Bloccare Registrazioni patch da cellule embrionali Zebrafish Mauthner

Il protocollo sopra descritto permette di patch del record morsetto da M-cellule e suoi omologhi. La tecnica è impegnativo e la cura dovrebbe essere presa in diversi settori chiave durante tutta la procedura. Ora discuteremo alcune di queste aree e offrire suggerimenti utili per garantire il successo.

Costruzione della camera di dissezione / registrazione è un aspetto critico dell'esperimento. L'M-cellule sono difficili da vedere se non viene utilizzato il contrasto di interferenza differenziale. Nomarski DIC funziona meglio con vetrini pulito, ma abbiamo trovato che uno strato molto sottile di Sylgard (~ 1-2 mm) non distorcere il DIC a tal punto che interferisce con l'identificazione delle M-cellule. Pertanto, si usa una camera di registrazione che ha un vetrino di vetro sottile sul fondo su cui viene applicato un piccolo rondella di plastica (~ 5 mm di diametro). Mescoliamo Sylgard 184 in una capsula di Petri e aggiungere cautamente Sylgard liquido all'interno della rondella con una pipetta Pasteur. La Sylgard può essere curata a temperatura ambiente per un paio di giorni o può essere riscaldato per la rapida polimerizzazione. La rondella può essere rimosso dopo l'Sylgard è indurita, anche se questo non è necessario. Una volta effettuata la camera di dissezione / registrazione, può essere utilizzato per diverse settimane prima che sia necessario un nuovo Sylgard rivestita di vetro scorrevole.

Il passo successivo della procedura è di recuperare tutte le soluzioni pertinenti sul giorno dell'esperimento (Tabella 3). Soluzioni intracellulari contenenti tutto ma ATP e GTP sono anticipati e conservati in 5 ml aliquote a -20 ° C. Il giorno di registrazione un'aliquota è scongelata a temperatura ambiente e ATP fresco e viene aggiunto GTP. La soluzione viene regolato a 280 mOsm e pH 7,4. Nelle nostre mani, troviamo che l'aggiunta di ATP fresco e GTP su un quotidiano risultati di base in buone registrazioni. Tutte le soluzioni devono essere conservati sterile per la migliore possibilità di successo.

Le soluzioni intracellulari devono essere filtrati througah 0,22 micron filtro (Sigma) per rimuovere piccole particelle e detriti che potrebbero influenzare la registrazione. Per fare questo, dobbiamo prima disegnare la soluzione intracellulare in una siringa da 1 ml, applicare il filtro alla fine della siringa e aggiungere una punta della pipetta di plastica che era riscaldata e tirato a punta fine, fino alla fine del filtro. Ciò ci permette di applicare la soluzione intracellulare filtrata direttamente all'interno delle pipette patch di vetro.

Una volta che le soluzioni sono preparate, l'embrione può essere anestetizzato e sezionato. Prima della dissezione, occorre prestare attenzione per valutare adeguatamente l'età dell'organismo. Ogni embrione all'interno di un età frizione ad un tasso leggermente diversa. Pertanto nel valutare l'età dell'organismo è importante farlo secondo procedure stabilite ^10,13, utilizzando i riferimenti fenotipici quali il numero di somiti, la forma complessiva del corpo e il tempo di fecondazione dell'uovo. Tutte le dissezioni sono eseguite con una Dumont # 5 bel paio dipinze. Questi devono essere forte e in buone condizioni altrimenti sarà molto difficile da rimuovere la pelle sovrapponendo hindbrain e qualsiasi tessuto connettivo sulla superficie ventrale del cervello posteriore. Spesso dobbiamo affinare le pinze dopo poche settimane di utilizzo, e farlo noi stessi con una pietra affilatura.

Per bloccare il pesce per il sottile strato di sylgard, usiamo spilli modellati dalla sottile filo di tungsteno 0,001 pollici di diametro. I perni sono tagliate con un vecchio, forbici micro-dissezione sotto un microscopio da dissezione, e sono abbastanza piccolo da stare a destra attraverso la notocorda. Pinning gli embrioni in qualsiasi altro punto non immobilizzare le dissezioni e rende quasi impossibile da eseguire. Quando prima imparare effettuare le registrazioni, può essere difficile all'identità M-cella da suoi omologhi (particolarmente MiD2 cm, che si trova nella rhombomere vicina – rhombomere 5). In alcuni embrioni queste due coppie di celle appaiono di dimensioni simili. Il otoliti pronire un punto di riferimento comodo per facilitare l'identificazione delle cellule M. Al 48 HPF le cellule M sono situati direttamente ai otoliti, e anche se i otoliti vengono rimossi durante la dissezione, essi lasciano una zona laterale leggermente danneggiato del hindbrain, che serve come un marcatore per la loro posizione originale. Pesci transgenici che esprimono GFP o qualche altro marcatore fluorescente in cellule M, offrono eccellenti preparativi per i nuovi sperimentatori. Nelle nostre mani le cellule M hanno una capacità di membrana di circa 18-24 pF a 48 HPF, mentre gli omologhi più piccoli sono più vicini al 12-14 pF. Celle con maggiore superficie hanno grandi valori di capacità di membrana (misurato in Farad Pico (PF)) rispetto alle celle più piccole. Così, capacità di membrana può essere utilizzato come un indicatore approssimativo della dimensione cellulare, in cui le cellule più grandi hanno valori di capacità più grandi. Questa caratteristica elettrofisiologica serve come un'altra proprietà per cui la cellula M può essere identificato dai suoi omologhi. Infine, usiamo spesso LuCifer giallo nella nostra soluzioni (intracellulari), che ci permette di condurre una ditta di individuazione del tipo di cellula in esame con imaging di fluorescenza una volta le registrazioni sono complete di registrazione.

Resistenze punta della pipetta nel range di 3,5-4,5 mW sono il miglior compromesso tra dimensioni della punta e bassa resistenza di accesso, che varia tipicamente tra 8 e 15 mW. Ciò è particolarmente importante per gli eventi con cinetica veloce; ~ 0,1 msec (20-80%) aumentano volte e ~ 0,5 msec decadimenti esponenziali ^12,14,15 (Figure 3A e 3B). Dati sono acquisiti a un tasso digitalizzazione di 50-100 kHz e filtrato con una bassa frequenza di passaggio di 5-10 KHz. Per quanto riguarda le pipette di patch, abbiamo trovato che non hanno bisogno di essere lucidati a fuoco per ottenere una registrazione, ma anecdotally, sembra offrire leggermente migliore possibilità di ottenere buone guarnizioni rispetto pipette non lucidate. Dal momento che i puntali delle pipette sono relativamente grandi, noi non aggiungiamo very pressione molto positiva alla pipetta prima di entrare nella soluzione. Ci vuole pratica decidere la giusta quantità di pressione positiva di applicare come un eccesso di pressione si sposta la cella troppo, e impedirà la formazione di sigillo. Essa può anche danneggiare contatti sinaptici come la cella viene delicatamente spostato dalla sua posizione originale. D'altra parte, troppo poco risultati pressione in consigli sporchi e non pulisce la superficie della cellula abbastanza bene per formare buone guarnizioni. Una via di mezzo si ottiene solo con la pratica e l'esperienza significativa. Formazione sigillo può essere migliorata con applicazioni di tensioni negative alla pipetta. Noi di solito abbiamo sigilli di 1,2-2 GΩ, che sono eccellenti per le innovazioni nella modalità a cellula intera.

Quando agenti farmacologici devono essere applicati al citoplasma cellulare, li includiamo nella soluzione intracellulare prima del riempimento della pipetta. Si deve prestare attenzione durante la preparazione delle soluzioni pipetta per evitare la perdita degli agentifacendolo legano al filtro di 0,22 micron. Pertanto, filtriamo il mezzo intracellulare prima, e poi aggiungere con cautela l'agente farmacologico alla soluzione filtrata. Applicazione di composti al compartimento intracellulare ha una propria serie unica di sfide. Per esempio, aggiunta di farmaci al mezzo intracellulare solito riduce le probabilità di formare un sigillo GΩ, ma non al punto dove è un notevole ostacolo per l'esperimento.

Si dovrebbe comprendere che l'applicazione di agenti farmacologici in questo modo non permette lo sperimentatore per registrare il controllo più adeguato in quanto l'agente ha accesso immediato alla cella dall'inizio della configurazione di cellula intera. Pertanto, mentre registriamo i dati in questo tipo di esperimento, si deve essere consapevoli che il prossimo controllo migliore è l'applicazione intracellulare di una forma inattiva dell'agente. In molti casi questa assume la forma di un composto inattivato al calore, un peptide o criptator un isomero attivo ottenuto dal fornitore.

Noi acquistiamo i dati in forma di correnti sinaptiche (MPSCS), correnti voltaggio-dipendenti e potenziali d'azione. Correnti in miniatura possono essere analizzati da un paio di ottimi programmi (PClamp, Axograph, ecc), anche se noi preferiamo usare Axograph X (John Clements). Axograph X gira su entrambe le piattaforme Windows e Macintosh e può essere utilizzato sia per l'acquisizione e l'analisi dei dati elettrofisiologici. mEPCs vengono acquisiti con l'ausilio di un modello di scelta dello sperimentatore, ottenuto dalla registrazione stessa. Singoli eventi possono essere analizzati per le proprietà come tempo di salita, l'ampiezza, la metà di larghezza e degrado del tempo, ecc Esportiamo il foglio di dati Kaleidagraph (Synergy Software) dove possiamo produrre figure, tra cui copie di tracce di eventi da Axograph X.

Uno degli aspetti più difficili della dell'esperimento è determinare se la registrazione è stata eseguita abbastanza bene per fornire pulito,dati affidabili. Ad esempio, possono sorgere problemi di spazio bloccaggio durante la registrazione di MPSCS dalla M-cellule che hanno grandi assoni e ampi processi dendritiche. Quando la tensione di bloccaggio, si può generalmente controllare la tensione sulla punta della pipetta ragionevolmente bene (soprattutto se la resistenza di accesso (R _a) è bassa), ma non può avere un adeguato controllo del potenziale di membrana in processi dendritici o assoni che sono molto lontano dalla punta della pipetta. Un metodo per determinare se la cella è stata adeguatamente spazio serrato è di produrre un diagramma a dispersione del tempo di salita vs l'ampiezza delle MPSCS che sono stati registrati. Una correlazione tra i dati è indicativa di spazio insufficiente serraggio. In altre parole, se il morsetto spazio è scarso allora MPSCS che si verificano in prossimità della pipetta avranno volte più veloce e maggiori ampiezze di eventi che si verificano una certa distanza dalla pipetta fanno. Se una correlazione esiste, allora i dati è problematico e non può essere utilizzato.

Un altro aspettodi registrazioni elettrofisiologiche che deve essere affrontato è quello delle correnti di fuga. Ciò è particolarmente vero quando la tensione di serraggio una cella per registrare correnti voltaggio-dipendenti quali Na ⁺ o K ⁺ correnti. Quando il potenziale di membrana viene deviato dal resto, correnti di fuga possono essere registrati con attività voltaggio-dipendenti. Correnti di fuga (I _L), una combinazione di potassio _(K I), sodio (I _Na) e cloruro (I _Cl) corrente attraverso i canali non-voltaggio-dipendenti potranno oscurare l'attività di interesse e devono essere sottratti dalla registrazione. L'amplificatore è in grado di svolgere questa funzione in linea durante la registrazione eseguendo quello che viene tipicamente chiamato un protocollo P / N. Durante un protocollo P / N l'amplificatore verrà eseguito diversi piccoli depolarizzazioni (o hyperpolarizations) da fermo e registrerà l'attuale perdita risultante che si verifica. E 'importante utilizzare piccoli abbastanza impulsi che non attivano canali voltaggio-dipendenti. L'attuales che si verificano durante questi impulsi vengono registrati e una media in modo che queste correnti di fuga possono essere sottratti dalla attività dei canali voltaggio-dipendenti.

Infine, bisogna tener conto del potenziale di giunzione, che si verifica sulla punta dell'elettrodo tra intracellulari ed extracellulari soluzioni. Le soluzioni intracellulari ed extracellulari sono in genere composti da diversi ioni, con attività diverse e mobilità. Ioni più grandi con mobilità inferiore offrirà una maggiore resistività al movimento di ioni di quelli piccoli e questo può portare a una piccola ma significativa differenza di potenziale a livello della giunzione delle soluzioni. Questo potenziale di giunzione deve essere preso in considerazione per determinare le tensioni appropriate incontrate dalla cella.

La tecnica qui presentata è quello usato dal nostro laboratorio per molti anni. Tuttavia, ci sono metodi alternativi per la registrazione della cellula M. Più in particolare, Joseph Fetcho e colleghi hanno sviluppareed una preparazione eccellente in cui si può registrare dagli M-cellule di larve di età superiore (4-5 giorni) in maniera meno invasiva rispetto a quella presentata qui, dove la cellula M viene avvicinato dalla superficie dorsale ^16. Avevamo cercato una tecnica simile ma trovato più facile avvicinarsi al-cellula M dal lato ventrale del cervello posteriore, in cui la cellula è più vicino alla superficie del cervello, in particolare novellame (cioè 24 HPF a 72 HPF). Inoltre, un approccio dalla superficie dorsale solitamente necessario l'utilizzo di una linea transgenica che esprime un tag fluorescente in cellule M, che ha il potenziale di introdurre ulteriori variabili nella registrazione. Questo problema non è presente quando si utilizza tipo di pesce selvatico. Tuttavia, con la tecnica qui presentata, ci siamo limitati a studiare gli animali più giovani (24 HPF a 72 HPF). Così, ogni approccio ha i suoi vantaggi e limitazioni.

T-test di Student può essere utilizzata per confrontare due gruppi di dati, mentre una analisi di Variance (ANOVA) può essere utilizzata per confrontare più gruppi. Bisogna fare attenzione a scegliere il test post-hoc appropriato per parametrica vs dati non parametrici.