齧歯中枢神経系への薬物の直接脳室内デリバリー

下記のプロトコルは、セントルイスにあるワシントン大学の制度動物実験委員会によって承認され、実験動物の使用のための健康ガイドラインの国立研究所に準拠しているされています。これは手術を行うのは初めてであるならば、我々は14を開始する前に、導入などの齧歯類の手術でJoveの記事を見てお勧めします。 ASOSは、浸透圧ポンプの注入および単一ICVボーラス注入の両方を通ってマウスCNSに送達することができる。このため、以下に詳述する手順は、2つのセグメントに分割される。それぞれの方法の長所と短所は、ディスカッションセクションで上触れることになります。プロトコルで使用される座標は、成人C57BL6とB6C3マウス用です。対応するラット座標は表1に見出すことができる。 ALZET浸透圧ポンプ 1。アルゼット浸透圧ポンプの調製無菌DRAPを置くeと直接無菌維持するためには何も触れないように注意しながら、慎重にその上に次の項目をドロップ：浸透圧ポンプ（S）、フローモジュレータ（S）、1 mlの滅菌シリンジ（S）、メスの刃、およびチューブのセクションを（チューブ= 5ポンプの1個）。 14日、28日、および42日（ 図2A）：マウスの場合は、ポンプのための3つのオプションがあります。 キャップを取ると15〜20ミリリットル食塩水で滅菌50ミリリットルコニカルチューブを埋める。最大6組み立てポンプはコニカルチューブ毎に添加することができます。 100％エタノールでP60ペトリ皿を埋める。エタノールへのカテーテルの適切な数を追加します。マウスについては、カテーテルの長さは、2.5 mmである。 必要に応じて1.5のような多くのmlのエッペンドルフチュー​​ブに各ASOをフィルタリング。とチューブを埋めるために無菌の0.9％生理食塩水で満たされたエッペンドルフチュー​​ブを含む。 すべてが準備されると、滅菌手袋を置く。無菌ではない何かに触れていないことを確認してください。必要に応じて手袋を変更してください。 各ASOが使用されるために1mlのシリンジを埋める上部の穴に針を入れ、ゆっくりと過剰漏れまで記入してくださいとloadpumps。ポンプのすべてが満たされるまで継続する。 フローモジュレータをキャップを取るとポンプに挿入。 3〜5ミリメ​​ートルギャップを残して、ほぼすべての中で道の流れが変調器を押してください。 手術用メスの刃を使用し、5等しいセグメントにチューブの各部分をカット。チューブの一枚を取り、1ミリリットルのシリンジを用いて滅菌した生理食塩水でいっぱいにし、チューブの一端に流入変調器の上部を挿入します。その後、エタノールからカニューレを取ると、チューブのもう一方の端に接続します。ポンプが完全に組み立てられている。 プライミング用食塩水で滅菌50ミリリットルコニカルチューブに完全に組み立てられたポンプを配置します。プライミングは、薬物送達を開始するために流体に浸るだけでなく、適切な温度に来るようにポンプを可能にします。プライミング時間：14日ポンプ：4-6時間、28日間ポンプ：40時間、42日ポンプ：60時間。ポンプの組み立てが完了したら、きれいにコニカルチューブと場所をキャップ37℃手術までC水浴。 2。プレ外科手順エリアを殺菌し、無菌のフィールドを作成するテーブルトップとstereotaxに滅菌ドレープを置くために70％エタノールですべてを拭う。全体の手術を通して滅菌野に留意することが重要です。ビーズ滅菌、加熱パッド、ライト、デジタル読み出し、及び酸素/イソフルランシステム（ 図1）は、次の電源をオンにします。 我々は日常的にそうであるように、単一の手術や手術のバッチ全体のどちらかをやっている場合、以下の項目が必要になります鉗子の1ペア、1湾曲した止血、小さなはさみの1組、小さな曲がっ鈍化はさみの1ペア、1ラットの骨のカッター、1ストレート止血、5-0ナイロン縫合糸、70％エタノールで1コニカルチューブ、95％エタノールで1円錐管、ヨウ素1コニカルチューブ、過酸化水素と1コニカルチューブ、滅菌綿棒のパッケージ、スーパーの1瓶のり、1チューブ抗生物質軟膏、眼1チューブ潤滑剤、および1電気シェーバー。 15秒のためにビーズ滅菌器にはさみ、鉗子、曲線止血の両方の対の先端を置きます。取り外し、70％エタノールに入れます。複数の外科手術を行う際に、動物の間で器具の先端を再滅菌する。 4％のイソフルランとO 2から0.4 L / minで、チャンバーに直接ガスの流れを回します。我々は麻酔の適切な量を提供していることを確認するために、少なくとも1つの年間キャリブレーション当社イソフルラン/酸素システムを持っている。チャンバー内にマウスを置き、呼吸が著しく遅くなるまで待ちます。マウスを取り外し、マウスは完全に無意識であることを確認するためにつま先のピンチを実行します。 目の間で最大の肩の上から毛を剃る。マウスが目を覚ますが開始された場合は、マウスがつま先のピンチで確定、再び完全に無意識になるまで、チャンバー内に戻ってマウスを置きます。 stereotaxに麻酔マウスを置き、鼻の上にノーズコーンを押してください。歯や骨が壊れやすいように穏やかである。 マウスを麻酔維持するstereotaxへのガスの流れを演出します。時折マウスは手術全体のつま先のピンチと完全に無意識であることを確認するためにチェックすることが重要です。耳の棒で頭を固定します。私たちは、側脳室を対象とするものの、完全にレベル頭蓋骨が原因心室の大きなサイズにする必要はありません、レベリング耳バーを好む。 メンテナンスのために2.0％イソフルランレベルを下げます。それぞれの目の上に軽くたたくの眼軟膏。ビデオで見られるように首と頭のベースのみが露出されるように、マウスを上に滅菌ドレープを築く。次いで、剃毛領域の中心から開始しスワブ綿棒は、ヨウ素に浸した綿、続いて95％エタノールに浸した綿で最初に外側に移動する円を描くように頭と首の上部を払拭して手術領域を消毒する。 我々は確実に直腸プローブフィードバック温度制御された加熱システムを使用することをお勧めしますマウスの温度が安定した37℃のままマウスの温度が手術中に低下した場合は、手術後の回復は時間がかかることがあり、その結果低体温は、タンパク質タウ15微小管関連の過剰リン酸化を含め、異常なタンパク質活性につながることができます。暖房システムを設定した後、あなたは今、手術を開始する準備が整いました。 3。アルゼット浸透圧ポンプの注入手術を開始する前に、滅菌手袋の新しいペアに置く。その後、鉗子とはさみの小さなペアを使用して、目の間に動物の頭蓋骨上記の首の付け根からまで皮膚の切開をする上向きに曲線と鈍いはさみを取り、左後肢に向かって戻って首の付け根の皮膚の下にスライドさせます。全く抵抗があってはなりません。がある場合は、ハサミを削除して再度実行してください。これは浸透圧ポンプのための皮下ポケットを形成している。 のWiPEは綿棒続い滅菌綿棒できれいに頭蓋骨は、ブレグマを高めるために過酸化水素に浸した。 ポンプの無菌性を維持するために、ポンプを含んで50ミリリットルコニカルチューブを拭う。慎重にポンプがコニカルチューブの側面に触れないように余分な世話をして、湾曲した止血剤を使用してコニカルチューブからポンプを取る。鉗子でポンプのベースを持ち、湾曲した止血剤との道の残りのフローモジュレータを押してください。 流れ変調器とチューブが湾曲した止血と会うポンプホールド。首の付け根の皮膚の下にポンプを挿入し、それが抵抗なく行く限り左後肢に向かって押し戻す。カテーテルのタッチは何もさせないように注意してください。 湾曲した止血剤を使用すると、トップは台座を満たしている溝でカニューレをつかむ。位置にカニューレドライバを移動して、所定の位置に固定します。 カニューレのベースにスーパー接着剤の一滴を置きます。膿チューブがまっすぐに指摘されるように、ドライバと位置にカニューレのhがトップ。 ブレグマにカテーテル先端をタッチしてデジタル表示上の座標をゼロに。カテーテルを上げ、右後方0.5ミリメートル（ 図2B）に横方向に1.1ミリメートルを移動します。湾曲した止血剤と道の皮膚を差し出す。 プラスチックカニューレベースがしっかりと頭蓋骨の上部に押し付けられるまで、頭蓋骨を通して薄い金属カテーテルを駆動します。金属カテーテルは相対薄い頭蓋骨のためマウスで頭蓋骨を介して直接駆動することができます。ラットを用いた場合は、カテーテルを下げる前に、頭蓋骨に穴を開ける。 離れて頭蓋骨からその上に接着剤を持っている任意の肌を引き出します。場所にカニューレ/カテーテルを保持カニューレドライバと、完全に乾燥させる接着剤のために1〜2分待ちます。 カテーテルの配置を評価するために、練習をすると、チューブ（ 図2C）を通じて2.5％FastGreen染料の20-40μLを注入します。 2〜3分、perfus待ち電子1X PBS 0.03％ヘパリンとマウス、脳を取り外します。カテーテルサイトで冠状カット。カテーテルが心室に配置した場合には、染料は、マウスの脳室系（ 図2D）を通じて灌流される。 ドライバを上げながら湾曲した止血剤のある場所でカテーテルを保持します。ゆっくりカニューレが適切に頭蓋骨に固定されていることを保証するために止血剤を放出する。 綿棒で、カニューレの上に下に押します。カニューレの上部とベースとの間の木立にラットの骨切りを取り付けます。まだ綿棒で押しながらカニューレの上部を切り取る。バリカンのレベルを試してみて、続けるように頭蓋骨からカニューレをデタッチしない。カニューレが動転来ない場合は、速やかに再接着剤、さらに2分間綿棒で圧力をかける。 右カニューレ上の余分な注意を払って、5-0縫合糸、定期的な止血剤、及び鉗子、フルオープンに沿って縫合糸を使用した。私たちはのrunninを使用頭蓋骨の上に大きな切開のためにgの水平マットレス縫合（ 図5を参照）。 頭と首の上に抗生物質軟膏のDABを適用します。緩め耳バーとノーズコーンを緩める。回復のための温暖化パッド上stereotaxと場所からマウスを外します。一般的に10〜30分に至るまで、回復の期間に密接したマウスを監視します。マウスの周りを歩いて、自分自身をグルーミング開始されるまで2〜3日毎分をチェックしてください。 4。術後ケア最初の週のための手術後、毎日マウスを監視します。 マウスが痛みや苦痛にあると表示された場合、我々は痛みを和らげるために、最大5日間毎に24時間一度カルプロフェンの5 mg / kgを皮下注射でマウスを提供するお勧めします。 感染症があるように表示された場合は、寛大に毎日領域に抗生物質軟膏を適用し、傷が正しく癒していることを確認するために出席する獣医師に相談してください。 R5-0ナイロン縫合糸を縫合糸からの刺激を防ぐために、手術後7-10日を残したまま削除。 5。アルゼット浸透圧ポンプを変更したり、削除するポンプを積極的にASOを注入行われた後、それがどちら変更または完全に除去することができる。 以下の変更と上記のように同じ事前手術手順に従ってください：1）あなたは、湾曲したハサミ、湾曲した止血、ラットの骨のカッター、またデジタル表示を必要としませんし、マウスの代わりに頭を準備中の2）、剃るとポンプとチューブの接合部にマウスの裏を消毒する。 鉗子やハサミを使って、ポンプ/チューブ接合に垂直、マウスの背面に1.5センチメートル切開を行います。慎重にカテーテルをJAR可能性があるので大幅にチューブを引っ張っ/押さずに切開のポンプを引き出します。 ポンプを削除するには、約0.5センチメートルフローモジュレータ上記チューブをクリップし、チューブをtに瞬間接着剤に触れOシールは、それはシャットダウンします。乾燥させる接着剤のために1〜2分待ちます。切開と縫合閉鎖にチューブバックを置きます。縫合し、皮膚や場所温水回収パッド上のマウスの上に軽くたたく抗生物質軟膏。 ポンプを変更するには、新たに95％エタノールでいっぱい10cmディッシュと一緒にポンプの準備ができました。カテーテルは、新しいポンプには必要ありません。 ピンセットで新しいポンプをつかむ。エタノールに指を浸し、ポンプを手に取り、フローモジュレータを捨てる。その後、慎重にゆっくりとチューブとカニューレに装着フローモジュレータから古いポンプをやってのける。できるだけ早くそれがオフになっているように、ゆっくりと流れ変調器は、マウスの外側に触れたことがないことを確認し、上に新しいポンプをスライドさせます。 背中の皮下パケットに切開を通して新しいポンプを再挿入し、皮膚を縫合。回復パッドの傷や場所マウスで軽くたたく抗生物質軟膏。 ただ、ポンプ注入と同様に、電話をチェックするために手術後、毎日マウスを監視AIN /不快と感染。必要と認めるとしてカルプロフェンと抗生物質で治療する。 ICVボーラス 6。プレ外科手順 ; 2）滅菌水および負荷と10μlのハミルトンシリンジと針をきれいに1）あなたが湾曲したハサミ、湾曲した止血、またはラットの骨のカッターを必要としません：以下の変更と上記の第2節と同様に手術前の手順に従ってくださいASO、3）カニューレドライバーが位置していた定位固定装置に注​​射器と針を取り付けてください。 7。 ASOのボーラス注射鉗子とはさみの小さなペアを使用して、目の間にまで首の付け根から切開を行います。 綿棒はブレグマを強化するために過酸化水素に浸した綿続い滅菌綿棒、きれいな頭蓋骨を拭きます。 所定の場所に注射器/注射針を移動し、固定します。針のベベル部分が後方を向くようにしてください。下段針はブレグマをそれに触れるまで。座標のすべてをゼロ。右1.0ミリメートルと0.3ミリメートル前方（ 図3A）に横方向に針を移動します。 針穴が頭蓋骨の上部と同じ高さになるだけになるまでゆっくりと頭蓋骨を通して針を駆動します。繰り返しますが、これはマウスの頭蓋骨の薄さが原因で行うことができます。ゼロのz座標は1mm /秒（ 図3B）の割合で-3.0 mmの針を下げる。針の周りにシールするための脳のために2〜3分待ちます。 毎秒1μLの割合でASOの完全10μLを届ける。 2〜3分待ちます。この率が異なる薬剤間で異なるかもしれませんが我々は、心室にASOSは1μlの注入速度を使用しています。練習するとき、2.5％FastGreen染料の10〜20μlのを提供することで、針の適切な配置を確認してください。染料注入後すぐに1X PBS 0.03％ヘパリンとマウスを灌流し、染料が脳室系（ 図3C）にあることを確認するために脳の冠状断面を作る。 <李>針の基部に頭蓋骨に対して綿棒をホールド。毎秒1ミリメートルの割合で針を上げる。とすぐに針が頭蓋骨の外にあるように、針穴の上綿棒を転がし、漏れる任意のASOを防ぐために1分間保持する。 、閉じた皮膚を縫合抗生物質軟膏を適用し、温水回収パッド上の場所のマウス。 ASO濃度に依存し、それは完全に回復するために数時間を20分かかる場合があります。 ただ、ポンプ注入と同様に、痛み/不快感や感染を確認するために手術後、毎日マウスを監視します。必要と認めるとしてカルプロフェンと抗生物質で治療する。