Patch Clamp Recordings van embryonale zebravis Mauthner Cells
Summary
We hebben een intacte hersenen ruggenmerg voorbereiding voor het vastleggen en bewaken elektrische activiteit via patch clamp opname van de Mauthner neuronen en andere reticulospinal cellen in de zebravis embryo's ontwikkeld. Zo zijn wij in staat om prikkelende en remmende synaptische stromen, voltage-gated kanaal activiteit en actiepotentialen opnemen van belangrijke neuronen in een zich ontwikkelende embryo.
Abstract
Mauthner cellen (M-cellen) zijn groot reticulospinal neuronen gelegen in de achterhersenen van beenvissen. Ze zijn belangrijke neuronen betrokken bij een karakteristiek gedrag bekend als C-starten of escape reactie die optreedt wanneer het organisme neemt een bedreiging. De M-cellen is uitgebreid bestudeerd bij volwassen goudvissen wanneer is aangetoond dat een groot aantal prikkelende, remmende en neuromodulatory signalen ontvangen 1. We hebben onderzocht welke M-cel activiteit in embryonale zebravis om aspecten van synaptische ontwikkeling te bestuderen in een gewerveld dier voorbereiding. In de late jaren 1990 ontwikkeld Ali en collega voorbereiding op patch clamp opnemen van M-cellen in zebravisembryo's, waarbij de CZS grotendeels intact 2,3,4. Het doel was op dat moment aan synaptische activiteit opnemen hindbrain neuronen, ruggenmerg neuronen en romp skeletspieren met behoud van functionele synaptische verbindingen binnen een intacte hersenen-ruggenmerg voorbereiding.Dit preparaat wordt nog steeds gebruikt in ons laboratorium vandaag. Om de mechanismen van ontwikkelingsstoornissen synaptische plasticiteit onderzoeken, registreren wij prikkelende (AMPA en NMDA-gemedieerde) 5,6 en remmende (GABA en glycine) synaptische stromen uit ontwikkelingslanden M-cellen. Belangrijk is dat deze unieke preparaat kunnen we terugkeren naar dezelfde cel (M-cellen) van bereiding tot bereiding nauwgezet te onderzoeken synaptische plasticiteit en neuro-ontwikkeling in een embryonale organisme. De voordelen van dit preparaat omvat 1) intacte, functionele synaptische verbindingen op de M-cellen, 2) relatief goedkoop preparaten, 3) een grote voorraad beschikbaar embryo 4) de capaciteit om op hetzelfde celtype (dat wil zeggen M- cellen) in elke opstelling, zodat synaptische ontwikkeling op het niveau van een afzonderlijke cel kan worden onderzocht van vis tot vis en 5) beeldvorming van hele preparaten door de transparantie van het embryo.
Introduction
Een van de onopgeloste kwesties in ontwikkelingsneurobiologie heeft betrekking op de rol van synaptische plasticiteit verschijnselen tijdens synaptische rijping. Ons onderzoek richt zich op het begrijpen van de mechanismen die synaptische plasticiteit ontwikkeling ten grondslag liggen met een algemene doelstelling van het begrijpen van het gedrag van dieren in het kader van synaptische ontwikkeling. Om dit te doen, hebben we een grotendeels intact preparaat in een organisme (zebravis, Danio rerio) dat heeft opgedaan aanzienlijke tractie voor ontwikkelings-studies in de late jaren 1990.
De zebravis biedt aantal duidelijke voordelen voor neurologische studies. Zo is het genoom gesequenced en kan men morfolino knockdowns en zinkvinger nuclease knockouts voeren om genactiviteit en eiwitexpressie zwijgen. Men kan ook overexpressie studies uitvoeren en transgene lijnen kunnen worden geconstrueerd 7-9. Embryo's zijn relatief eenvoudig en overvloedig te verwerven, enhet transparante karakter van het embryo leent zich goed voor beeldvorming en opto-genetische studies. Bovendien kan gedragsanalyse worden uitgevoerd en elektrofysiologische experimenten kunnen worden uitgevoerd op spiervezels, ruggenmerg neuronen en achterhersenen neuronen grotendeels intact organismen, zodat men cellulaire functie in vivo te onderzoeken. Belangrijk is, zijn we in staat om synaptische activiteit onderzoeken niet alleen dezelfde klasse van de cel, maar in de zeer hetzelfde paar neuronen, van de voorbereiding tot de voorbereiding. Met andere woorden, dit is een van de zeldzame gewervelde preparaten waarbij men terugkeert naar dezelfde neuron, in situ, om de ontwikkeling te bestuderen.
Om neuronale circuits als levensvatbaar mogelijk te houden, hebben we een preparaat waarin de achterhersenen en ruggenmerg intact bleven, terwijl patch clamping van de M-cellen. In deze voorbereiding, de ogen, kaak en de huid bedekken de hersenen voorzichtig verwijderd en de achterhersenen is peeled weg van de notochord, waardoor de toegang tot het ventrale oppervlak van de achterhersenen. De reticulospinal neuronen bevinden zich enkele micrometers diep en zijn relatief gemakkelijk bereikbaar. Op 48 uur na de bevruchting (HPF, sommige afkortingen in tabel 1) de cellen elektrisch compact en kan getrouw opnemen synaptische activiteit (zowel prikkelende en remmende stromen), spanningsafhankelijke stromingen en actiepotentialen van hen.
Onze bevindingen suggereren dat vele aspecten van synaptische ontwikkeling en rijping optreden in de 24 uur voorafgaand aan het uitkomen, en daarom veel van onze aandacht is gericht op organismen, variërend in leeftijd van 24 tot 72 HPF HPF. Echter, door 72 HPF, M-cellen zijn minder elektrisch compact en moeilijk om goed ruimte klem. De techniek kan worden gebruikt om niet alleen het opnemen van M-cellen, maar ook uit de homologen Mid2 cm en MiD3 cm. Theoretisch kan men ook uitvoeren dubbele opnames, van een spinal koord neuron zoals een primaire motorische neuron en van de M-cel, maar dit is moeilijk en het kan worden aangevoerd dat de voordelen van een dergelijke moeilijke techniek niet de buitengewone inspanning die nodig is kan de moeite waard.
Protocol
Representative Results
Discussion
De hierboven beschreven protocol maakt het mogelijk om klem opnemen patch uit de M-cellen en homologen daarvan. De techniek is uitdagend en zorg moeten worden genomen in een aantal belangrijke gebieden in de hele procedure. We zullen nu bespreken een aantal van deze gebieden en biedt nuttige tips om succes te garanderen.
De bouw van het ontleden / opname kamer is een cruciaal aspect van het experiment. De M-cellen zijn moeilijk te zien tenzij differentieel interferentie contrast wordt gebruikt. DIC Nomarski werkt het beste als schone glazen dekglaasjes, maar wij hebben gevonden dat een zeer dunne laag Sylgard (~ 1-2 mm) niet verstoren de DIC zodanig dat het interfereert met de identificatie van de M-cellen. Daarom gebruiken we een opname kamer dat een dunne glazen dekglaasje op de bodem waarop wordt geplaatst een klein plastic ring (~ 5 mm diameter) heeft. We mengen Sylgard 184 in een petrischaal en voorzichtig de vloeistof Sylgard aan de binnenkant van de ring met een Pasteur pipet. De Sylgard kan worden uitgehard bij kamertemperatuur gedurende enkele dagen of kunnen voor een snelle uitharding worden verwarmd. De wasmachine kan worden verwijderd nadat de Sylgard is uitgehard, hoewel dit niet noodzakelijk. Zodra de dissectie / opname kamer is gemaakt, kan het worden gebruikt voor een aantal weken voordat een frisse-Sylgard omzoomde glasplaatje nodig is.
De volgende stap in de procedure is om alle documenten op die relevante oplossingen op de dag van het experiment (tabel 3). Intracellulaire oplossingen die alles behalve ATP en GTP zijn worden vooraf opgeslagen in 5 ml porties bij -20 ° C. Op de dag van het opnemen van een monster ontdooid tot kamertemperatuur en vers ATP en GTP toegevoegd. De oplossing wordt op 280 mOsm en pH 7.4. In onze handen, vinden we dat de toevoeging van verse ATP en GTP dagelijks goede resultaten bij opnamen. Alle oplossingen nodig hebben voor de beste kans van slagen steriel worden gehouden.
Intracellulaire oplossingen moeten worden gefilterd througha 0,22 pm filter (Sigma) tot kleine deeltjes en puin dat de opname zou kunnen beïnvloeden te verwijderen. Om dit te doen, moeten we eerst de intracellulaire oplossing te trekken in een 1 ml spuit, bevestig de filter aan het einde van de injectiespuit en voeg een plastic pipet tip dat verwarmd was en trok naar fijne punt, tot het einde van het filter. Dit laat ons toe om de gefilterde intracellulaire oplossing rechtstreeks aan op de binnenzijde van het glas patch pipetten.
Zodra de oplossingen worden bereid, kan het embryo worden verdoofd en ontleed. Voorafgaand aan de dissectie, moet ervoor worden gezorgd dat de leeftijd van het organisme adequate beoordeling. Elk embryo binnen een koppeling leeftijden op een iets ander tarief. Daarom is bij de beoordeling van de leeftijd van het organisme belangrijke daartoe volgens vastgestelde procedures 10,13, met fenotypische signalen zoals het aantal somieten, de algemene vorm van het lichaam en de tijd ei bevruchting. Alle ontledingen worden uitgevoerd met een Dumont # 5 prima paarforceps. Deze moeten scherp zijn en in goede staat anders zal het erg moeilijk zijn om de huid te bedekken de achterhersenen en eventuele bindweefsel op het ventrale oppervlak van de achterste hersenen te verwijderen. We hebben vaak aan de tang te scherpen na een paar weken gebruik, en doe dit zelf met een slijpsteen.
Om de vis vastmaken aan de dunne laag van Sylgard gebruiken we pinnen ouderwets uit fijne wolfraam draad 0,001 inch in diameter. De pennen zijn gesneden met een oude, micro-dissectie schaar onder een dissectie microscoop, en zijn klein genoeg om dwars door de notochord. Pinning de embryo's op een ander punt hen niet te immobiliseren en maakt dissecties bijna onmogelijk om uit te voeren. Bij de eerste leren de opnamen uit te voeren, kan het moeilijk zijn identiteit M-cel homologen zijn (vooral Mid2 cm dat zich in het naburige rhombomere – rhombomere 5). In sommige embryo beide paren cellen blijken vergelijkbaar in grootte. De otolieten provide een handig herkenningspunt om te helpen bij de identificatie van M-cellen. Op 48 HPF de M-cellen bevinden zich direct naast de otolieten, en hoewel de otolieten tijdens de dissectie worden verwijderd, ze achter een licht beschadigde laterale gebied van de achterhersenen, die dient als een marker voor hun oorspronkelijke positie te verlaten. Transgene vis die GFP of een andere fluorescente marker in de M-cel te uiten, zorgen voor een uitstekende voorbereiding van nieuwe onderzoekers. In onze handen de M-cellen een membraan capaciteit van ongeveer 18-24 pF 48 HPF, terwijl de kleinere homologen dichter bij 12-14 pF. Cellen met groter oppervlak hebben grotere membraancapaciteit waarden (gemeten in pico Farad (pF)) vergeleken met kleinere cellen. Aldus kan membraancapaciteit worden gebruikt als een ruwe indicator voor de celgrootte, waar grotere cellen groter capaciteitswaarden. Deze elektrofysiologische kenmerk dient als een andere eigenschap waarmee de M-cel kan worden geïdentificeerd uit homologen daarvan. Tenslotte gebruiken wij vaak Lucifer geel in onze opname (intracellulair) oplossingen, die ons in staat stelt om een stevige identificatie van het type cel onderzochte gedraging met behulp van fluorescentie beeldvorming eenmaal opnames zijn voltooid.
Pipettip weerstanden in de range van 3,5-4,5 MQ zijn het beste compromis tussen tip formaat en lage toegang weerstand, die meestal varieert van 8 tot 15 MQ. Dit is bijzonder belangrijk voor gebeurtenissen met snelle kinetiek, ~ 0,1 msec (20-80%) stijgtijden en ~ 0,5 msec exponentieel verval 12,14,15 (Figuren 3A en 3B). De gegevens worden verkregen tegen een digitalisering snelheid van 50-100 kHz en gefilterd met een low pass frequentie van 5-10 KHz. Wat de patch pipetten hebben wij gevonden dat ze niet hoeven bij brand gepolijst om een opname te verkrijgen, maar anekdotische lijkt iets meer kans voldoend goede afdichting tegen ongepolijste pipetten bieden. Aangezien de pipet tips zijn relatief groot, hebben we niet toe very veel positieve druk aan de pipet voordat de oplossing. Het vergt oefening beslissen over de juiste hoeveelheid positieve druk toe te passen als een overmaat druk zal de cel teveel bewegen en voorkomt afdichting ontstaan. Het kan ook schade synaptische contacten de cel voorzichtig verplaatst vanuit de oorspronkelijke positie. Anderzijds, ofwel te weinig druk resulteert in vuile tips en het oppervlak van de cel en hebben een goede afdichting te vormen reinigen. Een gulden middenweg wordt alleen bereikt door aanzienlijke oefening en ervaring. Seal vorming kan worden uitgebreid met toepassingen van negatieve spanningen aan de pipet. We hebben meestal zegels van 1,2-2 GQ, die uitstekend voor doorbraken in de gehele cel mode zijn.
Als farmacologische middelen moeten worden toegepast op de cel cytoplasma, we vermelden in intracellulaire oplossing voor het vullen van de pipet. Zorg moeten worden genomen bij het opstellen van de pipet oplossingen om het verlies van de agenten te voorkomendoordat het binden aan de 0,22 urn filter. Daarom filteren we de intracellulaire medium eerste, en voeg vervolgens voorzichtig de farmacologisch middel om de gefilterde oplossing. Toepassing van verbindingen naar het intracellulaire compartiment heeft zijn eigen unieke reeks van uitdagingen. Bijvoorbeeld, toevoeging van geneesmiddelen aan het intracellulaire medium vermindert doorgaans de kans op het vormen van een afdichting GQ, maar niet tot het punt waar het een belangrijke belemmering voor het experiment.
Men moet zich realiseren dat de toepassing van farmacologische middelen op deze wijze niet mogelijk de experimentator om de meest geschikte besturing vastleggen omdat de agent heeft onmiddellijk toegang tot de cel vanaf het begin van de gehele cel configuratie. Daarom, terwijl wij de gegevens in dit type experiment opnemen, moet men zich ervan bewust dat de volgende beste controle is de intracellulaire toepassing van een inactieve vorm van de agent. In veel gevallen neemt dit de vorm van een hitte-geïnactiveerd verbinding, een scrambled peptide or een inactieve isomeer verkregen van de leverancier.
We verwerven gegevens in de vorm van synaptische stromen (mPSCs), voltage-gated stromingen en actiepotentialen. Miniatuur stromen kunnen worden geanalyseerd door een paar uitstekende programma (PClamp, Axograph, enz.), hoewel we liever Axograph X (John Clements) gebruikt. Axograph X draait op zowel Windows-als Macintosh-platformen en kan gebruikt worden voor zowel het verwerven en analyseren van elektrofysiologische gegevens. mEPCs worden verkregen met behulp van een sjabloon keuze van de experimentator, verkregen uit de opname zelf. Individuele wedstrijden kunnen worden geanalyseerd voor eigenschappen zoals stijging van de tijd, amplitude, halve breedte en verval tijd, enz. Wij exporteren de spreadsheet van gegevens aan Kaleidagraph (Synergy Software) waar we cijfers, inclusief kopieën van het evenement sporen uit Axograph X. kan produceren
Een van de moeilijkste aspecten van het experiment is het bepalen of de opname goed genoeg schoon te bepalen werd uitgevoerd,betrouwbare gegevens. Zo kan de ruimte klemmen problemen ontstaan bij het opnemen mPSCs van M-cellen die grote axonen en uitgebreide dendritische processen. Wanneer spanning klemmen, kan men in het algemeen regelen de spanning aan de punt van de pipet redelijk (vooral als de toegang weerstand (Ra) is laag), maar kan goede beheersing van de membraanpotentiaal niet in dendritische processen of axons die zijn ver weg van de pipet tip. Een werkwijze voor het bepalen of de cel was goed ruimte geklemd is een spreidingsdiagram van de stijgtijd vs de amplitude van de mPSCs die werden opgenomen produceren. Een correlatie tussen de gegevens suggereerden onvoldoende ruimte klemmen. Met andere woorden, als de ruimte klem slecht dan mPSCs die dicht bij de pipet later zal snellere stijgtijden en amplitudes groter dan gebeurtenissen enige afstand van de pipet. Als een correlatie bestaat, worden de gegevens problematisch en kan niet worden gebruikt.
Een ander aspectvan elektrofysiologische opnames die moet worden aangepakt, is dat van lekstromen. Dit geldt vooral wanneer de spanning klemmen van een cel om de spanningsafhankelijke stromen zoals Na + of K + stromen nemen. Wanneer de membraanpotentiaal wordt afgeweken van de rest, kan lekstromen worden opgenomen samen met spanningsafhankelijke activiteit. Lekstromen (I L), een combinatie van kalium (K I), natrium (Na I) en chloride (Cl I) stroom via niet-spanningsafhankelijke kanalen zullen de activiteit plaats verhullen en moet worden afgetrokken van de opname. De versterker is in staat om deze functie online tijdens de opname door het uitvoeren van wat typisch zogenaamde P / N protocol. Tijdens een P / N-protocol zal de versterker een aantal kleine depolarisaties (of hyperpolarizations) loopt van rust en zal het resulterende lekstroom die optreedt opnemen. Belangrijk is klein genoeg pulsen die niet spanningsafhankelijke kanalen niet activeert gebruiken. De huidiges die optreden tijdens deze pulsen worden geregistreerd en gemiddeld zodat deze lekstromen kunnen worden afgetrokken van de voltage-gated kanaal activiteit.
Tenslotte moet men rekening houden met de mogelijke splitsing, die optreedt bij de punt van de elektrode tussen de intracellulaire en extracellulaire oplossing. Intracellulaire en extracellulaire oplossingen bestaan typisch uit verschillende ionen, met verschillende activiteiten en mobiliteiten. Grotere ionen met een lagere mobiliteiten biedt meer weerstand te ionenbeweging dan kleinere en dit kan leiden tot een kleine maar significante potentiaalverschil op de kruising van de oplossingen. Deze kruising potentieel moet rekening worden gehouden bij het bepalen van de juiste spanningen ervaren door de cel.
De hier gepresenteerde techniek is gebruikt door ons labo jaren. Er zijn alternatieve methoden voor het registreren van de M-cellen. Het meest opvallend is, Joseph Fetcho en zijn collega's ontwikkelened een uitstekende voorbereiding waarin men kan nemen van de M-cellen van oudere larven (4-5 dagen oud) in een minder invasieve manier dan hier, waar het M-cel wordt benaderd vanuit het dorsale oppervlak 16 gepresenteerd. We hadden een soortgelijke techniek geprobeerd maar vond het gemakkelijker om de M-cel benaderen van de ventrale zijde van de achterhersenen, waarbij de cel dichter bij het oppervlak van de hersenen, vooral bij jonge vissen (bijvoorbeeld 24 tot 72 HPF HPF). Voorts is een benadering van het dorsale oppervlak vereist gewoonlijk het gebruik van een transgene lijn die een fluorescerend label uit in de M-cellen, die het potentieel om extra variabelen introduceren in de opname. Dit probleem is niet aanwezig bij het gebruik van wild type vis. Echter, met de hier gepresenteerde techniek worden we beperkt tot het bestuderen jongere dieren (HPF 24 tot 72 HPF). Dus elke benadering heeft zijn voordelen en beperkingen.
Student's t-test kan worden gebruikt om twee groepen gegevens terwijl een analyse van Variance (ANOVA) kan worden gebruikt om meerdere groepen te vergelijken. Er moet worden afgegeven bij een post-hoc test voor parametrische versus niet-parametrische gegevens kiezen.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Natuurwetenschappen en Engineering Research Council of Canada (NSERC) en de Canadese Stichting voor Innovatie (CFI) aan DWA.
Materials
| Equipment Name | Company | Catalogue Number |
| Dissecting Dish | Warner Instruments | 64-0291 |
| 0.001″ Tungsten Wire | Scientific Instruments Services Inc. | W406 |
| Dissecting microscope | Leica Microsystems | MZ9.5 |
| Pipette Puller | Sutter Instruments Co. | P-97 |
| Microforge | Narishige Group | MF-900 |
| Upright Patch clamp microscope | Leica Microsystems | DMLFSA |
| Micromanipulator | Siskiyou Inc. | MX7500 |
| Digidata | Molecular Devices | 1322A |
| Amplifier | Molecular Devices | 200B |
| Acquisition software | Molecular Devices | pClamp9 |
| Axograph X | Axograph | Axograph X |
References
- Korn, H., Faber, D. S. The Mauthner cell half a century later: a neurobiological model for decision-making. Neuron. 47, 13-28 (2005).
- Ali, D. W., Buss, R. R., Drapeau, P. Properties of miniature glutamatergic EPSCs in neurons of the locomotor regions of the developing zebrafish. J. Neurophysiol. 83, 181-191 (2000).
- Ali, D. W., Drapeau, P., Legendre, P. Development of spontaneous glycinergic currents in the Mauthner neuron of the zebrafish embryo. J. Neurophysiol. 84, 1726-1736 (2000).
- Drapeau, P., Ali, D. W., Buss, R. R., Saint-Amant, L. In vivo recording from identifiable neurons of the locomotor network in the developing zebrafish. J. Neurosci. Methods. 88, 1-13 (1999).
- Patten, S. A., Ali, D. W. AMPA receptors associated with zebrafish Mauthner cells switch subunits during development. J. Physiol. 581, 1043-1056 (2007).
- Patten, S. A., Ali, D. W. PKCgamma-induced trafficking of AMPA receptors in embryonic zebrafish depends on NSF and PICK1. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S .A. 106, 6796-6801 (2009).
- Ekker, S. C. Morphants: a new systematic vertebrate functional genomics approach. Yeast. 17, 302-306 (2000).
- Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene ‘knockdown’ in zebrafish. Nat. Genet. 26, 216-220 (2000).
- Tallafuss, A., et al. Turning gene function ON and OFF using sense and antisense photo-morpholinos in zebrafish. Development. 139, 1691-1699 (2012).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).
- Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Archiv : European Journal of Physiology. 391, 85-100 (1981).
- Patten, S. A., Ali, D. W. AMPA receptors associated with zebrafish Mauthner cells switch subunits during development. J. Physiol. 581, 1043-1056 (2007).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory use of Zebrafish (Danio rerio). 1, (2007).
- Patten, S. A., Ali, D. W. PKCgamma-induced trafficking of AMPA receptors in embryonic zebrafish depends on NSF and PICK1. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 6796-6801 (2009).
- Patten, S. A., Roy, B., Cunningham, M. E., Stafford, J. L., Ali, D. W. Protein kinase Cgamma is a signaling molecule required for the developmental speeding of alpha-amino-3-hydroxyl-5-methyl-4-isoxazole-propionate receptor kinetics. The European Journal of Neuroscience. 31, 1561-1573 (2010).
- Kinkhabwala, A., et al. A structural and functional ground plan for neurons in the hindbrain of zebrafish. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 1164-1169 (2011).
