'intérieur de la rondelle avec une pipette Pasteur. Le Sylgard peut être durcie à la température ambiante pendant quelques jours, ou peut être chauffé pour un durcissement rapide. La rondelle peut être éliminé après la Sylgard a durci, même si cela n'est pas nécessaire. Une fois la chambre dissection / enregistrement a été fait, il peut être utilisé pendant plusieurs semaines avant une lame de verre de Sylgard bordée frais est nécessaire.

L'étape suivante de la procédure consiste à compenser toutes les solutions pertinentes sur le jour de l'expérience (tableau 3). Solutions intracellulaires contenant tout, mais l'ATP et GTP sont faites à l'avance et stockées dans 5 ml aliquotes à -20 ° C. Le jour de l'enregistrement d'un aliquot est décongelé à température ambiante et de l'ATP frais et GTP est ajouté. La solution est ajusté à 280 mOsm et pH 7,4. Dans nos mains, nous constatons que plus d'ATP et GTP frais sur un résultat de base par jour dans de bons enregistrements. Toutes les solutions doivent être conservés stérile pour la meilleure chance de succès.

Solutions intracellulaires doivent être filtrés Througha 0,22 um filtre (Sigma) pour éliminer les petites particules et de débris qui pourraient affecter l'enregistrement. Pour ce faire, nous attirons d'abord la solution intracellulaire dans une seringue de 1 ml, apposer le filtre à l'extrémité de la seringue et ajouter une pointe de pipette en plastique qui a été chauffé et tiré à pointe fine, à la fin du filtre. Cela nous permet d'appliquer la solution intracellulaire filtrée directement à l'intérieur des pipettes de patch de verre.

Une fois que les solutions sont préparées, l'embryon peut être anesthésiés et disséqués. Avant la dissection, il faut prendre soin de bien évaluer l'âge de l'organisme. Chaque embryon dans un âge d'embrayage à un rythme légèrement différent. Par conséquent, lors de l'évaluation de l'âge de l'organisme, il est important de le faire selon les procédures établies ^10,13, à l'aide de signaux phénotypiques tels que le nombre de somites, la forme globale du corps et le moment de la fécondation de l'œuf. Tous les dissections sont réalisées avec un # 5 belle paire de Dumontforceps. Celles-ci doivent être forte et en bonne condition de travail sinon il sera très difficile d'enlever la peau recouvrant le cerveau postérieur et tout le tissu conjonctif sur la face ventrale du cerveau postérieur. Nous avons souvent pour aiguiser les pinces après quelques semaines d'utilisation, et le faire nous-mêmes avec une pierre à aiguiser.

Pour épingler le poisson à la mince couche de Sylgard, nous utilisons les repères fabriqués à partir de fil fin de tungstène 0,001 pouces de diamètre. Les broches sont coupés avec un vieux, ciseaux micro-dissection au microscope de dissection, et sont suffisamment petits pour tenir tout au long de la notochorde. Épingler les embryons à un autre point ne les immobiliser et ne fait dissections presque impossible à réaliser. Lors de l'apprentissage d'abord pour effectuer les enregistrements, il peut être difficile pour l'identité de la M-cellulaire de ses homologues (notamment MID2 cm, qui est situé dans le rhombomère voisin – rhombomère 5). Dans certains embryons ces deux paires de cellules apparaissent de taille similaire. Le otolithes proVide un point de repère idéal pour aider à l'identification des cellules M. À 48 HPF les cellules M sont situés juste à côté des otolithes, et même si les otolithes sont supprimés lors de la dissection, ils laissent derrière eux une région latérale légèrement endommagé du cerveau postérieur, qui sert de marqueur pour leur position d'origine. Les poissons transgéniques qui expriment la GFP ou un autre marqueur fluorescent dans le M-cellule, offrent d'excellentes préparations pour les nouveaux expérimentateurs. Dans nos mains les cellules M ont une capacité de membrane d'environ 18-24 pF à 48 HPF, tandis que les plus homologues sont plus proches de 12-14 pF. Les cellules avec une plus grande aire de surface ont de plus grandes valeurs de capacité de la membrane (mesurée en pico farads (PF)) par rapport à des cellules plus petites. Ainsi, la capacité de la membrane peut être utilisée comme indicateur brut de la taille des cellules, où des cellules plus grandes ont des valeurs de capacitance plus larges. Cette caractéristique électrophysiologique sert une autre propriété par laquelle le M-cellule peut être identifié à partir de ses homologues. Enfin, nous utilisons souvent Lucifer jaune dans notre enregistrement (intracellulaires) des solutions, ce qui nous permet de procéder à une identification entreprise du type cellulaire à l'étude utilisant l'imagerie par fluorescence une fois les enregistrements sont complets.

résistances de pointe de la pipette dans la gamme de 3,5-4,5 MQ sont le meilleur compromis entre la taille de la pointe et faible résistance d'accès, qui varie généralement de 8 à 15 MQ. Ceci est particulièrement important pour les événements avec une cinétique rapide; ~ 0,1 ms (20-80%) temps de montée et ~ 0,5 ms exponentielle désintégrations ^12,14,15 (figures 3A et 3B). Les données sont acquises à une vitesse de 50 à 100 kHz de la numérisation et filtré avec un passe-bas de fréquence de 5 à 10 KHz. En ce qui concerne les pipettes de patch, nous avons constaté qu'ils n'ont pas besoin d'être d'obtenir un enregistrement poli-le-feu, mais de façon anecdotique, il semble offrir un peu plus de chances d'obtenir de bons joints rapport avec des pipettes non polis. Depuis les embouts de pipette sont relativement grandes, nous n'ajoutons pas very pression beaucoup de positif à la pipette avant d'entrer dans la solution. Il faut de la pratique de décider de la quantité appropriée de pression positive à appliquer comme un excès de pression se déplace la cellule trop, et éviter la formation de joint. Il peut également endommager les contacts synaptiques que la cellule est déplacée doucement de sa position d'origine. D'autre part, trop peu de résultats de pression dans des conseils sales et ne pas nettoyer la surface de la cellule assez bien pour former de bons joints. Un juste milieu n'est atteinte par la pratique et une expérience significative. la formation de joint peut être améliorée avec des applications de tensions négatives à la pipette. Nous avons généralement des joints de 1.2-2 GQ, qui sont excellents pour les percées dans le mode de cellules entières.

Lorsque des agents pharmacologiques doivent être appliqués dans le cytoplasme des cellules, on les inclure dans la solution intracellulaire avant le remplissage de la pipette. Des précautions doivent être prises lors de la préparation des solutions de pipette pour éviter la perte des agentsen le faisant se lier au filtre de 0,22 um. Par conséquent, nous filtrons le milieu intracellulaire d'abord, puis ajoute soigneusement l'agent pharmacologique à la solution filtrée. Application des composés vers le compartiment intracellulaire a son propre ensemble unique de défis. Par exemple, l'addition de la drogue dans le milieu intracellulaire réduit habituellement les chances de former un joint de GQ, mais pas au point où il est un obstacle majeur à l'expérience.

On devrait se rendre compte que l'application d'agents pharmacologiques de cette façon ne permet pas à l'expérimentateur d'enregistrer le contrôle le plus approprié étant donné que l'agent a un accès immédiat à la cellule à partir du début de la configuration de cellules entières. Par conséquent, alors que nous enregistrons des données tout au long de ce type d'expérience, il faut être conscient que la meilleure commande est l'application intracellulaire d'une forme inactive de l'agent. Dans de nombreux cas, cela prend la forme d'un composé inactivé par la chaleur, un peptide brouillé or un isomère inactif obtenu auprès du fournisseur.

Nous acquérons des données sous la forme de courants synaptiques (de mPSC), les courants de voltage-dépendants et des potentiels d'action. Courants miniatures peuvent être analysés par quelques excellents programmes (pClamp, Axograph, etc), bien que nous préférons utiliser Axograph X (John Clements). Axograph X fonctionne sur les plates-formes Windows et Macintosh et peut être utilisé à la fois pour l'acquisition et l'analyse des données électrophysiologiques. mEPCs sont acquises à l'aide d'un modèle de choix de l'expérimentateur, obtenu à partir de l'enregistrement lui-même. Événements individuels peuvent être analysés pour des propriétés telles que le temps de montée, amplitude, demi-largeur et le temps de descente, etc Nous exportons la feuille de calcul des données de Kaleidagraph (Synergy Software) où nous pouvons produire des chiffres, y compris les copies de traces d'événements de Axograph X.

Un des aspects les plus difficiles de l'expérience est de déterminer si l'enregistrement a été effectué assez bien pour fournir une énergie propre,données fiables. Par exemple, les questions de serrage spatiales peuvent survenir lors de l'enregistrement mPSC de cellules M qui ont de grandes axones et de vastes processus dendritiques. Lorsque la tension de serrage, on peut généralement contrôler la tension au niveau de la pointe de la pipette raisonnablement bien (surtout si la résistance d'accès _{(R a)} est faible), mais peuvent ne pas avoir le contrôle approprié du potentiel de membrane dans les procédés dendritiques ou des axones qui sont beaucoup l'écart de la pointe de pipette. Une méthode de déterminer si la cellule était bien serrée espace est de produire un diagramme de dispersion des temps de montée vs l'amplitude des mPSC qui ont été enregistrés. Une corrélation entre les données est suggestive de serrage insuffisant de l'espace. En d'autres termes, si la pince de l'espace est pauvre alors mPSC qui se produisent près de la pipette devront rapidement s'élever temps et des amplitudes plus importantes que les événements survenus à une certaine distance de la pipette. S'il existe une corrélation, puis les données est problématique et ne peut pas être utilisé.

Un autre aspectdes enregistrements électrophysiologiques qui doit être abordée est celle des courants de fuite. Cela est particulièrement vrai lorsque la tension de serrage dans une cellule afin d'enregistrer les courants de voltage-dépendants, tels que Na ⁺ ou K ⁺ des courants. Lorsque le potentiel de membrane est écartée de repos, les courants de fuite peuvent être enregistrées en même temps que l'activité de voltage-dépendant. courants de fuite (I _L), une combinaison de potassium (I _K), sodium (I _Na) et chlorure (I _Cl) courant à travers-non voltage-dépendants canaux seront occulter l'activité d'intérêt et doivent être soustraites de l'enregistrement. L'amplificateur est capable de remplir cette fonction en ligne lors de l'enregistrement en exécutant ce qui est généralement appelé un protocole P / N. Pendant un protocole P / N, l'amplificateur de fonctionner plusieurs petites dépolarisations (ou hyperpolarisations) de repos et enregistrer le courant de fuite qui se produit résultant. Il est important d'utiliser suffisamment petites impulsions qui n'activent pas les canaux voltage-dépendants. Le courants qui se produisent au cours de ces impulsions sont enregistrées et calculées de telle façon que ces courants de fuite peuvent être soustraites de l'activité des canaux voltage-dépendants.

Enfin, il faut tenir compte du potentiel de jonction, qui se produit à la pointe de l'électrode entre le intracellulaires et extracellulaires solutions. Solutions intracellulaires et extracellulaires sont typiquement composés d'ions différents, avec des activités et des mobilités différentes. Grandes ions à mobilités inférieures offriront une plus grande résistivité de mouvement des ions que les plus petits, ce qui peut entraîner une légère mais significative différence de potentiel à la jonction des solutions. Ce potentiel de jonction doit être prise en compte lors de la détermination des tensions appropriées subies par la cellule.

La technique présentée ici est celui utilisé par notre laboratoire pendant de nombreuses années. Cependant, il existe d'autres méthodes d'enregistrement de la M-cellule. Plus particulièrement, Joseph Fetcho et ses collègues ont développered une excellente préparation dans lequel on peut enregistrer des cellules M de larves plus âgées (4-5 jours) d'une manière moins invasive que présenté ici, où le M-cellulaire est abordée à partir de la surface dorsale ^16. Nous avions essayé une technique similaire, mais plus de facilité à aborder le M-cellule de la face ventrale du cerveau postérieur, où la cellule est plus proche de la surface du cerveau, en particulier chez les jeunes poissons (soit 24 à 72 HPF HPF). En outre, une approche à partir de la surface dorsale exige habituellement l'utilisation d'une lignée transgénique qui exprime un marqueur fluorescent dans le M-cellule, qui a le potentiel d'introduire des variables supplémentaires dans l'enregistrement. Ce problème n'est pas présent lors de l'utilisation de type de poissons sauvages. Cependant, avec la technique présentée ici, nous sommes limités à l'étude des animaux plus jeunes (24 à 72 HPF HPF). Ainsi, chaque méthode a ses avantages et ses limites.

Test t de Student peut être utilisé pour comparer les deux groupes de données tandis que l'analyse de variance (ANOVA) peut être utilisé pour comparer des groupes multiples. Il faut prendre soin de choisir le test post-hoc approprié pour paramétrique vs données non paramétriques.