Summary

Real-time beeldvorming van heterotypische Bloedplaatjes-neutrofiele Interacties op het geactiveerd endotheel tijdens vasculaire ontsteking en trombose in Live Muizen

Published: April 02, 2013
doi:

Summary

Hier beschrijven we een experimentele techniek van fluorescentie intravitale microscopie heterotypische bloedplaatjes interacties op de neutrofiel geactiveerd endotheel visualiseren tijdens vasculaire inflammatie en trombose in levende muizen. Deze microscopische techniek waardevol zal zijn voor het moleculaire mechanisme van vasculaire ziekte te bestuderen en farmacologische middelen testen onder pathofysiologische omstandigheden.

Abstract

Interactie van geactiveerde bloedplaatjes en leukocyten (neutrofielen voornamelijk) op het geactiveerde endotheel bemiddelt trombose en vasculaire inflammatie. 1,2 Tijdens trombusvorming op de plaats van verwonding arteriolaire, bloedplaatjes adherent aan het geactiveerde endotheel en subendotheliale matrix eiwitten ondersteunen neutrofiel hechting walsen en 3. Omgekeerd, onder venulaire inflammatoire aandoeningen, kan neutrofielen aanhanger van de geactiveerde endotheel ondersteunen hechting en de accumulatie van circulerende bloedplaatjes. Heterotypische bloedplaatjes aggregatie neutrofiel heeft sequentiële processen die specifieke receptor-counter receptor interacties tussen cellen. 4 Het is bekend dat geactiveerde endotheelcellen adhesiemoleculen zoals von Willebrand factor los wordt geïnitieerd bloedplaatjesadhesie en accumulatie onder hoge afschuifkrachten. 5 Ook geactiveerde endotheelcellen ondersteunen neutrofiele rollen en adhesie met het uitspreken van selectines eend intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), respectievelijk onder lage afschuifkrachten. 4 Platelet P-selectine neutrofielen door interactie met P-selectine glycoproteïne-1 ligand (PSGL-1), en veroorzaakt daardoor activatie van neutrofielen β2 integrines en stevig hechting tussen twee celtypes. Ondanks de vooruitgang in in vitro experimenten waarin heterotypische bloedplaatjes neutrofiel interacties bepaald in volbloed of geïsoleerde cellen, 6,7 studies die niet manipuleren oxidant stress tijdens vasculaire ziekte. In dit verslag met fluorescentie-gemerkt, specifieke antilichamen tegen een muis bloedplaatjes en neutrofielen marker beschrijven we een gedetailleerde intravitale microscopische protocol heterotypische interactie van bloedplaatjes en neutrofielen op de geactiveerde endotheel volgen tijdens TNF-α-geïnduceerde ontsteking of na laser geïnduceerde letsel bij cremaster spier haarvaten van levende muizen.

Protocol

1. Bereiding van intravitale microscoop (Figuur 1A) Bereid superfusie buffer (125 mM NaCl, 4,5 mM KCl, 2,5 mM CaCl2, 1 mM MgCl2 en 17 mM NaHCO3, pH 7,4). Zet een circulatoire waterbad temperatuur van buffer en een thermo-gecontroleerde deken te handhaven op 37 ° C. Beluchten buffer met stikstofgas (5% CO2 evenwicht met stikstof). Zet de microscoop systeem (Sutter Lambda DG-4 hoge snelheid golflengte-wisselaar, werkstation, Olympus BX61W microsco…

Representative Results

Behulp van een gedetailleerde intravitale microscopie analyse heterotypische bloedplaatjes neutrophil interacties op het geactiveerde endotheel werden gevisualiseerd door infusie van fluorescent gelabelde antilichamen tegen bloedplaatjes (CD42c) of neutrofielen marker (Gr-1) in levende muizen. In een model van TNF-α-geïnduceerde ontsteking venulaire werden de meeste rollen neutrofielen stabiel gehecht aan het endotheel vermoedelijk door interactie van geactiveerde β2 integrinen met ICAM-1…

Discussion

Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor real-time fluorescentie intravitale microscopie heterotypische bloedplaatjes interacties op de neutrofiel geactiveerd endotheel visualiseren tijdens vasculaire ontsteking en trombose. Voorheen soortgelijke fluorescentiemicroscopische benaderingen werden gemeld aan het moleculaire mechanisme van trombusvorming en vasculaire ontsteking te bestuderen. 8,12 Sinds de heterotypische cel-cel interactie van belang kunnen zijn voor de vaso-occlusie van de schade site…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health (P30 HL101302 en RO1 HL109439 naar JC) en de American Heart Association (SDG 5270005 naar JC). A. Barazia werd ondersteund door een T32HL007829 NIH training subsidie.

Materials

Name of Reagent/Material Company Catalog Number Comments
NaCl Fisher Scientific 7647-14-5  
KCl Sigma-Aldrich 7447-40-7  
CaCl2 2H2O Sigma-Aldrich 10035-04-8  
MgCl2 6H2O Fisher Scientific 7791-18-6  
NaHCO3 Fisher Scientific 144-55-8  
0.9% NaCl Saline Hospira 0409-4888-10  
Ketamine Hospira 0409-2051-05  
Xylazine Lloyd    
Intramedic Tubing (PE 90) BD Diagnostics 427421  
Intramedic Tubing (PE 10) BD Diagnostics 427401  
Murine TNF-α R&D Systems 410-MT  
Dylight 488- labeled rat anti-mouse CD42b antibody Emfret Analytics X488  
Alexa Fluor 647-conjugated anti-mouse Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) Antibody BioLegend 108418  
NESLAB EX water bath/circulator Thermo-Scientific    
Olympus BX61W microscope Olympus    
TH4-100 Power Olympus    
Lambda DG-4 Sutter    
MPC-200 multi-manipulator Sutter    
ROE-200 stage controller Sutter    
C9300 high-speed camera Hamamatsu    
Intensifier Video Scope International    
Ablation Laser Photonic Instruments, Inc.    
SlideBook 5.0 Intelligent Imaging Innovations    

References

  1. Wagner, D. D., Frenette, P. S. The vessel wall and its interactions. Blood. 111, 5271-5281 (2008).
  2. Nieswandt, B., Kleinschnitz, C., Stoll, G. Ischaemic stroke: a thrombo-inflammatory disease. J. Physiol. 589, 4115-4123 (2011).
  3. Yang, J., Furie, B. C., Furie, B. The biology of P-selectin glycoprotein ligand-1: its role as a selectin counterreceptor in leukocyte-endothelial and leukocyte-platelet interaction. Thromb. Haemost. 81, 1-7 (1999).
  4. Zarbock, A., Polanowska-Grabowska, R. K., Ley, K. Platelet-neutrophil-interactions: linking hemostasis and inflammation. Blood Rev. 21, 99-111 (2007).
  5. Chen, J., Lopez, J. A. Interactions of platelets with subendothelium and endothelium. Microcirculation. 12, 235-246 (2005).
  6. Konstantopoulos, K., et al. Venous levels of shear support neutrophil-platelet adhesion and neutrophil aggregation in blood via P-selectin and beta2-integrin. Circulation. 98, 873-882 (1998).
  7. Maugeri, N., de Gaetano, G., Barbanti, M., Donati, M. B., Cerletti, C. Prevention of platelet-polymorphonuclear leukocyte interactions: new clues to the antithrombotic properties of parnaparin, a low molecular weight heparin. Haematologica. 90, 833-839 (2005).
  8. Hidalgo, A., et al. Heterotypic interactions enabled by polarized neutrophil microdomains mediate thromboinflammatory injury. Nat. Med. 15, 384-391 (2009).
  9. Cho, J., Furie, B. C., Coughlin, S. R., Furie, B. A critical role for extracellular protein disulfide isomerase during thrombus formation in mice. J. Clin. Invest. 118, 1123-1131 (2008).
  10. Cho, J., et al. Protein disulfide isomerase capture during thrombus formation in vivo depends on the presence of beta3 integrins. Blood. 120, 647-655 (2012).
  11. Gross, P. L., Furie, B. C., Merrill-Skoloff, G., Chou, J., Furie, B. Leukocyte-versus microparticle-mediated tissue factor transfer during arteriolar thrombus development. Journal of Leukocyte Biology. 78, 1318-1326 (2005).
  12. Falati, S., Gross, P., Merrill-Skoloff, G., Furie, B. C., Furie, B. Real-time in vivo imaging of platelets, tissue factor and fibrin during arterial thrombus formation in the mouse. Nat. Med. 8, 1175-1181 (2002).
  13. Barthel, S. R., et al. Alpha 1,3 fucosyltransferases are master regulators of prostate cancer cell trafficking. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 19491-19496 (2009).
  14. Trzpis, M., McLaughlin, P. M., de Leij, L. M., Harmsen, M. C. Epithelial cell adhesion molecule: more than a carcinoma marker and adhesion molecule. The American Journal of Pathology. 171, 386-395 (2007).
  15. Junt, T., et al. Dynamic visualization of thrombopoiesis within bone marrow. Science. 317, 1767-1770 (2007).
  16. Egan, C. E., Sukhumavasi, W., Bierly, A. L., Denkers, E. Y. Understanding the multiple functions of Gr-1(+) cell subpopulations during microbial infection. Immunologic Research. 40, 35-48 (2008).

Play Video

Cite This Article
Kim, K. H., Barazia, A., Cho, J. Real-time Imaging of Heterotypic Platelet-neutrophil Interactions on the Activated Endothelium During Vascular Inflammation and Thrombus Formation in Live Mice. J. Vis. Exp. (74), e50329, doi:10.3791/50329 (2013).

View Video