Grampo patch Gravações de Embryonic Cells Zebrafish Mauthner
Summary
Nós desenvolvemos uma preparação cordão intacto cérebro espinhal para gravar e monitorar a atividade elétrica através de patches gravação braçadeira dos neurônios e outras células Mauthner reticulospinais em embriões de peixe-zebra. Assim, somos capazes de gravar correntes sinápticas excitatórias e inibitórias, a atividade do canal voltagem-dependentes e potenciais de ação dos neurônios-chave em um embrião em desenvolvimento.
Abstract
Células Mauthner (células-M) são grandes neurônios reticulospinais localizados na parte posterior do cérebro de peixes teleósteos. Eles são neurónios chave envolvidas em um comportamento característico conhecido como a resposta C-iniciar ou escapar que ocorre quando o organismo percebe uma ameaça. A células M tem sido extensivamente estudada em peixinho adulto, onde foi demonstrado para receber uma vasta gama de excitatório, sinais inibitórios e neuromoduladores 1. Temos vindo a analisar a atividade das células M no peixe-zebra embrionário, a fim de estudar os aspectos do desenvolvimento sináptica em uma preparação de vertebrados. No final de 1990 Ali e seus colegas desenvolveram uma preparação para patch clamp gravação de M-células em embriões de peixe-zebra, em que o CNS era 2,3,4 grande parte intactos. O objetivo na época era para gravar a atividade sináptica dos neurônios rombencéfalo, neurônios da medula espinhal e do tronco do músculo esquelético, mantendo conexões sinápticas funcionais dentro de uma preparação intacto cabo-cérebro espinhal.Esta preparação é usada ainda hoje em nosso laboratório. Para examinar os mecanismos subjacentes a plasticidade sináptica de desenvolvimento, nós gravamos excitatório (AMPA e NMDA mediada) 5,6 e inibitórios (GABA) e glicina correntes sinápticas de desenvolvimento de células-M. Mais importante, esta preparação única permite voltar à mesma célula (células M) de preparação para preparação para examinar cuidadosamente plasticidade sináptica e neuro-desenvolvimento de um organismo embrionário. Os benefícios proporcionados por esta preparação incluem 1) intacto, as conexões sinápticas funcionais para as células M, 2) preparações relativamente baratas, 3) um grande fornecimento de embriões prontamente disponíveis 4) a capacidade de retornar para o mesmo tipo de células (isto é, M- de células) em toda a preparação, de modo que o desenvolvimento sináptica ao nível de uma célula individual pode ser analisada a partir de peixe de peixes, e 5) de imagens das preparações inteiros, devido à natureza transparente dos embriões.
Introduction
Uma das questões pendentes na neurobiologia do desenvolvimento diz respeito ao papel dos fenômenos de plasticidade sináptica durante a maturação sináptica. Nossa pesquisa se concentra na compreensão dos mecanismos de plasticidade sináptica que fundamentam o desenvolvimento com um objectivo global de compreensão do comportamento animal no contexto do desenvolvimento sináptico. A fim de fazer isso, desenvolvemos uma preparação praticamente intacto em um organismo (peixe-zebra, Danio rerio), que ganhou força considerável para estudos de desenvolvimento na década de 1990.
O peixe-zebra oferece diversas vantagens para os estudos do desenvolvimento neurológico. Por exemplo, seu genoma é sequenciada e pode-se realizar knockdowns morpholino e nocautes zinc-finger nuclease para silenciar a atividade do gene e expressão da proteína. Pode-se também realizar estudos de superexpressão e linhagens transgênicas podem ser construídos 7-9. Os embriões são relativamente fáceis e abundantes para adquirir ea natureza transparente do embrião se presta bem a imagem e estudos opto-genética. Além disso, a análise comportamental pode ser realizada, e experimentos eletrofisiológicos pode ser realizada em fibras musculares, neurônios da medula espinhal e neurônios rombencéfalo em organismos em grande parte intactos, permitindo que se possa examinar a função celular in vivo. É importante ressaltar que somos capazes de examinar a atividade sináptica em não apenas a mesma classe de celular, mas no mesmo par de neurônios, de preparação para a preparação. Em outras palavras, esta é uma das preparações de vertebrados raros em que se pode voltar para o mesmo neurónio, in situ, para estudar o seu desenvolvimento.
A fim de manter o circuito neuronal tão viáveis quanto possível, nós desenvolvemos uma preparação na qual a parte posterior do cérebro e da medula espinhal foram deixadas intactas, enquanto o adesivo de fixação das células-M. Nesta preparação, dos olhos, do maxilar e da pele que cobre o cérebro são cuidadosamente removidos e a parte posterior do cérebro é peeled longe da notocorda, permitindo o acesso à superfície ventral do cérebro posterior. Os neurônios reticulospinais estão localizados a poucos micrômetros de profundidade e são relativamente de fácil acesso. Às 48 horas pós fecundação (hpf, algumas abreviaturas estão listadas na Tabela 1) as células são compactos eletricamente e pode-se registrar fielmente atividade sináptica (ambos excitatórios e inibitórios correntes), as correntes dependentes da voltagem e potenciais de ação a partir deles.
Nossos resultados sugerem que muitos aspectos do desenvolvimento e maturação sináptica ocorrer no 24 horas antes da eclosão, e, portanto, grande parte da nossa atenção está focada em organismos com idade variando de 24 a 72 hpf hpf. No entanto, por 72 hpf, células M são menos electricamente compacta e são difíceis de serem adequadamente braçadeira espaço. A técnica pode ser utilizada para gravar não apenas a partir das células M, mas também a partir dos seus homólogos, Mid2 cm e MiD3 cm. Teoricamente, pode-se também efectuar gravações dupla, a partir de um spneurônio cabo inal como um neurônio motor primário e pela célula-M, mas isso é difícil e pode-se argumentar que os benefícios obtidos com uma técnica tão difícil pode não valer a pena o esforço extraordinário que é necessário.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo descrito acima permite corrigir ficha de fixação das células M e os seus homólogos. A técnica é um desafio e deve ser tomado cuidado em várias áreas-chave em todo o processo. Vamos agora discutir algumas dessas áreas e vai oferecer dicas úteis para garantir o sucesso.
A construção da câmara de dissecação / gravação é um aspecto crítico da experiência. As células M são difíceis de ver, a menos que de contraste de interferência diferencial é usado. Nomarski DIC funciona melhor com lamelas de vidro limpo, mas verificou-se que uma camada muito fina de Sylgard (~ 1-2 mm), não irá falsear o DIC, de tal forma que ela interfere com a identificação das células-M. Por isso, usamos uma câmara de gravação que tem uma lamela de vidro fina no fundo sobre o qual é colocada uma pequena arruela de plástico (~ 5 mm de diâmetro). Misturamos Sylgard 184 em uma placa de Petri e adicionar cuidadosamente o Sylgard líquido para o interior da máquina de lavar com uma pipeta de Pasteur. A Sylgard pode ser curada a temperatura ambiente ao longo de um par de dias ou podem ser aquecidos para a cura rápida. A anilha pode ser removido após a Sylgard tenha curado, embora isso não seja necessário. Uma vez que a câmara de dissecção / gravação foi feita, ele pode ser usado por várias semanas antes de ser necessária uma forrada de Sylgard fresco slide.
O próximo passo no processo é fazer-se todas as soluções relevantes sobre o dia do experimento (Tabela 3). As soluções intracelulares contendo tudo excepto o ATP e GTP são feitas com antecedência e guardadas em 5 mL de alíquotas a -20 ° C. No dia da gravação de uma alíquota é descongelado à temperatura ambiente e o ATP e GTP fresco é adicionado. A solução é ajustada a 280 mOsm e pH de 7,4. Em nossas mãos, nós achamos que a adição de ATP e GTP fresco em uma base diária resulta em boas gravações. Todas as soluções precisam ser mantidos estéril para a melhor chance de sucesso.
Soluções intracelulares deve ser filtrada througha 0,22 filtro mM (Sigma) para remover pequenas partículas e detritos que possam afetar a gravação. Para fazer isso, em primeiro lugar introduzir a solução intracelular para uma seringa de 1 ml, apor o filtro para a extremidade da seringa e adicionar uma ponta de pipeta de plástico que foi aquecida e puxada para ponta fina, para a extremidade do filtro. Isto permite aplicar a solução intracelular filtrada directamente para o interior das pipetas remendo vidro.
Uma vez que as soluções são preparados, o embrião pode ser anestesiados e dissecados. Antes do esvaziamento, deve ser tomado cuidado para avaliar adequadamente a idade do organismo. Cada embrião dentro de idades de embreagem a uma taxa ligeiramente diferente. Portanto, quando se avalia a idade do organismo, é importante fazê-lo de acordo com procedimentos estabelecidos 10,13, utilizando pistas fenotípicas, tais como o número de somitos, a forma geral do corpo e o tempo de fertilização do ovo. Todas as dissecções são realizadas com uma Dumont # 5 belo par defórceps. Estes precisam ser nítidas e em bom estado de funcionamento caso contrário, será muito difícil de remover a pele que cobre a parte posterior do cérebro e todo o tecido conjuntivo na superfície ventral do cérebro posterior. Muitas vezes temos de aguçar a pinça depois de algumas semanas de uso, e fazer isso nós mesmos com uma pedra de amolar.
Para fixar o peixe para a fina camada de Sylgard, usamos pinos formado a partir de fio de tungstênio fino 0,001 polegadas de diâmetro. Os pinos são cortados com uma velha tesoura micro-dissecção sob um microscópio de dissecação, e são pequenos o suficiente para caber a direita através da notocorda. Fixando os embriões em qualquer outro ponto não imobilizá-los e faz dissecções quase impossível de executar. Quando primeiro aprender a efectuar as gravações, pode ser difícil para a identidade da célula H a partir dos seus homólogos (particularmente Mid2 cm, que está localizado na rhombomere vizinha – rhombomere 5). Em alguns embriões esses dois pares de células parecem semelhantes em tamanho. O pró otólitosvide um marco conveniente para ajudar na identificação de células-M. Aos 48 anos de HPF as células-M estão localizados ao lado dos otólitos, e mesmo que os otólitos são removidos durante a dissecção, eles deixam para trás uma região lateral ligeiramente danificada do cérebro posterior, que serve como um marcador para a sua posição original. Peixes transgénicos que expressam GFP ou algum outro marcador fluorescente na célula M, proporcionam excelentes preparativos para novos pesquisadores. Nas nossas mãos, as células M tem uma capacitância de membrana de cerca de 18-24 a 48 pF hpf, enquanto que os seus homólogos mais pequenos estão mais próximos 12-14 pF. As células com maior área de superfície têm maiores valores de capacitância de membrana (medidos em Farads pico (PF)) em comparação com células menores. Assim, a capacitância de membrana pode ser utilizado como um indicador aproximado de tamanho da célula, onde as células maiores têm valores de capacitância de maiores dimensões. Esta característica electrofisiológico serve como uma outra propriedade através da qual a célula-M podem ser identificados a partir dos seus homólogos. Finalmente, muitas vezes usamos Lucifer amarelo em nossa gravação soluções (intracelulares), o que nos permite realizar uma identificação firme do tipo de célula sob investigação usando imagens de fluorescência, uma vez gravações estão completos.
Resistências ponta da pipeta na faixa de 3,5-4,5 mohms são o melhor compromisso entre o tamanho da ponta e de baixa resistência de acesso, a qual geralmente varia de 8 a 15 mohms. Isto é particularmente importante para os eventos com cinética rápida; ~ 0,1 mseg (20-80%) dos tempos de subida e de ~ 0,5 mseg exponencial decai 12,14,15 (Figuras 3A e 3B). Os dados são adquiridos a uma taxa de digitalização de 50-100 kHz e filtrado com uma frequência de passagem baixa de 5-10 KHz. Com relação às pipetas de patch, descobrimos que eles não precisam de ser para obter uma gravação de fogo-polido, mas informalmente, parece oferecer um pouco melhor chance de obter bons selos comparação com pipetas sem polimento. Desde a ponta da pipeta são relativamente grandes, não adicione very pressão muito positiva para a pipeta antes de entrar na solução. Leva prática decidir sobre a quantidade apropriada de pressão positiva a aplicar como um excesso de pressão irá mover a célula demais, e irá impedir a formação de selo. Também pode danificar os contactos sinápticos que a célula é suavemente deslocado da sua posição original. Por outro lado, muito pouco pressão resulta em pontas sujas e não limpa a superfície da célula bem o suficiente para formar bons vedantes. Um meio termo só é alcançado pela prática e experiência significativa. Formação de selo pode ser reforçada com aplicações de tensões negativas para a pipeta. Nós normalmente têm selos de 1.2-2 GÊ, que são excelentes para avanços no modo de células inteiras.
Quando os agentes farmacológicos precisa ser aplicada para o citoplasma da célula, que incluí-los na solução intracelular antes de encher a pipeta. Cuidados devem ser tomados na preparação das soluções de pipeta para evitar a perda dos agentespor ter que se ligar ao filtro de 0,22 um. Portanto, nós filtrar o meio intracelular primeiro, e depois adicionar cuidadosamente o agente farmacológico para a solução filtrada. Aplicação de compostos para o compartimento intracelular tem seu próprio conjunto de desafios. Por exemplo, a adição de drogas ao meio intracelular geralmente reduz a possibilidade de formação de uma vedação GÊ, mas não a tal ponto que é um obstáculo importante para a experiência.
Deve-se perceber que a aplicação de agentes farmacológicos desta maneira não permite que o experimentador para gravar o controle mais adequado uma vez que o agente tem acesso imediato à célula a partir do início da configuração da célula inteira. Portanto, enquanto gravamos dados em todo este tipo de experiência, é preciso estar ciente de que a próxima melhor controle é a aplicação intracelular de uma forma inativa do agente. Em muitos casos, esta assume a forma de um composto inactivado pelo calor, um péptido o mexidosr um isómero inactivo obtida a partir do fornecedor.
Adquirimos dados na forma de correntes sinápticas (mPSCs), correntes dependentes da voltagem e potenciais de ação. Diminutas correntes podem ser analisados por alguns excelentes programas (PClamp, Axograph, etc), apesar de preferirmos usar Axograph X (John Clements). Axograph X roda em plataformas Windows e Macintosh e pode ser utilizado tanto para a aquisição e análise de dados eletrofisiológicos. mEPCs são adquiridos com o auxílio de um modelo de escolha do experimentador, obtido a partir da gravação propriamente dita. Eventos individuais podem ser analisadas para propriedades como tempo de subida, amplitude, largura a meia altura e deterioração do tempo, etc Nós exportamos a planilha de dados para Kaleidagraph (Synergy Software), onde nós podemos produzir figuras, incluindo cópias de traços de eventos de Axograph X.
Um dos aspectos mais difíceis do experimento é determinar se a gravação foi realizada bem o suficiente para fornecer limpo,dados confiáveis. Por exemplo, as questões de fixação de espaço podem surgir durante a gravação mPSCs da M-células que têm grandes axônios e extensos processos dendríticos. Quando fixação de tensão, pode-se geralmente controlar a tensão na ponta da pipeta razoavelmente bem (especialmente se a resistência de acesso (Ra) é baixo), mas podem não ter um controlo adequado do potencial de membrana em processos dendríticos ou axónios que estão longe distância a partir da ponta da pipeta. Um método para determinar se a célula foi devidamente apertado espaço é para produzir uma dispersão no tempo de subida contra a amplitude dos mPSCs que foram gravados. A correlação entre os dados são sugestivos de aperto espaço inadequado. Em outras palavras, se o grampo do espaço é fraca então mPSCs que ocorrem perto da pipeta terá mais rápida dos tempos de subida e amplitudes maiores do que os eventos que ocorrem a alguma distância a partir da pipeta. Se a correlação existe, então os dados são problemáticos e não pode ser utilizado.
Outro aspectode registros eletrofisiológicos que precisa ser abordado é o de correntes de fuga. Isto é especialmente verdadeiro quando a tensão de aperto de uma célula a fim de gravar correntes dependentes da voltagem, tais como Na + ou K + correntes. Quando o potencial de membrana é desviada de resto, as correntes de fuga podem ser gravados, juntamente com atividade voltagem-dependentes. A corrente de fuga (I L), uma combinação de potássio (I K), sódio (Na) e eu cloreto (Cl I) Corrente através de canais não-dependentes de voltagem vai obscurecer a actividade de interesse e deve ser subtraído da gravação. O amplificador é capaz de realizar essa função on-line durante a gravação, executando o que é normalmente chamado de um protocolo P / N. Durante um protocolo P / N do amplificador será executado várias pequenas despolarizações (ou hiperpolarizações) de descanso e vai gravar o atual vazamento resultante que ocorre. É importante a utilização de pequenos pulsos suficientes que não activam canais dependentes da voltagem. O actuals que ocorrem durante estes impulsos são registados com uma média de modo a que estas correntes de vazamento pode ser subtraída da actividade de canal de acesso por voltagem.
Finalmente, é preciso ter em conta o potencial de junção, que ocorre na ponta do eléctrodo entre o intracelular e soluções extracelulares. Soluções intracelulares e extracelulares são tipicamente compostos de íons diferentes, com diferentes atividades e mobilidades. Íons maiores, com mobilidades inferiores irá oferecer uma maior resistividade para movimento de iões do que as partículas menores, pode resultar numa diferença de potencial pequeno mas significativo, na junção das soluções. Este potencial de junção deve ser levado em conta ao determinar as tensões apropriadas experimentadas pelo celular.
A técnica aqui apresentada é utilizada por nosso laboratório há muitos anos. No entanto, existem métodos alternativos de gravação da célula-M. Mais notavelmente, Joseph Fetcho e colegas desenvolvered uma excelente preparação em que se pode gravar a partir das células-M de larvas mais velhas (4-5 dias de idade) de uma forma menos invasiva do que aqui, onde a célula-M é abordado a partir da superfície dorsal 16 apresentaram. Nós tínhamos tentado uma técnica semelhante, mas achei mais fácil de se aproximar da de células M do lado ventral do cérebro posterior, onde a célula é mais perto da superfície do cérebro, particularmente em peixes jovens (ou seja, 24 a 72 hpf hpf). Por outro lado, uma aproximação a partir da superfície dorsal geralmente requer o uso de uma linha transgénica que expressa um marcador fluorescente na célula-M, que tem o potencial para introduzir variáveis adicionais no registo. Esta questão não está presente ao usar o tipo de peixe selvagem. No entanto, com a técnica aqui apresentada, que se limitam a estudar os animais mais jovens (24 a 72 hpf HPF). Assim, cada abordagem tem suas vantagens e limitações.
Teste t de Student, pode ser utilizado para comparar dois grupos de dados, enquanto a análise da Variance (ANOVA) pode ser usado para comparar os vários grupos. Cuidados devem ser tomados para escolher o teste post-hoc apropriado para paramétrico vs dados não paramétricos.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado por subsídios da Ciências Naturais e Engenharia do Conselho de Pesquisa do Canadá (NSERC) e da Fundação Canadense para Inovação (TPI) para DWA.
Materials
| Equipment Name | Company | Catalogue Number |
| Dissecting Dish | Warner Instruments | 64-0291 |
| 0.001″ Tungsten Wire | Scientific Instruments Services Inc. | W406 |
| Dissecting microscope | Leica Microsystems | MZ9.5 |
| Pipette Puller | Sutter Instruments Co. | P-97 |
| Microforge | Narishige Group | MF-900 |
| Upright Patch clamp microscope | Leica Microsystems | DMLFSA |
| Micromanipulator | Siskiyou Inc. | MX7500 |
| Digidata | Molecular Devices | 1322A |
| Amplifier | Molecular Devices | 200B |
| Acquisition software | Molecular Devices | pClamp9 |
| Axograph X | Axograph | Axograph X |
References
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