Imagens em tempo real de heterotípica plaquetas neutrófilos Interações sobre o endotélio ativado durante a inflamação vascular e formação de trombos em camundongos vivos
Summary
Aqui descrevemos uma técnica experimental de microscopia de fluorescência intravital para visualizar heterotípicos plaquetas neutrófilos interações sobre o endotélio ativado durante a inflamação vascular e formação de trombos em camundongos vivos. Esta tecnologia microscópico será valiosa para estudar o mecanismo molecular da doença vascular e para testar agentes farmacológicos, em condições fisiopatológicas.
Abstract
Interacção de plaquetas e leucócitos activados (sobretudo neutrófilos) no endotélio activado trombose e medeia a inflamação vascular. 1,2 Durante a formação do trombo no sítio da lesão arteriolar, plaquetas aderentes ao endotélio activado e proteínas da matriz subendotelial suporte de rolamento dos neutrófilos e adesão 3. Por outro lado, sob condições inflamatórias venulares, os neutrófilos aderentes ao endotélio activado pode suportar a adesão e acumulação de plaquetas circulantes. Agregação de plaquetas de neutrófilos heterotípica requer processos sequenciais pelas interacções específicas do receptor de contra-receptor entre as células. 4 Sabe-se que células endoteliais activadas libertar as moléculas de adesão, tais como o factor de von Willebrand, iniciando assim a adesão de plaquetas e acumulação sob condições de alto cisalhamento. 5 Além disso, células endoteliais ativadas apoiar rolamento e adesão de neutrófilos por selectinas expressando umad molécula-1 de adesão intercelular (ICAM-1), respectivamente, sob condições de baixo cisalhamento. Platelet 4 P-selectina interage com os neutrófilos a P-selectina glicoproteína ligando-1 (PSGL-1), induzindo deste modo a activação de neutrófilos β2 integrinas e firmes a adesão entre dois tipos de células. Apesar dos avanços nas experiências in vitro em que heterotípicas plaquetas de neutrófilos interacções são determinados em sangue completo ou células isoladas, 6,7 desses estudos não é possível manipular as condições de stress oxidante durante a doença vascular. Neste relatório, utilizando fluorescentemente marcados, os anticorpos específicos contra um rato de plaquetas e neutrófilos marcador, nós descrevemos um protocolo detalhado microscópica intravital para monitorar interacções heterotípicas de plaquetas e neutrófilos no endotélio activado durante TNF-α induzida por inflamação ou seguindo induzida por laser lesão no músculo cremaster microvasos de camundongos vivos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui nós descrevemos um protocolo detalhado em tempo real a microscopia de fluorescência intravital para visualizar heterotípicos plaquetas neutrófilos interações sobre o endotélio ativado durante a inflamação vascular e trombose. Anteriormente, semelhantes de fluorescência abordagens microscópicas foram relatados para estudar o mecanismo molecular da formação de trombos e de inflamação vascular. 8,12 Uma vez que a interacção célula-célula heterotípica pode ser importante para a vaso-oclus…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado em parte por concessões do National Institutes of Health (P30 HL101302 e RO1 HL109439 a JC) e da American Heart Association (SDG 5.270.005 de JC). A. Barazia foi apoiado por uma NIH T32HL007829 treinamento subvenção.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | |
| CaCl2 2H2O | Sigma-Aldrich | 10035-04-8 | |
| MgCl2 6H2O | Fisher Scientific | 7791-18-6 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | 144-55-8 | |
| 0.9% NaCl Saline | Hospira | 0409-4888-10 | |
| Ketamine | Hospira | 0409-2051-05 | |
| Xylazine | Lloyd | ||
| Intramedic Tubing (PE 90) | BD Diagnostics | 427421 | |
| Intramedic Tubing (PE 10) | BD Diagnostics | 427401 | |
| Murine TNF-α | R&D Systems | 410-MT | |
| Dylight 488- labeled rat anti-mouse CD42b antibody | Emfret Analytics | X488 | |
| Alexa Fluor 647-conjugated anti-mouse Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) Antibody | BioLegend | 108418 | |
| NESLAB EX water bath/circulator | Thermo-Scientific | ||
| Olympus BX61W microscope | Olympus | ||
| TH4-100 Power | Olympus | ||
| Lambda DG-4 | Sutter | ||
| MPC-200 multi-manipulator | Sutter | ||
| ROE-200 stage controller | Sutter | ||
| C9300 high-speed camera | Hamamatsu | ||
| Intensifier | Video Scope International | ||
| Ablation Laser | Photonic Instruments, Inc. | ||
| SlideBook 5.0 | Intelligent Imaging Innovations |
References
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