Directe Intraventriculaire levering van drugs aan het knaagdier centrale zenuwstelsel

Het protocol hieronder is goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik comites aan de Washington University in St. Louis en is in overeenstemming met de National Institutes of Health richtlijnen voor het gebruik van proefdieren. Als dit je eerste keer uitvoeren van operaties, raden we kijken naar de Jupiter artikel over knaagdieren operaties als een introductie voor het begin 14. ASOs kan om de muis CNS worden geleverd door zowel osmotische infuuspomp en een enkele injectie ICV bolus. Hierdoor wordt de hieronder beschreven opgesplitst in twee segmenten. Voor-en nadelen van elke methode zal worden aangestipt in het hoofdstuk discussie. De coördinaten worden gebruikt in de protocollen voor volwassen C57BL6 en B6C3 muizen. Overeenkomstige rat coördinaten zijn te vinden in tabel 1. ALZET osmotische pomp 1. Bereiding van Alzet osmotische pompen Voorzien in een steriele drape en zorgvuldig te laten vallen de volgende items op het, terwijl de zorg niet direct iets aan te raken om de steriliteit te behouden: osmotische pomp (en), stromingmodulator (s), 1 ml steriele spuit (s), scalpel en secties van buizen (1 stuk buis = 5 pompen). Voor muizen, zijn er drie mogelijkheden voor pompen: 14 dagen, 28 dagen en 42 dagen (Figuur 2A). Haal het beschermkapje en vul steriele 50 ml conische buizen met 15-20 ml zoutoplossing. Tot 6 geassembleerde pompen kunnen per conische buis worden toegevoegd. Vul een p60 petrischaal met 100% ethanol. Voeg juiste aantal katheters een ethanol. Voor muizen, katheterlengte is 2,5 mm. Filtreer elke ASO in maar 1,5 ml Eppendorf buisjes noodzakelijk. Omvatten een Eppendorf buis gevuld met een steriele 0,9% zoutoplossing om de slang te vullen met. Zodra alles is voorbereid, op steriele handschoenen. Zorg ervoor dat niet om iets dat is niet steriel raken. Veranderen handschoenen als nodig. Voor elke ASO te gebruiken vult een 1 ml injectiespuiten loadpumps door het plaatsen van de naald in de bovenste gat en langzaam vullen totdat teveel lekt. Doorgaan totdat alle pompen gevuld. Haal het beschermkapje van de stroom-modulatoren en invoegen in de pompen. Duw de stroom-modulator bijna alle wijze, waardoor een opening 3-5 mm. Met behulp van de scalpel, snijd elk stuk slang in 5 gelijke segmenten. Neem een ​​stuk buis, vul met steriele zoutoplossing met een 1 ml injectiespuit en steek de top van de stromingmodulator in een uiteinde van de slang. Neem dan een canule van de ethanol en sluit deze aan op het andere uiteinde van de slang. De pomp is nu volledig geassembleerd. Plaats de volledig gemonteerde pomp in de steriele 50 ml conische buis met een zoutoplossing voor priming. De priming zorgt voor de pompen om te genieten van vocht aan de drug delivery initiëren evenals komen om de juiste temperatuur. Priming tijd: 14 dagen pompen: 4-6 uur, 28 dag pompen: 40 uur, 42 dagen pompen: 60 hr. Wanneer u klaar bent het monteren van de pomp, cap de conische buizen en plaats in een schone37 ° C waterbad tot chirurgie. 2. Pre-operatieve procedure Veeg alles naar beneden met 70% ethanol om het gebied te steriliseren en ging steriele doeken over het tafelblad en stereotax een steriel veld te maken. Het is belangrijk bewust van het steriele veld om de hele operatie. Zet de volgende: Bead sterilisator, Verwarming Pad, licht, digitale uitlezing, en zuurstof / isofluraan System (figuur 1). De volgende items is noodzakelijk wanneer het doen van een operatie of een hele batch van operaties zoals we routinematig doen: 1 pincet, 1 gebogen hemostat, 1 paar kleine schaar, 1 paar kleine gebogen afgestompte schaar, 1 rat bot mes , 1 rechte hemostat, 5-0 nylon hechtingen, 1 conische buizen met 70% ethanol, 1 conische buis met 95% ethanol, 1 conische buis met jodium, 1 conische buis met waterstofperoxide, pakket van steriele wattenstaafjes, 1 fles super lijm, 1 tube antibiotische zalf, 1 tube van het oogsmeermiddel, en 1 elektrisch scheerapparaat. Steek de uiteinden van beide scharen, forceps, en gebogen hemostat in de kraal sterilisator gedurende 15 sec. Verwijderen en in 70% ethanol. Bij het uitvoeren van meerdere operaties, steriliseren de uiteinden van de instrumenten tussen dieren. Draai de isofluraan tot 4% en O 2 op 0,4 l / min en directe gasstroom naar de kamer. We hebben onze isofluraan / zuurstofsysteem gekalibreerd, eenmaal per jaar zodat we leveren de juiste hoeveelheid anesthesie. Plaats de muis in de kamer en wacht tot de ademhaling is aanzienlijk vertraagd. Verwijder de muis en het uitvoeren van een teen knijpen om te zorgen voor de muis is volledig onbewust. Scheer de haren vanaf de bovenkant van de schouder tot tussen de ogen. Als de muis begint te ontwaken, plaatst u de muis terug in de kamer totdat de muis is weer helemaal onbewust, bevestigen met een teen knijpen. Plaats de verdoofde muis op de stereotax en duw de neuskegel over de neus.Wees voorzichtig als de tanden en botten zijn broos. Richt de gasstroom naar de stereotax de muis verdoofd houden. Het is belangrijk om af en toe te controleren om ervoor te zorgen dat de muis is volledig onbewust met een teen knijpen de hele operatie. Beveilig het hoofd met het oor bars. We verkiezen nivellering oor bars, maar de laterale ventrikel gericht, een volledig vlakke schedel is niet nodig omdat de grootte van de ventrikel. Draai de isofluraan niveau omlaag tot 2,0% voor onderhoud. Schar oogzalf op elk oog. Zoals gezien in de video, leggen een steriele doek via muis zodat alleen de basis van de nek en het hoofd worden blootgesteld. Te ontsmetten het chirurgische gebied schoon door de bovenkant van het hoofd en de nek in een cirkelvormige beweging vanaf het midden van het geschoren gebied en bewegen naar buiten eerst met een wattenstaafje gedrenkt in 95% ethanol, gevolgd door een wattenstaafje gedrenkt in jodium. Wij raden het gebruik van een rectale sonde feedback temperatuur verwarmingssysteem dat zorgtde temperatuur van de muis blijft een stabiele 37 ° C. Als de temperatuur van de muis daalt tijdens de operatie kan de postoperatieve herstel langer en de resulterende onderkoeling kan leiden tot afwijkende eiwit activiteit, met inbegrip hyperfosforylering van de microtubule geassocieerd proteïne tau 15. Na het opzetten van het verwarmingssysteem, u bent nu klaar om de operatie te beginnen. 3. Implantatie van Alzet osmotische pomp Voor het begin van de operatie, op een nieuw paar steriele handschoenen. Vervolgens, met behulp van een pincet en schaartje, een insnijding in de huid van de basis van de hals boven de schedel van het dier om tussen de ogen Neem de stompe schaar met de curve naar boven en schuift onder de huid aan de basis van de nek naar de linker achterpoot. Er zou geen weerstand zijn. Als er, verwijder de schaar en probeer het opnieuw. Dit vormt de subcutane pocket voor de osmotische pomp. Wipe de schedel schoon met steriele wattenstaafjes, gevolgd door een wattenstaafje gedrenkt in waterstofperoxide te bregma verbeteren. Veeg de 50 ml conische buizen die pompen bevatten om de steriliteit van de pompen te onderhouden. Haal voorzichtig een pomp uit de conische buis met de gebogen hemostaat, waarbij extra zorg dat de pomp niet de zijkanten van de conische buis raakt. Houd de basis van de pomp met een tang en druk de stromingmodulator in de rest van de weg met de gebogen hemostaat. Houd de pomp, waar de stroming modulator en slangen ontmoeting met de gebogen hemostaat. Plaats de pomp onder de huid aan de basis van de nek en duw hem terug naar de linker achterbeen zo ver mogelijk naar binnen zonder weerstand. Wees voorzichtig om niet laten de katheter iets aanraakten. Met de gebogen hemostaat, pak de canule in de gleuf waar de top aan de sokkel. Verplaats de canule bestuurder op zijn plaats en veilig op zijn plaats. Breng een druppel superlijm op basis van de canule. Push de top van de canule in de driver en de positie zodat de buis wijst direct terug. Raak de catheter tip om bregma en de coördinaten op het digitale display op nul. Breng de katheter en verplaats 1,1 mm lateraal naar rechts en 0,5 mm posterior (Figuur 2B). Houd de huid uit de weg met de gebogen hemostaat. Rij de dunne metalen catheter door de schedel tot de plastic canule voet stevig tegen de bovenkant van de schedel wordt gedrukt. De metalen catheter kan direct door de schedel worden aangedreven in muizen door de relatieve dunne schedel. Bij gebruik van ratten, boor een gat in de schedel vóór het verlagen van de katheter. Trek elke huid die lijm op het heeft weg van de schedel. Met de canule bestuurder, houder van de canule / katheter op zijn plaats, wacht 1-2 min. tot de lijm volledig droog. Bij het ​​beoefenen, tot plaatsing van de katheter te beoordelen, injecteer 20-40 ul van 2,5% FastGreen Dye door de buis (figuur 2C). Wacht 2-3 min, perfuse de muis met 1X PBS 0,03% heparine, en verwijder de hersenen. Snijd coronaalwaarts op de katheter ter plaatse. Wanneer de katheter in het ventrikel is geplaatst, zal de kleurstof in de muis ventriculaire systeem (figuur 2D) worden geperfundeerd. Houd de katheter op zijn plaats met de gebogen hemostaat terwijl het verhogen van de bestuurder. Langzaam los de hemostaat zodat de canule correct aan de schedel wordt bevestigd. Met een wattenstaafje, drukt u op de bovenkant van de canule. Monteer de rat bot tondeuse in het bos tussen de boven-en onderkant van de canule. Knip de bovenkant van de canule terwijl nog steeds naar beneden te drukken met het wattenstaafje. Probeer en houd de tondeuse niveau, om zo niet de canule los te maken van de schedel. Als de canule komt unglued, snel re-lijm en druk uit te oefenen met een wattenstaafje voor een extra 2 minuten. Met behulp van de met 5-0 hechtdraad, regelmatige hemostaat en tangen, hechtdraad langs de volledige opening, extra aandacht rechts over de canule. We gebruiken een Running horizontale matras hechtdraad (zie figuur 5) door het grotere incisie over de schedel. Breng een schar van antibiotische zalf over het hoofd en de nek. Schroef het oor bars en draai de neuskegel. Verwijder de muis uit de stereotax en plaats op een warming pad voor herstel. Controleer de muizen nauwkeurig gedurende de duur van herstel, gewoonlijk tussen 10-30 minuten. Controleer elke 2-3 minuten totdat de muis begint rond te wandelen en verzorgen zelf. 4. Post-operatieve Zorg Controleer de muizen dagelijks na de operatie voor de eerste week. Als een muis lijkt pijn of angst, aanbevolen die de muis met een 5 mg / kg subcutane injectie van Carprofen eenmaal per 24 uur tot 5 dagen om de pijn te verlichten. Indien er sprake is van een infectie, ruim antibiotische zalf op het gebied dagelijks consulteren bijwonen dierenarts dat de wond goed geneest. Rchrap het 5-0 nylon hechtdraad 7-10 dagen na de ingreep om irritatie te voorkomen dat de hechtdraad. 5. Aanpassen of Verwijderen Alzet osmotische pomp Nadat de pomp is gedaan actief infusie ASO, kan evenmin worden veranderd of volledig verwijderd. Volg dezelfde pre-chirurgische procedure als hierboven met de volgende wijzigingen: 1) je zal niet de gebogen schaar, gebogen hemostat, rattenbeenmerg cutters, noch de digitale display nodig, en 2) in plaats van prepping de kop van de muis, scheren en desinfecteren de achterkant van de muis op de kruising van de pomp en leidingen. Voeg een 1,5 cm insnijding op de rug van de muis, loodrecht op de pomp / buizen knooppunt met tang en schaar. Trek de pomp uit de incisie zonder aanzienlijk te trekken / duwen op de buis als het kan de katheter kan jar. Om de pomp te verwijderen, knip de buis ongeveer 0,5 cm boven de stromingmodulator en raak de superlijm om de slang to seal hem dicht. Wacht 1-2 min voor de lijm te drogen. Leg de slang terug in de incisie en hechtdraad gesloten. Schar antibiotische zalf op de huid gehecht en plaats de muis op een verwarmde herstel pad. Om de pomp te veranderen, hebben versgemaakte pompen klaar samen met een 10 cm schotel gevuld met 95% ethanol. Katheters zijn niet noodzakelijk de nieuwe pompen. Pak een nieuwe pomp met de tang. Dompel je vingers in de ethanol, neemt bezit van de pomp, en gooi de stroom-modulator. Dan, voorzichtig en langzaam trek de oude pomp van de stroom modulator verbonden aan de slang en canule. Zodra het uit langzaam schuif de nieuwe pomp, zodat de stromingmodulator de buitenkant van de muis nooit raakt. Plaats de nieuwe pomp door de incisie terug in de onderhuidse pakket en hechtdraad de huid. Schar antibiotische zalf op de wond en plaats muis op herstel pad. Net als bij de pomp implantatie bewaken de muizen dagelijks na de operatie te controleren pain / ongemak en infecties. Behandelen met Carprofen en antibiotica als noodzakelijk wordt geacht. ICV BOLUS 6. Pre-operatieve procedure Volg dezelfde pre-chirurgie procedure als bedoeld in sectie 2 hierboven met de volgende wijzigingen: 1) u zult niet gebogen schaar, gebogen hemostaat of rattenbeenmerg frezen nodig; 2) schoon een 10 pi Hamilton spuit en naald met gesteriliseerd water en belasting met ASO, en 3) bevestig de spuit en naald om de stereotaxische apparaat waar de canule chauffeur was gevestigd. 7. Bolus injectie van ASO Behulp van een tang en een kleine schaar, een insnijding van de basis van de nek tot tussen de ogen. Veeg de schedel schoon met steriele wattenstaafjes, gevolgd door een wattenstaafje gedrenkt in waterstofperoxide te bregma verbeteren. Beweeg de spuit / naald op zijn plaats en veilig. Zorg ervoor dat de afgeschuinde gedeelte van de naald geconfronteerd posterior. Verlagende naald totdat deze bregma. Nul al van de coördinaten. Verplaats de naald zijdelings naar rechts 1,0 mm en anterior 0,3 mm (Figuur 3A). Langzaam rijdt de naald door de schedel net totdat de naald in een lijn staat met de bovenkant van de schedel. Opnieuw kan dit worden gedaan door de dunheid van de muis schedel. Zero de z-coördinaat en laat de naald tot -3,0 mm met een snelheid van 1 mm / sec (Figuur 3B). Wacht 2-3 min voor de hersenen te dichten rond de naald. Lever de volle 10 ul van ASO met een snelheid van 1 pl per sec. Wacht 2-3 min. We maken gebruik van een 1 ui infusiesnelheid voor ASO's in het ventrikel, hoewel dit percentage kan verschillen tussen de verschillende geneesmiddelen. Bij het beoefenen van, controleren op juiste plaatsing van de naald door het leveren van 10-20 ul van 2,5% FastGreen Dye. Perfuseren de muis met 1X PBS 0,03% heparine kort na infusie kleurstof en maak coronale secties van de hersenen te verifiëren dat de kleurstof in het ventriculaire systeem (Figuur 3C). <li> Houd een wattenstaafje tegen de schedel aan de basis van de naald. Zet de naald met een snelheid van 1 mm per seconde. Zodra de naald uit de schedel, rol het wattenstaafje over de naald gat en houd gedurende 1 minuut om te voorkomen dat ASO naar buiten lekken. Hechtdraad de huid gesloten, gelden antibiotische zalf, en plaats de muis op verwarmde herstel pad. Afhankelijk van ASO concentratie, kan het 20 minuten duren om een ​​paar uur om volledig te herstellen. Net als bij de pomp implantatie bewaken de muizen dagelijks na de operatie om te controleren of pijn / ongemak en infecties. Behandelen met Carprofen en antibiotica als noodzakelijk wordt geacht.