Патч зажим Recordings от эмбриональных данио рерио Mauthner клеток
Summary
Мы разработали неповрежденный мозг спинной подготовку шнур для записи и мониторинга электрической активности с помощью записи зажим патч от нейронов Mauthner и других ретикулоспинальных клеток в эмбрионы рыбок данио. Таким образом, мы можем записать возбуждающих и тормозных синаптических токов, активность канала напряжения закрытого и потенциалы действия от ключевых нейронов в развивающемся эмбрионе.
Abstract
Mauthner клетки (М-клетки) являются крупные ретикулоспинальных нейроны, расположенные в заднем мозге из костистых рыб. Они являются ключевыми нейроны, участвующие в характерной поведения, известного как C-начать или избежать ответа, что происходит, когда организм воспринимает угрозу. М-клеток была тщательно изучена во взрослой золотой рыбки, где было показано, получать широкий спектр возбуждающих, ингибирующие и нейромодуляторного сигналы 1. Мы рассматривали М-активность клеток в эмбриональной рыбок данио с целью изучения аспектов синаптической развития в препарате позвоночных. В конце 1990-х Али и его коллеги разработали препарат для патч-зажим записи от М-клеток в эмбрионы рыбок данио, в которых ЦНС во многом нетронутыми 2,3,4. Цель в то время был для записи синаптической активности от заднего мозга нейронов, нейронов спинного мозга и ствола скелетных мышц при сохранении функциональных синаптических связей в рамках неповрежденной мозговой спинной подготовки мозга.Этот препарат до сих пор используется в нашей лаборатории сегодня. Чтобы исследовать механизмы, лежащие с развитием синаптическую пластичность, мы записываем возбуждающий (АМФК и NMDA-опосредованной) 5,6 и тормозные (ГАМК и глицин) синаптические токи из развивающихся М-клетки. Важно, что это уникальный препарат позволяет нам вернуться к той же ячейке (М-клеток) от подготовки с подготовкой тщательно изучить синаптическую пластичность и нейро-развития в зачаточном организма. Преимущества, предоставляемые этой подготовки включает 1) нетронутыми, функциональные синаптических связей на М-клетки, 2) относительно недорогие препараты, 3) большой запас легкодоступных эмбрионов 4) способность возвращаться в тот же тип клеток (то есть М- клеток) в каждом подготовки, так что синаптических развития на уровне отдельной клетки могут быть рассмотрены от рыбы к рыбе, и 5) изображений целых препаратов из-за прозрачного характера эмбрионов.
Introduction
Одним из нерешенных вопросов в нейробиологии относится к роли синаптических явлений пластичности во время синаптической созревания. Наше исследование фокусируется на понимании механизмов пластичности, лежащие в основе синаптической развития с общей целью понимания поведения животных в контексте синаптической развития. Для того чтобы сделать это, мы разработали во многом нетронутыми подготовку в организме (данио, Данио рерио), которая получила значительную тягу для исследований развития в конце 1990 года.
Данио предлагает несколько явных преимуществ для развития нервной системы исследований. Например, его геном последовательность, и можно выполнять морфолино нокдаунов и цинка пальцами нуклеазам нокауты, чтобы заставить замолчать активность гена и экспрессию белка. Можно также выполнять Сверхэкспрессия исследования и трансгенных линий можно построить 7-9. Эмбрионы могут быть сравнительно легко и в изобилии приобретать ипрозрачный характер эмбриона хорошо поддается визуализации и оптико-генетических исследований. Кроме того, анализ поведения может быть выполнена, и электрофизиологические эксперименты могут быть проведены на мышечных волокон, нейронах спинного мозга и заднего мозга нейронов в значительной степени нетронутыми организмов, позволяя одним изучить функционирование клетки в естественных условиях. Важно отметить, что мы в состоянии исследовать синаптической активности в не только того же класса клеток, но в том же самом пары нейронов, начиная с подготовки к подготовке. Другими словами, это один из редких препаратов позвоночных, в которых можно вернуться к тому же нейрона, на месте, чтобы изучить его развития.
Для того чтобы сохранить нейронной цепи, как жизнеспособный, насколько это возможно, мы разработали препарат, в котором задний мозг и спинной мозг были оставлены нетронутыми, в то время как пластырь зажима от М-клетками. В этом препарате, глаза, челюсти и кожа наложения мозг аккуратно удаляются и задний мозг является Peeleд от хорды, предоставляя доступ к брюшной поверхности заднего мозга. В ретикулоспинальных нейроны расположены несколько микрометров глубоко и относительно легко доступны. В 48 ч после оплодотворения (HPF; некоторые аббревиатуры приведены в таблице 1) клетки являются электрически компактный и можно точно записать синаптической активности (возбуждающие и подавляющие токи), напряжения закрытого токов и потенциалов действия от них.
Наши результаты позволяют предположить, что многие аспекты синаптической развития и созревания происходят в 24 часов до вылупления, и поэтому большая часть нашего внимания сосредоточено на организмов в возрасте от 24 часов после оплодотворения до 72 часов после оплодотворения. Тем не менее, на 72 часов после оплодотворения, M-клетки менее электрически компактный и их трудно правильно пространство зажим. Этот метод может быть использован для записи не только от М-клеток, но также от его гомологи, Mid2 см и MiD3 см. Теоретически, можно также выполнять двойные записи, от зрИнал нейрон мозга, таких как первичный двигательных нейронов и от М-клетки, но это трудно, и можно было бы утверждать, что выгоды, получаемые от такой сложной технике не может быть стоит огромные усилия, что требуется.
Protocol
Representative Results
Discussion
Протокол, описанный выше позволяет залатать зажим запись из М-клеток и его гомологов. Методика является сложной задачей и следует позаботиться в нескольких ключевых областях на протяжении всей процедуры. Теперь мы обсудим некоторые из этих областей и предложит полезные советы для достижения успеха.
Строительство камеры вскрытие / записи является одним из важнейших аспектов эксперимента. М-клетки трудно увидеть, если не используется дифференциальный интерференционный контраст. Nomarski ДВС лучше всего работает с чистым покровные стекла, но мы обнаружили, что очень тонкий слой Sylgard (~ 1-2 мм) не будет искажать DIC до такой степени, что это воспрепятствует идентификации М-клеток. Таким образом, мы используем камеру записи, который имеет тонкую покровным стеклом на дне, на котором размещен небольшой пластиковый шайбу (~ диаметр 5 мм). Мы смешивать Sylgard 184 в чашку Петри и осторожно добавить жидкий Sylgard к внутренней части шайбы с помощью пастеровской пипетки. Сиlgard можно вылечить при комнатной температуре в течение нескольких дней или может быть нагрета для быстрого отверждения. Шайба могут быть удалены после Sylgard затвердеет, хотя это не является необходимым. После того как камера рассечение / записи был сделан, он может быть использован в течение нескольких недель перед свежий Sylgard картонных предметное стекло необходимо.
Следующим шагом в процедуре, чтобы сделать копии всех соответствующих решений на день эксперимента (табл. 3). Внутриклеточные растворы, содержащие все, кроме АТФ и ГТФ изготавливаются заранее и хранить в 5 мл аликвоты при -20 ° С В день записи аликвоту оттаивали до комнатной температуры и свежего АТФ и ГТФ добавлен. Раствор доводят до 280 мОсм и рН 7,4. В наших руках, мы находим, что добавление свежего АТФ и ГТФ на ежедневной основе результатов в хороших записей. Все решения должны быть сохранены стерильной за лучший шанс на успех.
Внутриклеточные решения должны быть отфильтрованы Througга 0,22 мкм фильтр (Sigma) для удаления мелких частиц и мусора, которые могут повлиять на запись. Чтобы сделать это, мы сначала нарисовать внутриклеточный раствор в шприц емкостью 1 мл, прикрепить фильтр к концу шприца и добавить пластиковый наконечник пипетки, который был нагрет и тянется к тонкой наконечником, до конца фильтра. Это позволяет применить отфильтрованного раствора внутриклеточного непосредственно к внутренней стороне стекла патч-пипеток.
После того, как растворы получают, эмбрион может быть анестезировали и расчленены. До вскрытия, следует позаботиться, чтобы адекватно оценить возраст организма. Каждый эмбрион в течение сцепления возрастов в немного разной скоростью. Поэтому при оценке возраста организма важно сделать это в соответствии с установленными процедурами 10,13, используя фенотипические сигналы, такие как количество сомитов, общая форма тела и время оплодотворения яйцеклетки. Все вскрытия выполняются с Дюмон # 5 тонкой парыщипцы. Они должны быть острыми и в хорошем рабочем состоянии в противном случае это будет очень трудно удалить кожу, покрывающий задний мозг и любой соединительной ткани на брюшной поверхности заднего мозга. Мы часто должны заострить щипцы после нескольких недель использования, и делать это непосредственно с точильный камень.
Чтобы закрепить рыбу с тонким слоем Sylgard, мы используем флажки сделаны из тонкой вольфрамовой проволоки 0,001 дюйма в диаметре. Выводы срезают старый, микро-рассечение ножницами под микроскопом рассекает, и достаточно мал, чтобы поместиться прямо через хорды. Закрепление эмбрионов в любой другой точке не обездвижить их и делает вскрытия практически невозможно выполнить. Когда первый обучения для выполнения записи, это может быть трудно идентичности М-клетки от его гомологи (в частности, Mid2 см, который расположен в соседнем ромбомере – ромбомере 5). В некоторых эмбрионов эти две пары клеток появляются близки по размерам. Отолиты проVide удобным ориентир, чтобы помочь в идентификации М-клеток. В 48 часов после оплодотворения М-клетки расположены в непосредственной близости от отолитам, и даже при том, что отолиты удаляются во время вскрытия, они оставляют после себя несколько поврежденных боковой области заднего мозга, которая служит в качестве маркера для их первоначальное положение. Трансгенные рыбы, которые выражают GFP или какой-либо другой флуоресцентный маркер в М-клетки, обеспечивают отличную подготовку к новым экспериментаторов. В наших руках М-клетки имеют мембраны емкость примерно 18-24 пФ на 48 часов после оплодотворения, в то время как более мелкие гомологи ближе к 12-14 пФ. Клетки с большей площади поверхности имеют большие значения емкости мембраны (измеряется в пико Фарадах (PF)) по сравнению с меньшими клеток. Таким образом, мембрана емкость может быть использован в качестве приблизительного индикатора размера ячейки, где более крупные клетки имеют большие значения емкости. Эта характеристика электрофизиологических служит другого свойства, по которым М-клетки могут быть идентифицированы с его гомологи. Наконец, мы часто используем ЛуCifer желтый в нашей записи (внутриклеточные) решений, что позволяет нам проводить твердую идентификации типа клеток под следствием использованием изображений флуоресценции раз записи являются полными.
Пипетки сопротивления в диапазоне 3,5-4,5 МОм являются лучшим компромиссом между размером насадки и сопротивления низким доступа, которая, как правило, колеблется от 8 до 15 МОм. Это особенно важно для событий с быстрой кинетики; ~ 0,1 мс (20-80%) подняться раза и ~ 0,5 мс экспоненциальная распадается 12,14,15 (рис. 3А и 3В). Данные приобретается со скоростью дискретизации 50-100 кГц и фильтруют с низкой частотой пропускания 5-10 кГц. Что касается патч-пипеток, мы обнаружили, что они не должны быть огневой полировкой, чтобы получить запись, но эпизодически, по-видимому, чтобы предложить немного больше шансов на получение хороших уплотнения по сравнению с неполированный пипеток. Так как наконечники относительно большие, мы не добавляем версииу много положительного давления в пипетки перед входом в решение. Это требует практики принятия по соответствующим количеством положительного давления для применения как превышение давления будет двигаться в клетку слишком много, и будет препятствовать формированию уплотнения. Это может также привести к повреждению синаптические контакты как клетка мягко смещен из своего исходного положения. С другой стороны, слишком мало давление приводит грязных советов и не очистить поверхность клетки достаточно хорошо, чтобы сформировать хорошие уплотнения. Золотая середина достигается только путем значительного практики и опыта. Формирование Печать может быть повышена с применения отрицательных напряжений в пипетку. Мы обычно имеют уплотнения 1,2-2 ГОм, которые отлично подходят для прорывов в режим всей клетки.
Когда фармакологических агентов должны быть применены к цитоплазме клеток, мы включаем их в внутриклеточного раствора перед заполнением пипетки. Следует проявлять осторожность при подготовке пипетки решения, чтобы избежать потери агентовпри наличии его связывания с фильтром 0,22 мкм. Таким образом, мы фильтрации внутриклеточной средой, а затем осторожно добавить фармакологического агента для отфильтрованного раствора. Применение соединений внутриклеточное пространство имеет свой собственный уникальный набор проблем. Например, добавление препаратов в среде клетки, как правило, снижает шансы формирования ГОм печать, но не до такой степени, что является серьезным препятствием для эксперимента.
Следует понимать, что применение фармакологических препаратов в этой манере не позволяет экспериментатор записывать наиболее подходящий контроль, так как агент имеет непосредственный доступ к ячейке с начала конфигурации всей клетки. Поэтому, хотя мы записывать данные на протяжении всего этого типа эксперимента, нужно знать, что следующая лучшая управления является внутриклеточным применение неактивной форме агента. Во многих случаях это принимает форму инактивированной нагреванием соединения, зашифрованная пептид Oг неактивный изомер получить от поставщика.
Мы приобретаем данные в виде синаптических токов (mPSCs), напряжения закрытого токов и потенциалов действия. Миниатюрные токи могут быть проанализированы несколько превосходных программ (pClamp, Axograph и т.д.), хотя мы предпочитаем использовать Axograph X (Джон Клементс). Axograph X работает на обеих платформах Windows, и Macintosh и может быть использован как для сбора и анализа электрофизиологических данных. mEPCs приобретаются с помощью шаблона выбора экспериментатора, полученной от самого записи. Отдельные события могут быть проанализированы для свойств, таких как время нарастания, амплитуды, половина ширины и распада времени и т.д. Мы экспортируем таблицу данных для Kaleidagraph (Синергия Software), где мы можем произвести цифры, в том числе копий следов событий из Axograph X.
Одним из наиболее сложных аспектов эксперимента является определение того, было ли выполнено запись достаточно хорошо, чтобы обеспечить чистый,достоверные данные. Например, космические зажима вопросы могут возникнуть при записи mPSCs от М-клеток, которые имеют большие аксоны и обширные дендритные процессы. Когда напряжение зажима, можно обычно регулировать напряжение на кончике пипетки достаточно хорошо (особенно, если сопротивление доступ (R) низок), но не может иметь надлежащий контроль мембранного потенциала в дендритных процессов или аксонов, которые намного от кончика пипетки. Один способ определения, если ячейка была должным образом пространство зажат является производство график рассеяния времени нарастания против амплитуды mPSCs, которые были записаны. Корреляция между данными наводит на мысль о недостаточной космической зажима. Другими словами, если пространство зажим плохое то mPSCs, которые происходят рядом с пипетки будет быстрее и большей амплитуды, чем события, происходящие на некотором расстоянии от пипетки расти. Если корреляция существует, то данные проблематично и не могут быть использованы.
Другой аспектэлектрофизиологических записей, которые необходимо решать в том, что из токов утечки. Это особенно верно, когда напряжение зажима ячейку для записи напряжения закрытого токи, такие как Na + или K + токов. Когда мембранный потенциал отклоняется от остальных, утечки токов могут быть записаны вместе с напряжения закрытого деятельности. Токов утечки (I L), сочетание калия (И К), натрия (Na Я) и хлорид (я Cl) ток через не-напряжения закрытого каналов будет затенять деятельность интерес и должны быть вычтены из записи. Усилитель способен выполнять эту функцию в Интернете во время записи, выполнив то, что обычно называют протокол P / N. Во время протокола P / N усилитель будет работать несколько небольших деполяризаций (или hyperpolarizations) от остальной и запишет в результате ток утечки, что происходит. Важно использовать достаточно малые импульсы, которые не активируют напряжения закрытого канала. Нынешнийс, что происходит во время этих импульсов записываются и в среднем, так что эти токи утечки могут быть вычтены из активности канала напряжения закрытого.
Наконец, необходимо принимать во внимание перехода потенциал, который происходит на кончике электрода между внутриклеточным и внеклеточным растворов. Внутриклеточной и внеклеточной решения обычно состоят из различных ионов, с различными деятельности и подвижности. Большие ионы с более низкими подвижности предложит большую сопротивление движению ионов, чем маленькие, и это может привести к небольшим, но значимым разности потенциалов на стыке решений. Это соединение потенциал должны быть приняты во внимание при определении соответствующих напряжений, испытываемых клетки.
Методика, представленные здесь, один используемый нашей лаборатории в течение многих лет. Тем не менее, существуют альтернативные методы записи от М-клетки. В частности, Иосиф Fetcho и его коллеги развиватьред отличная подготовка, в которой можно записывать с М-клеток старшего личинок (4-5 дней) в менее инвазивных образом, чем представленные здесь, где М-клеток подходить с тыльной поверхности 16. Мы попробовали подобную технику, но было легче подойти к M-клетку от брюшной стороне заднего мозга, где клетка находится ближе к поверхности мозга, особенно в молодых рыб (то есть 24 часов после оплодотворения до 72 часов после оплодотворения). Кроме того, подход с поверхности спинного обычно требует использования трансгенной линии, что выражает флуоресцентной метки в М-клетки, которая имеет потенциал, чтобы ввести дополнительные переменные в записи. Этот вопрос нет при использовании дикого типа рыбы. Тем не менее, с методикой, приведенной здесь, мы ограничены изучение молодых животных (24 HPF до 72 HPF). Таким образом, каждый подход имеет свои преимущества и недостатки.
Т-тест Стьюдента может быть использована для сравнения двух групп данных в то время как анализ VarianCE (ANOVA) могут быть использованы для сравнения нескольких групп. Необходимо соблюдать осторожность, чтобы выбрать подходящий тест после специальную для параметрических против непараметрических данных.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантами от естественных наук и инженерного исследовательского совета Канады (NSERC) и Канадского фонда инноваций (CFI) в DWA.
Materials
| Equipment Name | Company | Catalogue Number |
| Dissecting Dish | Warner Instruments | 64-0291 |
| 0.001″ Tungsten Wire | Scientific Instruments Services Inc. | W406 |
| Dissecting microscope | Leica Microsystems | MZ9.5 |
| Pipette Puller | Sutter Instruments Co. | P-97 |
| Microforge | Narishige Group | MF-900 |
| Upright Patch clamp microscope | Leica Microsystems | DMLFSA |
| Micromanipulator | Siskiyou Inc. | MX7500 |
| Digidata | Molecular Devices | 1322A |
| Amplifier | Molecular Devices | 200B |
| Acquisition software | Molecular Devices | pClamp9 |
| Axograph X | Axograph | Axograph X |
References
- Korn, H., Faber, D. S. The Mauthner cell half a century later: a neurobiological model for decision-making. Neuron. 47, 13-28 (2005).
- Ali, D. W., Buss, R. R., Drapeau, P. Properties of miniature glutamatergic EPSCs in neurons of the locomotor regions of the developing zebrafish. J. Neurophysiol. 83, 181-191 (2000).
- Ali, D. W., Drapeau, P., Legendre, P. Development of spontaneous glycinergic currents in the Mauthner neuron of the zebrafish embryo. J. Neurophysiol. 84, 1726-1736 (2000).
- Drapeau, P., Ali, D. W., Buss, R. R., Saint-Amant, L. In vivo recording from identifiable neurons of the locomotor network in the developing zebrafish. J. Neurosci. Methods. 88, 1-13 (1999).
- Patten, S. A., Ali, D. W. AMPA receptors associated with zebrafish Mauthner cells switch subunits during development. J. Physiol. 581, 1043-1056 (2007).
- Patten, S. A., Ali, D. W. PKCgamma-induced trafficking of AMPA receptors in embryonic zebrafish depends on NSF and PICK1. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S .A. 106, 6796-6801 (2009).
- Ekker, S. C. Morphants: a new systematic vertebrate functional genomics approach. Yeast. 17, 302-306 (2000).
- Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene ‘knockdown’ in zebrafish. Nat. Genet. 26, 216-220 (2000).
- Tallafuss, A., et al. Turning gene function ON and OFF using sense and antisense photo-morpholinos in zebrafish. Development. 139, 1691-1699 (2012).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).
- Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Archiv : European Journal of Physiology. 391, 85-100 (1981).
- Patten, S. A., Ali, D. W. AMPA receptors associated with zebrafish Mauthner cells switch subunits during development. J. Physiol. 581, 1043-1056 (2007).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory use of Zebrafish (Danio rerio). 1, (2007).
- Patten, S. A., Ali, D. W. PKCgamma-induced trafficking of AMPA receptors in embryonic zebrafish depends on NSF and PICK1. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 6796-6801 (2009).
- Patten, S. A., Roy, B., Cunningham, M. E., Stafford, J. L., Ali, D. W. Protein kinase Cgamma is a signaling molecule required for the developmental speeding of alpha-amino-3-hydroxyl-5-methyl-4-isoxazole-propionate receptor kinetics. The European Journal of Neuroscience. 31, 1561-1573 (2010).
- Kinkhabwala, A., et al. A structural and functional ground plan for neurons in the hindbrain of zebrafish. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 1164-1169 (2011).
