Summary

Imágenes en tiempo real de heterotypic plaquetas neutrófilos Interacciones en el endotelio activado durante la inflamación vascular y la formación de trombos en ratones vivos

Published: April 02, 2013
doi:

Summary

Aquí se presenta una técnica experimental de microscopía intravital de fluorescencia para visualizar heterotípicas plaquetas neutrófilos interacciones en el endotelio activado durante la inflamación vascular y la formación de trombos en ratones vivos. Esta tecnología microscópica será valiosa para estudiar el mecanismo molecular de la enfermedad vascular y para poner a prueba los agentes farmacológicos bajo condiciones fisiopatológicas.

Abstract

La interacción de las plaquetas activadas y leucocitos (principalmente neutrófilos) en el endotelio activado trombosis media y la inflamación vascular. 1,2 Durante la formación de un trombo en el sitio de la lesión arteriolar, las plaquetas adherentes al endotelio activado y proteínas subendoteliales matriz de soporte de rodadura de neutrófilos y la adherencia. 3 A la inversa, bajo venulares condiciones inflamatorias, neutrófilos adherentes al endotelio activado puede soportar la adhesión y acumulación de plaquetas circulantes. Heterotípicos plaquetas agregación de neutrófilos requiere procesos secuenciales por las interacciones con los receptores específicos de receptor-contador entre las células. 4 Se sabe que las células endoteliales activadas liberan moléculas de adhesión tales como el factor de von Willebrand, iniciando así la adhesión de las plaquetas y la acumulación bajo condiciones de alto cizallamiento. 5 Además, células endoteliales activadas soporte rodante de neutrófilos y la adhesión por selectinas que expresan unmolécula-1 d adhesión intercelular (ICAM-1), respectivamente, en condiciones de bajo cizallamiento. 4 de plaquetas P-selectina interactúa con los neutrófilos a través de P-selectina glicoproteína ligando-1 (PSGL-1), induciendo de ese modo la activación de neutrófilos β2 integrinas y firmes adhesión entre dos tipos de células. A pesar de los avances en los experimentos in vitro en el que heterotípicas plaquetas neutrófilos interacciones se determinan en sangre entera o de células aisladas, 6,7 esos estudios no se pueden manipular las condiciones de estrés oxidativo durante la enfermedad vascular. En este informe, utilizando marcadas con fluorescencia, anticuerpos específicos contra un ratón de plaquetas y neutrófilos marcador, se describe un protocolo detallado intravital microscópico para monitorear las interacciones heterotípicas de plaquetas y neutrófilos sobre el endotelio activado durante TNF-α inducida por inflamación o por láser inducida lesión del músculo cremáster en microvasos de ratones vivos.

Protocol

1. Preparación de microscopio intravital (Figura 1A) Preparar tampón superfusión (125 mM NaCl, 4,5 mM KCl, 2,5 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2, y 17 mM NaHCO 3, pH 7,4). Girar en un baño de agua circulatorio para mantener la temperatura de tampón y una manta termo controlada a 37 ° C. Airear tampón con gas nitrógeno (5% de CO 2 en equilibrio con nitrógeno). Encienda el sistema de microscopio (Sutter Lambda DG-4 de alta velocidad longitud de onda …

Representative Results

Usando un análisis detallado microscopía intravital, heterotípicas plaquetas neutrófilos interacciones en el endotelio activado se visualizaron mediante la infusión de anticuerpos marcadas con fluorescencia contra una de plaquetas (CD42c) o neutrófilos marcador (Gr-1) en ratones vivos. En un modelo de TNF-α inducida por inflamación venular, neutrófilos más de rodadura se adhirieron de forma estable al endotelio presumiblemente por la interacción de las integrinas β2 activados con…

Discussion

Aquí se describe un protocolo detallado para tiempo real microscopía de fluorescencia intravital para visualizar heterotípicas plaquetas neutrófilos interacciones en el endotelio activado durante la inflamación vascular y trombosis. Anteriormente, los enfoques similares microscópicas de fluorescencia se registraron para estudiar el mecanismo molecular de la formación de trombo y la inflamación vascular. 8,12 Desde el heterotípicos interacción célula-célula podría ser importante para la oclusión …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud (P30 HL101302 y RO1 HL109439 a JC) y la American Heart Association (SDG 5270005 a JC). A. Barazia fue apoyado por una beca de formación T32HL007829 NIH.

Materials

Name of Reagent/Material Company Catalog Number Comments
NaCl Fisher Scientific 7647-14-5  
KCl Sigma-Aldrich 7447-40-7  
CaCl2 2H2O Sigma-Aldrich 10035-04-8  
MgCl2 6H2O Fisher Scientific 7791-18-6  
NaHCO3 Fisher Scientific 144-55-8  
0.9% NaCl Saline Hospira 0409-4888-10  
Ketamine Hospira 0409-2051-05  
Xylazine Lloyd    
Intramedic Tubing (PE 90) BD Diagnostics 427421  
Intramedic Tubing (PE 10) BD Diagnostics 427401  
Murine TNF-α R&D Systems 410-MT  
Dylight 488- labeled rat anti-mouse CD42b antibody Emfret Analytics X488  
Alexa Fluor 647-conjugated anti-mouse Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) Antibody BioLegend 108418  
NESLAB EX water bath/circulator Thermo-Scientific    
Olympus BX61W microscope Olympus    
TH4-100 Power Olympus    
Lambda DG-4 Sutter    
MPC-200 multi-manipulator Sutter    
ROE-200 stage controller Sutter    
C9300 high-speed camera Hamamatsu    
Intensifier Video Scope International    
Ablation Laser Photonic Instruments, Inc.    
SlideBook 5.0 Intelligent Imaging Innovations    

References

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Cite This Article
Kim, K. H., Barazia, A., Cho, J. Real-time Imaging of Heterotypic Platelet-neutrophil Interactions on the Activated Endothelium During Vascular Inflammation and Thrombus Formation in Live Mice. J. Vis. Exp. (74), e50329, doi:10.3791/50329 (2013).

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