Summary

In tempo reale di immagine degli eterotipica piastrine-neutrofili interazioni sull'endotelio Attivato durante l'infiammazione vascolare e la formazione di trombi in topi vivi

Published: April 02, 2013
doi:

Summary

Qui riportiamo una tecnica sperimentale di fluorescenza microscopia intravitale di visualizzare eterotipiche piastrine-neutrofili interazioni sul endotelio attivato durante l'infiammazione vascolare e la formazione di trombi nei topi vivi. Questa tecnologia microscopica sarà prezioso per studiare il meccanismo molecolare della malattia vascolare e per testare agenti farmacologici in condizioni fisiopatologiche.

Abstract

Interazione delle piastrine attivate e leucociti neutrofili (principalmente) sulla trombosi attivato media endotelio e infiammazione vascolare. 1,2 Durante la formazione del trombo nel sito di lesione arteriolare, piastrine aderenti all'endotelio attivato e proteine ​​della matrice subendoteliali supportare rotolamento dei neutrofili e adesione. 3 Viceversa, in venulare condizioni infiammatorie, aderenti neutrofili all'endotelio attivato può sostenere l'adesione e l'accumulo di piastrine circolanti. Eterotipica piastrine-neutrofili aggregazione richiede processi sequenziali dagli specifici recettori-counter interazioni tra cellule recettore. 4 È noto che cellule endoteliali attivate rilasciare molecole di adesione come fattore di von Willebrand, avviando adesione piastrinica e accumulo condizioni di alto shear. 5 Inoltre, cellule endoteliali attivate supportare rotolamento dei neutrofili e adesione da selectine esprimono unmolecola-1 di adesione intercellulare d (ICAM-1), rispettivamente, in condizioni di basso attrito. 4 piastrine P-selectina interagisce con neutrofili attraverso P-selectina glicoproteina ligando-1 (PSGL-1), inducendo così l'attivazione dei neutrofili β2 integrine e azienda adesione tra due tipi di cellule. Nonostante i progressi in esperimenti in vitro in cui sono determinati eterotipiche piastrine-neutrofili interazioni in sangue intero o cellule isolate, 6,7 quegli studi non può manipolare durante condizioni di stress ossidativo malattia vascolare. In questo rapporto, con marcati in fluorescenza, anticorpi specifici contro un mouse piastrinica e dei neutrofili marcatore, si descrive un dettagliato protocollo intravitale microscopica per monitorare le interazioni eterotipiche di piastrine e dei neutrofili sul endotelio attivato durante il TNF-α indotta da infiammazione o dopo laser-indotta lesioni in Cremaster microvasi muscolari di topi vivi.

Protocol

1. Preparazione di Microscopio intravitale (Figura 1A) Preparare tampone superfusione (125 mM NaCl, 4,5 mM KCl, 2,5 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2, e 17 mM NaHCO 3, pH 7,4). Attivare un bagnomaria circolatorio per mantenere la temperatura del tampone e termo-controllata coperta a 37 ° C. Aerare tampone con gas di azoto (5% di CO2 equilibrato con azoto). Accendere il sistema di microscopio (Sutter Lambda DG-4 ad alta velocità di lunghezza d'onda cam…

Representative Results

Con un'analisi dettagliata microscopia intravitale, eterotipiche piastrine-neutrofili interazioni sul endotelio attivato sono state visualizzate mediante infusione di anticorpi marcati con fluorescenza contro una piastrina (CD42c) o neutrofili marcatore (Gr-1) in topi vivi. In un modello di TNF-α indotta infiammazione venulare, neutrofili più laminazione sono stabilmente aderito all'endotelio presumibilmente dall'interazione attivati ​​β2 integrine con ICAM-1 durante il pe…

Discussion

Qui si descrive un protocollo dettagliato per tempo reale microscopia a fluorescenza intravitale di visualizzare eterotipiche piastrine-neutrofili interazioni sull'endotelio vascolare attivato durante l'infiammazione e trombosi. In precedenza, simili approcci fluorescenza microscopiche sono stati segnalati per studiare il meccanismo molecolare della formazione di trombi e infiammazione vascolare. 8,12 Poiché il heterotypic interazione cellula-cellula potrebbe essere importante per vaso-occlusione al …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto in parte da sovvenzioni dal National Institutes of Health (P30 HL101302 e RO1 HL109439 a JC) e dell'American Heart Association (SDG 5.270.005 a JC). A. Barazia è stato sostenuto da una borsa di formazione T32HL007829 NIH.

Materials

Name of Reagent/Material Company Catalog Number Comments
NaCl Fisher Scientific 7647-14-5  
KCl Sigma-Aldrich 7447-40-7  
CaCl2 2H2O Sigma-Aldrich 10035-04-8  
MgCl2 6H2O Fisher Scientific 7791-18-6  
NaHCO3 Fisher Scientific 144-55-8  
0.9% NaCl Saline Hospira 0409-4888-10  
Ketamine Hospira 0409-2051-05  
Xylazine Lloyd    
Intramedic Tubing (PE 90) BD Diagnostics 427421  
Intramedic Tubing (PE 10) BD Diagnostics 427401  
Murine TNF-α R&D Systems 410-MT  
Dylight 488- labeled rat anti-mouse CD42b antibody Emfret Analytics X488  
Alexa Fluor 647-conjugated anti-mouse Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) Antibody BioLegend 108418  
NESLAB EX water bath/circulator Thermo-Scientific    
Olympus BX61W microscope Olympus    
TH4-100 Power Olympus    
Lambda DG-4 Sutter    
MPC-200 multi-manipulator Sutter    
ROE-200 stage controller Sutter    
C9300 high-speed camera Hamamatsu    
Intensifier Video Scope International    
Ablation Laser Photonic Instruments, Inc.    
SlideBook 5.0 Intelligent Imaging Innovations    

References

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Cite This Article
Kim, K. H., Barazia, A., Cho, J. Real-time Imaging of Heterotypic Platelet-neutrophil Interactions on the Activated Endothelium During Vascular Inflammation and Thrombus Formation in Live Mice. J. Vis. Exp. (74), e50329, doi:10.3791/50329 (2013).

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