胚ゼブラフィッシュマウスナー細胞からパッチクランプ記録

上記のプロトコルは、1は、M細胞とその同族体からクランプ記録にパッチを適用することができます。テクニックは困難であるとケアは、プロシージャ全体でいくつかの重要な地域で注意が必要です。我々は今、これらの領域のいくつかを議論し、成功を確実にするために役立つヒントを提供します。

解剖/記録チャンバーの構築実験の重要な側面です。 M細胞は、微分干渉コントラストを使用しない限り、参照することは困難である。微分干渉は、清浄なガラス製カバースリップで最適に動作しますが、我々はシルガード（約1〜2 mm）での非常に薄い層は、それがM細胞の同定を妨害する程度に、DICを歪めないことを発見した。したがって、我々は、小さなプラスチックワッシャ（〜5mmの直径）が配置されている際に底部の薄いガラスカバースリップを有する記録チャンバーを使用。私たちは、ペトリ皿にシルガード184をミックスし、慎重にパスツールピペットで座金の内側に液体シルガードを追加します。サイlgardは、数日間にわたって室温で硬化することができ、または急速硬化のために加熱することができる。これは必要ではないが、ワッシャは、シルガードが硬化した後に除去されてもよい。切開/記録チャンバーが行われた後、新鮮なシルガードライニングスライドガラスが必要とされるまでに数週間のために使用することができる。

手順の次のステップは、実験（ 表3）の日に関連するすべてのソリューションを構成することです。 ATPとGTP以外のすべてを含む、細胞内のソリューションは、事前に作られ、-20℃で5ミリリットルのアリコートで保存されているアリコートを記録の日に室温に解凍し、新鮮なATPし、GTPを添加する。溶液を280ミリオスモル、pHを7.4に調整する。私たちの手では、我々は良い録音で日常的結果について、新鮮な、ATPとGTPの添加を見つける。すべてのソリューションは、成功の最善の機会のために無菌に保たれる必要がある。

細胞内のソリューションは、をthrougフィルタリングされなければならないHA0.22μmのフィルター（シグマ）は、記録に影響を与える可能性のある小さな粒子や破片を除去する。これを行うためには、まず、1mlシリンジ内に細胞内液を描く注射器の端部にフィルタを貼付し、加熱して、フィルタの端部に、微細先端部に引っ張らプラスチックピペットチップを追加する。これは、私たちはガラスパッチピペットの内側に直接フィルタリング細胞内液を適用することができます。

溶液が調製されると、胚を麻酔し、解剖することができる。解剖する前に、ケアは十分に生物の年齢を評価するために注意する必要があります。わずかに異なるレートでクラッチの年齢内の各胚。生物の年齢を評価する際にそのため、このような体節の数、体の全体的な形状や卵の受精時などの表現型のキューを使用することにより、確立された手順^10,13に従ってそうすることが重要です。すべての解剖はデュモン＃5罰金ペアを用いて行われる鉗子。これらは、それ以外の場合は、後脳と後脳の腹側表面上の任意の結合組織をオーバレイ皮膚を除去することは非常に困難になり、シャープで良好な状態にある必要があります。私たちは、頻繁に使用するのは数週間後に鉗子をシャープにし、シャープの石で、この自分自身を行う必要があります。

SYLGARDの薄い層に魚をピンに、我々は、直径0.001インチ細いタングステン線から作らピンを使用しています。ピンは、解剖顕微鏡下で、古い、顕微解剖はさみで切断し、右脊索を通じて収まるほど小さいですしている。他のどの時点で胚を確保すると、それらを固定化し、実行するために解剖がほとんど不可能になりません。最初の録音を行うことを学ぶと、その同族体（ – rhombomere 5隣接rhombomereに位置しており、特にMID2センチ）から、M細胞のアイデンティティが困難な場合があります。いくつかの胚では、細胞のこれらの2ペアは同じサイズで表示されます。耳石のプロM細胞の同定を支援するために便利なランドマークを見よ。 48でM細胞はすぐ隣の耳石に位置し、HPF、および耳石を解剖中に削除されていても、彼らは元の位置のためのマーカーとして役立つ後脳のわずかに損傷を受けた側方領域を残す。 M-細胞におけるGFPまたはいくつかの他の蛍光マーカーを発現するトランスジェニック魚は、新しい実験者のための優れた製剤を提供。小さいホモログはpFの12月14日に近いながら、私たちの手でM細胞は、48 HPFで約18〜24 pF程度の膜容量を持っている。より大きな表面積を有する細胞は小さい細胞と比較して（ピコファラッド（pFの）で測定される）大きな膜キャパシタンス値を有する。従って、膜容量が大きい細胞は大きな容量値を有するセルサイズの大まか​​な指標として使用することができる。この電気生理学的特性は、M細胞がその同族体から識別することのできる別のプロパティとして機能します。最後に、我々は多くの場合、LUを使用録音が完了したら、私たちは蛍光イメージングを使用して調査中の細胞型のしっかりした識別を行うことができます私たちの記録（細胞内）ソリューション、黄色cifer。

3.5〜4.5MΩの範囲のピペットチップ抵抗は、通常、8〜15MΩの範囲で、チップサイズと低アクセス抵抗、間の最良の妥協点である。 〜0.1ミリ秒（20から80パーセント）が倍に上昇し、約0.5秒の指数は^{、12,14,15の}減衰（ 図3Aおよび図3B）、これは、高速動態のイベントのために特に重要である。データは50〜100 kHzでデジタル化レートで取得された5〜10キロヘルツの低域通過周波数でフィルタリングされます。パッチピペットに関しては、我々は、彼らが記録を取得するためにファイアーポリッシュする必要がないことを発見したが、逸話的に、それは玄米ピペットと比較して良好なシールを得るためのわずかに良い機会を提供するために表示されます。ピペットチップが比較的大きいので、verを追加しないでくださいソリューションに入る前に、ピペットにYずっと正圧。これは、圧力が過剰にあまりにも多くのセルを移動し、シール形成を防ぐことができますように適用される正圧の適正量に決定する練習が必要です。細胞を穏やかに、元の位置からずれているように、それはまた、シナプスの接点を損傷することがあります。一方、少なすぎる圧力汚れのヒントをもたらし、優れたシールを形成するのに十分細胞の表面をきれいにしません。幸せな媒体は、唯一の重要な実践と経験によって達成される。シール形成は、ピペットに負電圧を印加したアプリケーションとを向上させることができる。私たちは通常、全細胞モードにブレークスルーのための優れている1.2-2GΩのシールを持っています。

薬理学的薬剤は、細胞の細胞質に適用する必要があるとき、私たちは前にピペットを充填する細胞内液に含める。薬剤の損失を回避するために、ピペット溶液を調製する際には注意すべきであるそれは0.22μmのフィルターに結合したことで。したがって、我々はまず、細胞内の媒体をフィルタリングしてから、慎重に濾過した溶液に薬剤を追加します。細胞内コンパートメントへの化合物の適用は課題の独自のセットを持っています。例えば、細胞内の媒体への薬物の追加は、通常、GΩシールを形成する可能性を減少しますが、ポイントには、実験への主要な障害となっていないところ。

一つは、薬剤が細胞全体の構成を開始してからセルへの即時アクセスを持っているので、このように薬理学的薬剤の適用は実験者が最も適切な制御を記録することはできませんことを認識すべきである。我々はこの種の実験全体のデータを記録しつつ、1は次善の制御は、エージェントの不活性型の細胞内アプリケーションであることを認識する必要があります。多くの場合において、これは、熱不活性化化合物の形態、スクランブルペプチドoをを取り供給業者から入手した非アクティブな異性R。

私たちは、シナプス電流（用いるMPSC）、電位依存性電流と活動電位の形式でデータを取得する。我々は、Axograph X（ジョン·クレメンツ）を使用することを好むが、ミニチュア電流は、いくつかの優れたプログラム（PCLAMP、Axographなど）によって分析することができる。 Axograph Xは、WindowsとMacintoshの両方のプラットフォーム上で動作し、電気生理学的データの収集と分析の両方に使用することができます。 mEPCs記録自体から得た実験者が選択したテンプレートを用いて取得される。個々のイベントは、我々はAxograph Xからのイベントトレースのコピーを含む、数字を生成することができますカレイダグラフ（シナジーソフトウェア）へのデータのスプレッドシートをエクスポートするなど、立ち上がり時間、振幅、半値幅および減衰時間などの特性について分析することができる

実験のより困難な側面の一つは、記録がクリーンを提供するのに十分行われたか否かを決定することである信頼性の高いデータ。例えば、スペースのクランプの問題は、大規模な軸索と豊富な樹状突起を持つM細胞からの記録用いるMPSCを生じることがある。電圧クランプは、1は、一般的に（アクセス抵抗（R _A）が低い場合は特に）合理的にピペットの先端に電圧を制御することができますが、遠く離れている樹状突起や軸索における膜電位を適切に制御することはできませれる場合があります離れてピペットチップから。細胞が適切にクランプスペースであったかどうかを決定する一つの方法は、記録された振幅対用いるMPSC立ち上がり時間の散布図を生成することである。データ間の相関性が不十分なスペースクランプを示唆する。宇宙クランプが悪いと言い換えると、ピペットに近い発生用いるMPSCイベントが離れてピペットからある程度の距離を発生するよりも立ち上がり時間と大きな振幅が迅速になります。相関が存在する場合、データは問題があり、使用することができない。

別の側面アドレス指定される必要がある電気生理学的記録のリーク電流のことである。電圧は、例えば、Na ⁺又はK ⁺電流のような電位依存性電流を記録するために、細胞をクランプする場合に特に当てはまる。膜電位は、他の部分からずれた場合、リーク電流は、電位依存性活性と一緒に記録することができる。リーク電流（I _Lが）、カリウムの組み合わせ_{（I、K）、}ナトリウム（I _Na）の非電位依存性チャネルを介した塩化物（I _Cl）の電流は、関心のある活動を不明瞭にし、レコーディングから差し引かなければならない。増幅器は、典型的には、P / Nプロトコルと呼ばれるものを実行することにより、記録中にオンラインで、この機能を実行することができる。 P / Nプロトコルの間にアンプが他の部分からいくつかの小さな脱分極（または過分極）を実行し、発生した結果、リーク電流を記録します。これは、電位依存性チャネルを活性化しない、十分に小さいパルスを使用することが重要です。現在のこれらのパルス中に発生するのを記録し、これらのリーク電流は、電位依存性チャネル活性から減算することができるように平均化される。

最後に、1を考慮に細胞内および細胞外のソリューション間の電極の先端に発生する接合電位を取る必要があります。細胞内および細胞外液は、通常、異なる活動や移動度を有する、異なるイオンで構成されています。低移動度を有する大きなイオンは小さいものよりもイオンの移動に大きな抵抗率を提供し、これは解決策の接合部に小さいが重要な電位差になることがあります。セルによって経験される適切な電圧を決定するときに、この接合部電位を考慮しなければならない。

ここで紹介するテクニックは、長年にわたって私たちの研究室で使用されるものです。しかし、M細胞からの記録の代替方法があります。最も顕著なのは、ジョセフFetchoらが開発している1は、M-細胞は背側表面¹⁶からアプローチされているここで紹介するよりも、低侵襲的に（4-5日齢）の古い幼虫のM細胞から録音することが可能な優れた準備編私たちは、同様の手法を試みたが、それが簡単に、細胞が特に稚魚（ すなわち 24 HPF HPF〜72）で、脳の表面に近い後脳の腹側からのM細胞に近づくことがわかった。さらに、背側表面からのアプローチは、通常、記録に追加の変数を導入する可能性を秘めているのM細胞に蛍光タグを発現するトランスジェニックラインを使用する必要があります。野生型の魚を使用した場合、この問題は存在しない。しかし、ここで紹介する手法では、我々は、若い動物（72 HPFに24 HPF）を勉強しに限定されている。このように、各アプローチには利点と制限があります。

スチューデントのt検定分析は、Varianの間にデータの2つのグループを比較するために使用することができるCEの（ANOVA）は、複数の群を比較するために使用することができる。ケアはノンパラメトリック·データVSパラメトリックのための適切な事後検定を選択するように注意する必要があります。