Summary

Изображений в реальном времени из гетеротипические тромбоцитов нейтрофилами взаимодействий на активированного эндотелия Во сосудистого воспаления и тромбообразования в живых мышей

Published: April 02, 2013
doi:

Summary

Здесь мы сообщаем экспериментальная методика прижизненной флуоресцентной микроскопии для визуализации гетеротипические тромбоцитов нейтрофилами взаимодействия на активированном эндотелии во сосудистыми воспаление и образование тромба в живых мышей. Это микроскопические технология будет ценным для изучения молекулярных механизмов сосудистых заболеваний и для проверки фармакологических агентов по патофизиологических условиях.

Abstract

Взаимодействие активированных тромбоцитов и лейкоцитов (в основном нейтрофилы) на активированном эндотелии посредником тромбозов и сосудистых воспаления. 1,2 Во время образования тромба в месте травмы артериол, тромбоциты приверженцем активированного эндотелия и субэндотелиального матричных протеинов поддерживает нейтрофилов качению и сцепление 3. Наоборот, под венулярного воспалительных заболеваний, нейтрофилы приверженцем активированного эндотелия может поддерживать адгезию и накопление циркулирующих тромбоцитов. Гетеротипические тромбоцитов нейтрофилами агрегации требует последовательных процессов на специфический рецептор-счетчик рецепторных взаимодействий между клетками. 4 Известно, что активированные эндотелиальные клетки выделяют молекулы адгезии, таких как фактора Виллебранда, инициируя тем самым адгезии тромбоцитов и накопления в условиях высокого сдвига условиях 5. Кроме того, активированных эндотелиальных клеток нейтрофилов поддерживает качению и сцепление, выразив селектиныD молекулы межклеточной адгезии-1 (ICAM-1), соответственно, в условиях низкого сдвига. 4 тромбоцитов Р-селектина взаимодействует с нейтрофилов через P-селектина гликопротеин лиганд-1 (PSGL-1), тем самым вызывая активацию нейтрофилов β2 интегринов и фирмы адгезии между двумя типами клеток. Несмотря на успехи в экспериментах в пробирке, в которой гетеротипические тромбоцитов нейтрофилами взаимодействия определяются в цельной крови или изолированных клеток, 6,7 этих исследований не может манипулировать условиях окислительного стресса во сосудистыми заболеваниями. В этом докладе, с использованием флуоресцентно-меченые, специфические антитела против мыши тромбоцитов и нейтрофилов маркером, мы описываем подробные прижизненных микроскопических протокол для мониторинга гетеротипические взаимодействия тромбоцитов и нейтрофилов на активированном эндотелии во время TNF-α-индуцированного воспаления или после лазерно-индуцированной травмы в кремастер мышц микрососудов живых мышей.

Protocol

1. Подготовка прижизненные микроскоп (рис. 1А) Подготовка superfusion буфера (125 мМ NaCl, 4,5 мМ KCl, 2,5 мМ CaCl 2, 1 мМ MgCl 2 и 17 мМ NaHCO 3, рН 7,4). Включите водяной бане кровообращения для поддержания температуры буфера и термо-одеяла контролируемых при 37 ° C. Проветрить буфера с азо…

Representative Results

Используя подробные прижизненного анализа микроскопии, гетеротипические тромбоцитов нейтрофилами взаимодействия на активированном эндотелии были визуализированы с помощью вливания флуоресцентно-меченых антител против тромбоцитов (CD42c) или нейтрофилов маркер (Gr-1) в живых мышей. <p…

Discussion

Здесь мы опишем подробный протокол реального времени флуоресценции прижизненной микроскопии для визуализации гетеротипические тромбоцитов нейтрофилами взаимодействия на активированном эндотелии во сосудистыми воспаление и тромбоз. Ранее подобные флуоресценции микроскопических …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была выполнена при частичной поддержке грантов от Национального института здоровья (P30 HL101302 и RO1 HL109439 к JC) и Американской Ассоциации Сердца (SDG 5270005 по х). А. Barazia была поддержана NIH T32HL007829 подготовки гранта.

Materials

Name of Reagent/Material Company Catalog Number Comments
NaCl Fisher Scientific 7647-14-5  
KCl Sigma-Aldrich 7447-40-7  
CaCl2 2H2O Sigma-Aldrich 10035-04-8  
MgCl2 6H2O Fisher Scientific 7791-18-6  
NaHCO3 Fisher Scientific 144-55-8  
0.9% NaCl Saline Hospira 0409-4888-10  
Ketamine Hospira 0409-2051-05  
Xylazine Lloyd    
Intramedic Tubing (PE 90) BD Diagnostics 427421  
Intramedic Tubing (PE 10) BD Diagnostics 427401  
Murine TNF-α R&D Systems 410-MT  
Dylight 488- labeled rat anti-mouse CD42b antibody Emfret Analytics X488  
Alexa Fluor 647-conjugated anti-mouse Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) Antibody BioLegend 108418  
NESLAB EX water bath/circulator Thermo-Scientific    
Olympus BX61W microscope Olympus    
TH4-100 Power Olympus    
Lambda DG-4 Sutter    
MPC-200 multi-manipulator Sutter    
ROE-200 stage controller Sutter    
C9300 high-speed camera Hamamatsu    
Intensifier Video Scope International    
Ablation Laser Photonic Instruments, Inc.    
SlideBook 5.0 Intelligent Imaging Innovations    

References

  1. Wagner, D. D., Frenette, P. S. The vessel wall and its interactions. Blood. 111, 5271-5281 (2008).
  2. Nieswandt, B., Kleinschnitz, C., Stoll, G. Ischaemic stroke: a thrombo-inflammatory disease. J. Physiol. 589, 4115-4123 (2011).
  3. Yang, J., Furie, B. C., Furie, B. The biology of P-selectin glycoprotein ligand-1: its role as a selectin counterreceptor in leukocyte-endothelial and leukocyte-platelet interaction. Thromb. Haemost. 81, 1-7 (1999).
  4. Zarbock, A., Polanowska-Grabowska, R. K., Ley, K. Platelet-neutrophil-interactions: linking hemostasis and inflammation. Blood Rev. 21, 99-111 (2007).
  5. Chen, J., Lopez, J. A. Interactions of platelets with subendothelium and endothelium. Microcirculation. 12, 235-246 (2005).
  6. Konstantopoulos, K., et al. Venous levels of shear support neutrophil-platelet adhesion and neutrophil aggregation in blood via P-selectin and beta2-integrin. Circulation. 98, 873-882 (1998).
  7. Maugeri, N., de Gaetano, G., Barbanti, M., Donati, M. B., Cerletti, C. Prevention of platelet-polymorphonuclear leukocyte interactions: new clues to the antithrombotic properties of parnaparin, a low molecular weight heparin. Haematologica. 90, 833-839 (2005).
  8. Hidalgo, A., et al. Heterotypic interactions enabled by polarized neutrophil microdomains mediate thromboinflammatory injury. Nat. Med. 15, 384-391 (2009).
  9. Cho, J., Furie, B. C., Coughlin, S. R., Furie, B. A critical role for extracellular protein disulfide isomerase during thrombus formation in mice. J. Clin. Invest. 118, 1123-1131 (2008).
  10. Cho, J., et al. Protein disulfide isomerase capture during thrombus formation in vivo depends on the presence of beta3 integrins. Blood. 120, 647-655 (2012).
  11. Gross, P. L., Furie, B. C., Merrill-Skoloff, G., Chou, J., Furie, B. Leukocyte-versus microparticle-mediated tissue factor transfer during arteriolar thrombus development. Journal of Leukocyte Biology. 78, 1318-1326 (2005).
  12. Falati, S., Gross, P., Merrill-Skoloff, G., Furie, B. C., Furie, B. Real-time in vivo imaging of platelets, tissue factor and fibrin during arterial thrombus formation in the mouse. Nat. Med. 8, 1175-1181 (2002).
  13. Barthel, S. R., et al. Alpha 1,3 fucosyltransferases are master regulators of prostate cancer cell trafficking. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 19491-19496 (2009).
  14. Trzpis, M., McLaughlin, P. M., de Leij, L. M., Harmsen, M. C. Epithelial cell adhesion molecule: more than a carcinoma marker and adhesion molecule. The American Journal of Pathology. 171, 386-395 (2007).
  15. Junt, T., et al. Dynamic visualization of thrombopoiesis within bone marrow. Science. 317, 1767-1770 (2007).
  16. Egan, C. E., Sukhumavasi, W., Bierly, A. L., Denkers, E. Y. Understanding the multiple functions of Gr-1(+) cell subpopulations during microbial infection. Immunologic Research. 40, 35-48 (2008).

Play Video

Cite This Article
Kim, K. H., Barazia, A., Cho, J. Real-time Imaging of Heterotypic Platelet-neutrophil Interactions on the Activated Endothelium During Vascular Inflammation and Thrombus Formation in Live Mice. J. Vis. Exp. (74), e50329, doi:10.3791/50329 (2013).

View Video