הדמיה בזמן אמת של אינטראקציות heterotypic טסיות דם-נויטרופילים על האנדותל הופעל במהלך דלקת של כלי דם והיווצרות קרישים בעכברים חיים
Summary
כאן אנו מדווחים טכניקה ניסויית של מיקרוסקופיה intravital פלואורסצנטי לדמיין אינטראקציות heterotypic טסיות דם נויטרופילים על האנדותל הופעל במהלך דלקת כלי דם והיווצרות קרישים בעכברים חיים. טכנולוגיה מיקרוסקופית זה תהיה יקרה כדי לחקור את המנגנון המולקולרי של מחלת כלי דם ולבדוק סוכנים תרופתיים בתנאי pathophysiological.
Abstract
אינטראקציה של טסיות הופעלה ולויקוציטים (בעיקר הנויטרופילים) על פקק הפעילים האנדותל המתווכים ודלקת בכלי דם. 1,2 במהלך היווצרות פקיק באתר של פציעת ארטריולות, טסיות חסיד לאנדותל הופעל וחלבוני מטריקס subendothelial לתמוך מתגלגלים והידבקות נויטרופילים. 3 לעומת זאת, בתנאים דלקתיים venular, נויטרופילים חסיד לאנדותל הופעל יכולים לתמוך הידבקות והצטברות של טסיות דם במחזור. צבירת heterotypic טסיות דם נויטרופילים דורשת תהליכים רציפים על ידי אינטראקציות הקולטן קולט ללא מרשם הספציפיות בין תאים. 4 זה ידוע כי תאי האנדותל הופעלו לשחרר מולקולות דבקות כגון גורם Willebrand פון, ובכך ליזום הידבקות והצטברות טסיות דם בתנאי גזירה גבוהים. 5 כמו כן, תאי האנדותל הופעלו לתמוך מתגלגלים נויטרופילים והידבקות ידי selectins מבטאמולקולה-1 ד אינטר הידבקות (Icam-1), בהתאמה, בתנאי גזירה נמוכות. 4 טסיות דם P-selectin אינטראקציה עם נויטרופילים דרך P-גליקופרוטאין selectin יגנד-1 (PSGL-1), וכך גורם הפעלה של β2 integrins ומשרד נויטרופילים הדבקה בין שני סוגי תאים. למרות ההתקדמות בניסויים במבחנה שבה אינטראקציות heterotypic טסיות דם נויטרופילים נקבעות בדם או תאים מבודדים, 6,7 מחקרים אלו לא יכולים לתפעל את תנאי עקת חמצון במהלך מחלת כלי דם. בדו"ח זה, באמצעות נוגדנים שכותרת-fluorescently, ספציפיים נגד הטסיות וסמן עכבר נויטרופילים, אנו מתארים פרוטוקול מיקרוסקופי intravital מפורט לנטר אינטראקציות heterotypic של טסיות דם ונויטרופילים על האנדותל הופעל במהלך דלקת-α-Induced TNF או לאחר ליזר מושרה פציעה בשריר cremaster microvessels של עכברים חיים.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן אנו מתארים פרוטוקול מפורט למיקרוסקופיה intravital פלואורסצנטי בזמן אמת כדי לחזות אינטראקציות heterotypic טסיות דם נויטרופילים על האנדותל הופעל במהלך דלקת ופקק בכלי דם. בעבר, גישות מיקרוסקופיות קרינה דומות דווחו כדי לחקור את המנגנון המולקולרי של היווצרות פקיק ודלקת בכלי ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה בחלקו על ידי מענקים מהמכון הלאומי לבריאות (P30 HL101302 וRO1 HL109439 לJC) ואיגוד לב אמריקאי (SDG 5270005 לJC). א Barazia נתמך על ידי NIH T32HL007829 אימוני מענק.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | |
| CaCl2 2H2O | Sigma-Aldrich | 10035-04-8 | |
| MgCl2 6H2O | Fisher Scientific | 7791-18-6 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | 144-55-8 | |
| 0.9% NaCl Saline | Hospira | 0409-4888-10 | |
| Ketamine | Hospira | 0409-2051-05 | |
| Xylazine | Lloyd | ||
| Intramedic Tubing (PE 90) | BD Diagnostics | 427421 | |
| Intramedic Tubing (PE 10) | BD Diagnostics | 427401 | |
| Murine TNF-α | R&D Systems | 410-MT | |
| Dylight 488- labeled rat anti-mouse CD42b antibody | Emfret Analytics | X488 | |
| Alexa Fluor 647-conjugated anti-mouse Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) Antibody | BioLegend | 108418 | |
| NESLAB EX water bath/circulator | Thermo-Scientific | ||
| Olympus BX61W microscope | Olympus | ||
| TH4-100 Power | Olympus | ||
| Lambda DG-4 | Sutter | ||
| MPC-200 multi-manipulator | Sutter | ||
| ROE-200 stage controller | Sutter | ||
| C9300 high-speed camera | Hamamatsu | ||
| Intensifier | Video Scope International | ||
| Ablation Laser | Photonic Instruments, Inc. | ||
| SlideBook 5.0 | Intelligent Imaging Innovations |
References
- Wagner, D. D., Frenette, P. S. The vessel wall and its interactions. Blood. 111, 5271-5281 (2008).
- Nieswandt, B., Kleinschnitz, C., Stoll, G. Ischaemic stroke: a thrombo-inflammatory disease. J. Physiol. 589, 4115-4123 (2011).
- Yang, J., Furie, B. C., Furie, B. The biology of P-selectin glycoprotein ligand-1: its role as a selectin counterreceptor in leukocyte-endothelial and leukocyte-platelet interaction. Thromb. Haemost. 81, 1-7 (1999).
- Zarbock, A., Polanowska-Grabowska, R. K., Ley, K. Platelet-neutrophil-interactions: linking hemostasis and inflammation. Blood Rev. 21, 99-111 (2007).
- Chen, J., Lopez, J. A. Interactions of platelets with subendothelium and endothelium. Microcirculation. 12, 235-246 (2005).
- Konstantopoulos, K., et al. Venous levels of shear support neutrophil-platelet adhesion and neutrophil aggregation in blood via P-selectin and beta2-integrin. Circulation. 98, 873-882 (1998).
- Maugeri, N., de Gaetano, G., Barbanti, M., Donati, M. B., Cerletti, C. Prevention of platelet-polymorphonuclear leukocyte interactions: new clues to the antithrombotic properties of parnaparin, a low molecular weight heparin. Haematologica. 90, 833-839 (2005).
- Hidalgo, A., et al. Heterotypic interactions enabled by polarized neutrophil microdomains mediate thromboinflammatory injury. Nat. Med. 15, 384-391 (2009).
- Cho, J., Furie, B. C., Coughlin, S. R., Furie, B. A critical role for extracellular protein disulfide isomerase during thrombus formation in mice. J. Clin. Invest. 118, 1123-1131 (2008).
- Cho, J., et al. Protein disulfide isomerase capture during thrombus formation in vivo depends on the presence of beta3 integrins. Blood. 120, 647-655 (2012).
- Gross, P. L., Furie, B. C., Merrill-Skoloff, G., Chou, J., Furie, B. Leukocyte-versus microparticle-mediated tissue factor transfer during arteriolar thrombus development. Journal of Leukocyte Biology. 78, 1318-1326 (2005).
- Falati, S., Gross, P., Merrill-Skoloff, G., Furie, B. C., Furie, B. Real-time in vivo imaging of platelets, tissue factor and fibrin during arterial thrombus formation in the mouse. Nat. Med. 8, 1175-1181 (2002).
- Barthel, S. R., et al. Alpha 1,3 fucosyltransferases are master regulators of prostate cancer cell trafficking. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 19491-19496 (2009).
- Trzpis, M., McLaughlin, P. M., de Leij, L. M., Harmsen, M. C. Epithelial cell adhesion molecule: more than a carcinoma marker and adhesion molecule. The American Journal of Pathology. 171, 386-395 (2007).
- Junt, T., et al. Dynamic visualization of thrombopoiesis within bone marrow. Science. 317, 1767-1770 (2007).
- Egan, C. E., Sukhumavasi, W., Bierly, A. L., Denkers, E. Y. Understanding the multiple functions of Gr-1(+) cell subpopulations during microbial infection. Immunologic Research. 40, 35-48 (2008).
