משלוח תוך חדרי ישיר של תרופות למערכת העצבים המרכזית מכרסם

הפרוטוקול להלן אושר על ידי הטיפול בבעלי החיים המוסדי הוועדות השתמשו באוניברסיטת וושינגטון בסנט לואיס, ועומדים במכונים הלאומי לבריאות הנחיות לשימוש בחיות ניסוי. אם זו הפעם הראשונה שלך בביצוע ניתוחים, מומלץ לבדוק את מאמר יופיטר על ניתוחים מכרסמים כהקדמה לפני תחילת 14. Asos יכול להיות מועבר למערכת העצבים המרכזית באמצעות העכבר גם משאבת עירוי האוסמוטי והזרקת בולוס ICV אחת. בגלל זה, את ההליך המפורט להלן מחולק לשני חלקים. יתרונות וחסרונות לכל שיטה יהיו נגעו בסעיף הדיון. הקואורדינטות בשימוש בפרוטוקולים הן למבוגרים וC57BL6 B6C3 עכברים. ניתן למצוא קואורדינטות חולדה מתאימות בטבלה 1. משאבה האוסמוטי ALZET 1. הכנה של משאבות אוסמוטי Alzet נשכב drap סטרילידואר ושחרר בזהירות את הפריטים הבאים על זה תוך הקפדה שלא לגעת בשום דבר באופן ישיר על מנת לשמור על סטריליות: משאבה האוסמוטי (ים), זרימת המאפנן (ים), מזרק 1 מיליליטר סטרילי (ים), להב סכין מנתחים, וחלקים של צינורות (חתיכת צינורות = 5 משאבות 1). לעכברים, יש שלוש אפשרויות למשאבות: 14 ימים, 28 ימים, ו -42 ימים (איור 2 א). פותח את הפקק ולמלא את צינורות חרוטי 50 מ"ל סטרילי עם תמיסת מלח מיליליטר 15-20. ניתן להוסיף עד 6 משאבות התאספו לצינור חרוטי. מלא צלחת פטרי P60 עם 100% אתנול. הוסף מספר המתאים של צנתרים לאתנול. לעכברים, אורך קטטר הוא 2.5 מ"מ. סנן כל ASO לכמה שיותר 1.5 צינורות מ"ל Eppendorf לפי צורך. כולל צינור Eppendorf מלא בתמיסת מלח 0.9% סטרילית כדי למלא את צינורות עם. ברגע שהכול מוכן, לשים על כפפות סטריליות. הקפד לא לגעת בשום דבר שהוא לא סטרילי. שנת כפפות לפי צורך. עבור כל ASO לשמש, למלא מזרק 1 מ"לוloadpumps על ידי הצבת את המחט לתוך החור העליון ומילוי עד להדלפות עודפות לאט החוצה. המשך עד שכל משאבות מלאות. Uncap את זרימת מאפננים ולהכניס לתוך המשאבות. דחוף את זרימת המאפנן כמעט כל הדרך ובהותיר פער מ"מ 3-5. שימוש בלהב סכין המנתחים, לחתוך כל פיסת הצינור לתוך 5 חלקים שווים. קח חתיכת צינור אחד, למלא עם תמיסת מלח סטרילית באמצעות מזרק 1 מ"ל, והכנס את החלק העליון של המאפנן לזרום לתוך קצה אחד של הצינור. אז קח את צינורית מאתנול ולחבר אותו לקצה השני של הצינור. המשאבה עכשיו התאסף מלא. מקם את המשאבה המורכבת בשלמות לתוך צינור סטרילי 50 מיליליטר חרוטי עם מי מלח לתחול. תחול מאפשר למשאבות כדי לספוג את הנוזל ליזום משלוח הסמים, כמו גם להגיע לטמפרטורה הנכונה. זמן תחול: משאבות 14 יום: 4-6 HR, משאבות 28 יום: 40 שעות, 42 משאבות יום: 60 שעות. בסיום הרכבת המשאבות, מכסה את הצינורות ומקום בחרוטים נקיים37 ° C אמבט מים עד לניתוח. 2. הליך טרום ניתוחי נגב את הכל עם 70% אתנול לחיטוי האזור ונשכב על סדינים מעוקרים בראש הטבלה וstereotax ליצור שדה סטרילי. חשוב להיות מודע לשדה סטרילי לאורך כל הניתוח. הפעל את הפעולות הבאות: מעקר חרוז, כרית חימום, אור, צג דיגיטלי, וחמצן / מערכת Isoflurane (איור 1). את הפריטים הבאים יידרשו אם עושים גם ניתוח אחד או כל אצווה של ניתוחים כפי שאנחנו עושים באופן שגרתי: 1 זוג מלקחיים, hemostat המעוגל 1, 1 זוג מספריים קטנים, 1 זוג מספריים קהים מעוגלים קטנים, חותך עצם עכברוש 1 , 1 hemostat ישר, 5-0 תפרי ניילון, צינורות חרוטי 1 עם 70% אתנול, צינור חרוטי 1 עם 95% אתנול, צינור חרוטי 1 עם יוד, צינור חרוטי 1 עם מי חמצן, חבילה של צמר גפן סטרילי, 1 בקבוק של סופר דבק, משחה אנטיביוטית צינור 1, 1 שפופרת של העיןחומר סיכה, ומכונת גילוח חשמלי 1. מניחים את העצות של שני הזוגות של מספריים, מלקחיים, וhemostat המעוקל למעקר חרוז במשך 15 שניות. הסר ולמקם ב70% אתנול. בעת ביצוע ניתוח יותר מפעם אחת, שוב לעקר את הטיפים של המכשירים שבבין בעלי חיים. הפעל isoflurane ל -4% ו-O 2-0.4 ליטר / זרימת גז ישירה לחדר ודקות. יש לנו המערכת / חמצן isoflurane המכויל לפחות אחת לשנה, כדי להבטיח שאנו מספקים את הכמות הנכונה של הרדמה. מקום עכבר בחדר ולחכות עד שנשימה מואט בצורה משמעותית. הסר את העכבר ולבצע קמצוץ הבוהן כדי להבטיח את העכבר הוא לא מודע לחלוטין. לגלח את השיער מהחלק העליון של הכתף בעד בין העיניים. אם העכבר מתחיל להתעורר, הנח את העכבר בחזרה לתוך התא עד שהעכבר הוא לא מודע לחלוטין שוב, המאשר עם קמצוץ הבוהן. מניחים את העכבר הרדים על stereotax ולדחוף את חרטומו על האף.להיות עדין כמו השיניים והעצמות שבירות. לכוון את זרימת הגז לstereotax לשמור את העכבר מורדם. חשוב לבדוק מדי פעם כדי לוודא שהעכבר הוא לגמרי לא מודע עם קמצוץ הבוהן לאורך כל הניתוח. לאבטח את הראש עם סורגי האוזן. אנחנו מעדיפים פילוס סורגי אוזן, למרות למקד חדר לרוחב, גולגולת לגמרי ברמה לא הכרחית בשל הגודל הגדול של החדר. הפעל את רמת isoflurane עד 2.0% לצורך התחזוקה. משחת עיניים תמרחי על כל עין. כפי שניתן לראות בסרטון, שכב וילון סטרילי על העכבר, כך שרק בסיס הצוואר והראש חשוף. לאחר מכן לחטא את אזור הניתוח על ידי מנגב את החלק העליון של הראש והצוואר בתנועה מעגלית מתחיל במרכזו של האזור המגולח ונע כלפי חוץ ראשון עם מקלון צמר גפן טבול ב95% אתנול, ואחריו מקלון צמר גפן הטבול ביוד. אנו ממליצים להשתמש במערכת בדיקה רקטלית משוב טמפרטורה מבוקרת חימום המבטיחהטמפרטורה של העכבר נשארה ב37 ° C. היציב אם הטמפרטורה של העכבר יורדת במהלך הניתוח, ההחלמה לאחר הניתוח עשויה להימשך זמן רב יותר וכתוצאה מהיפותרמיה יכולה להוביל לפעילות חלבון חריגה, כולל hyperphosphorylation של microtubule קשור חלבון טאו 15. לאחר הגדרת מערכת החימום, עכשיו אתה מוכן להתחיל בניתוח. 3. השתלה של משאבת אוסמוטי Alzet לפני תחילת הניתוח, לשים על זוג חדש של כפפות סטריליות. לאחר מכן, בעזרת מלקחיים ומספריים קטנים, עושה חתך בעור מבסיס הצוואר מעל הגולגולת של החיה בבין העיניים קח את המספריים הקהים עם העקומה כלפי מעלה והחלק שמתחת לעור בבסיס של הגב לכיוון צוואר hindlimb השמאל. לא צריך להיות שום התנגדות. אם יש, הוצא את המספריים ונסו שוב. זה יוצר כיס תת עורי למשאבה האוסמוטי. WiPE גולגולת נקי עם צמר גפן סטרילי, ואחריו מקלון צמר גפן טבול במי חמצן כדי לשפר גבחת. נגב את צינורות חרוטי 50 מ"ל המכילים משאבות כדי לשמור על סטריליות של המשאבות. לקחת בזהירות משאבה מצינור חרוטי באמצעות hemostat המעוגל, לוקח טיפול נוסף שהמשאבה לא נוגעת בצדדים של צינור חרוטי. החזק את הבסיס של המשאבה עם מלקחיים ולדחוף את מאפנן הזרימה בשארית הדרך עם hemostat המעוקל. החזק את המשאבה שבי מאפנן הזרימה והצינורות להיפגש עם hemostat המעוקל. הכנס את המשאבה מתחת לעור בבסיס הצוואר ולדחוף אותו בחזרה לכיוון hindlimb השמאל, עד כמה שניתן בלי התנגדות. היזהר שלא לתת לשום דבר לגעת קטטר. עם hemostat המעוגל, לתפוס את הצינורית בחריץ שבו החלק העליון עומד הכן. הזז את נהג הצינורית למקום ולאבטח את המקום. הנח טיפה אחת של דבק סופר על הבסיס של הצינורית. מוגלהשעות העליונה של הצינורית לתוך הנהג והעמדה כך שהצינורות הוא הצביע ישר בחזרה. לגעת בקצה הצנתר לגבחת ולאפס את הקואורדינטות בתצוגה הדיגיטלית. לגייס את הקטטר ולעבור 1.1 מ"מ רוחבי לימין ו0.5 מ"מ אחורי (איור 2). החזק את עור מהדרך עם hemostat המעוקל. כונן את צנתר המתכת הדק דרך הגולגולת עד בסיס צינורית הפלסטיק נלחץ היטב כנגד החלק העליון של הגולגולת. צנתר המתכת יכול להיות מונע ישירות דרך הגולגולת בעכברים עקב הגולגולת דקה יחסית. אם אתם משתמשים בחולדות, לקדוח חור בגולגולת לפני הפחתת קטטר. משוך כל עור שיש לו דבק על אותו מהגולגולת. עם נהג הצינורית מחזיק את הצינורית / קטטר במקום, לחכות 1-2 דקות לדבק להתייבש באופן מלא. בעת התרגול, כדי להעריך את מיקום צנתר, להזריק μl 20-40 של 2.5% FastGreen דאי דרך צינורות (איור 2 ג). חכה 2-3 דקות, perfusדואר העכבר עם 1X 0.03% הפרין PBS, ולהסיר את המוח. חותכים coronally באתר קטטר. אם הקטטר הונח בחדר, הצבע יהיה perfused בכל מערכת חדרית העכבר (איור 2 ד). החזק את הקטטר במקום עם hemostat המעוגל תוך העלאה את הנהג. לאט לאט לשחרר את hemostat כדי להבטיח שהצינורית מאובטחת כהלכה אל הגולגולת. עם מקלון צמר גפן, לחץ כלפי מטה על החלק העליון של הצינורית. להתאים את קוצץ עצם העכברוש לתוך המטע בין החלק העליון והבסיס של הצינורית. קליפ את החלק העליון של הצינורית ועדיין לוחץ עם קיסם אוזניים. נסה לשמור על רמת קליפרס כדי לא לנתק את הצינורית מהגולגולת. אם הצינורית אינה נעשית מופרדת מחדש דבק במהירות ולהפעיל לחץ עם מקלון צמר גפן ל2 דקות נוספות. שימוש בחוט התפר 5-0, hemostat הרגיל, ומלקחיים, התפר לאורך פתיחה המלאה, תשומת לב נוספת ממש מעל הצינורית. אנו משתמשים ברציםגרם תפר מזרן אופקי (ראה איור 5) בשל חתך הגדול יותר על הגולגולת. החלת טיפה של משחה אנטיביוטית על הראש והצוואר. ברים להתיר את האוזניים ולשחרר את חרטומו. הסר את העכבר מstereotax ומניח על כרית חימום להתאוששות. לפקח באופן הדוק את העכברים לתקופת התאוששות, בדרך כלל נע בין 10-30 דקות. בדקו כל 2-3 דקות, עד שהעכבר מתחיל להסתובב והטיפוח עצמו. 4. טיפול שלאחר הניתוח לפקח על העכברים יומיים לאחר הניתוח בשבוע הראשון. אם עכבר נראה בכאב או מצוקה, אנו ממליצים מתן העכבר עם זריקת 5 מ"ג / ק"ג תת עורית של Carprofen פעם אחת בכל 24 שעות לתקופה של עד 5 ימים על מנת להקל על הכאב. אם נראה שיש זיהום, בנדיבות להחיל משחה אנטיביוטית לאזור מדי יום, ולהתייעץ עם וטרינר על מנת להבטיח השתתפות שפצע מחלים כראוי. Rסר תפר ניילון 5-0 7-10 ימים לאחר ניתוח כדי למנוע גירוי מחוט התפירה. 5. שינוי או הסרת משאבת אוסמוטי Alzet לאחר המשאבה נעשה באופן פעיל יציקת ASO, זה יכול להיות או השתנה או הוסר לחלוטין. בצע את אותו התהליך טרום ניתוח כאמור לעיל עם השינויים הבאים: 1) אתה לא צריך את המספריים המעוגלים, hemostat המעוגל, חותכי עצם חולדה, ולא תצוגה הדיגיטלית, ו2) במקום prepping הראש של העכבר, ולגלח לחטא את החלק האחורי של העכבר בצומת של המשאבה והצינורות. ביצוע חתך 1.5 ס"מ בחלקו האחורי של העכבר, בניצב לצומת המשאבה / צינורות, באמצעות מלקחיים ומספריים. משוך בזהירות את המשאבה מתוך החתך בלי משמעותי מושך / דוחף בצינורות כפי שהוא עשוי לזעזע את הקטטר. כדי להסיר את המשאבה, קליפ צינורות כ 0.5 ס"מ מעל למאפנן הזרימה ולגעת בדבק המגע לt צינורותo חותמו בחוזקה. לחכות 1-2 דקות לדבק להתייבש. מניחים בחזרה לתוך הצינור הסגור חתך ותפרים. משחה אנטיביוטית תמרחי על העור נתפר והנח את העכבר על משטח מחומם התאוששות. כדי לשנות את המשאבה, שזה עתה עשה את המשאבות מוכנות יחד עם צלחת 10 ס"מ מלאים עם 95% אתנול. צנתרים אין צורך במשאבות החדשות. תפוס את משאבה חדשה עם המלקחיים. טובלים את האצבעות לתוך אתנול, לאחוז במשאבה, וזורקים את זרימת המאפנן. לאחר מכן, מושך בזהירות ובאיטיות את המשאבה הישנה ממאפנן הזרימה המחובר לצינורות והצינורית. ברגע שהוא כבוי, מחליק לאט משאבה החדשה ב, להבטיח כי מאפנן הזרימה לעולם לא נוגע בחלק חיצוני של העכבר. הכנס מחדש את המשאבה החדשה דרך החתך בחזרה למנה ותפר העור תת עורית. תמרחי משחה אנטיביוטית על הפצע ומקום העכבר על משטח התאוששות. בדיוק כמו עם השתלת המשאבה, לפקח על העכברים יומיים לאחר הניתוח כדי לבדוק עבור pעין אי נוחות / וזיהומים. פנק עם Carprofen ואנטיביוטיקה כהכרחי. ICV בולוס 6. הליך טרום ניתוחי בצע את אותו תהליך שלפני הניתוח כמו בסעיף 2 לעיל עם השינויים הבאים: 1) אתה לא צריך מספריים מעוגלים, hemostat המעוגל, או חותכי עצם חולדה, 2) לנקות מזרק המילטון 10 μl ומחט עם מים מעוקרים ועומס עם אסו: 3) לצרף את המזרק והמחט למנגנון stereotaxic בו נהג הצינורית היה ממוקם במקום. 7. הזרקת בולוס של ASO בעזרת מלקחיים ומספריים קטנים, עושה חתך מבסיס הצוואר עד שבבין העיניים. נגב את הגולגולת נקיות עם צמר גפן סטרילי, ואחריו מקלון צמר גפן טבול במי חמצן כדי לשפר גבחת. הזז את המזרק / המחט למקום ולאבטח. ודא שהחלק המשופע של המחט פונה אחורי. תחתוןאת המחט עד שהוא נוגע גבחת. לאפס את כל נקודות הציון. להזיז את המחט רוחבית ל1.0 מ"מ ו 0.3 מ"מ הקדמי (איור 3 א) הנכון. לאט להסיע את המחט דרך הגולגולת רק עד חור המחט מיושר עם החלק העליון של הגולגולת. שוב, אפשר לעשות את זה בשל הרזון של גולגולת העכבר. לאפס Z-הקואורדינטות ולהוריד את מחט -3.0 מ"מ בשיעור של 1 מ"מ / שנייה (איור 3). לחכות 2-3 דקות למוח כדי לאטום סביב המחט. לספק 10 μl המלא של אסו בשיעור של 1 לכל μl שניות. חכה 2-3 דקות. אנו משתמשים בקצב עירוי 1 μl לAsos לתוך החדר, אם כי שיעור זה עשוי להיות שונה בין תרופות שונות. בעת תרגול, לבדוק למיקום נכון של מחט על ידי אספקת 10-20 μl של 2.5% FastGreen דאי. Perfuse העכבר עם 1X 0.03% הפרין PBS מייד לאחר עירוי לצבוע ולעשות סעיפי עטרה של המוח כדי לוודא שהצבע הוא במערכת חדרית (איור 3 ג). <li> החזק מקלון צמר גפן כנגד הגולגולת בבסיסו של המחט. להעלות את המחט בשיעור של 1 מ"מ לשנייה. ברגע שהמחט נמצאת מחוץ לגולגולת, לגלגל את צמר גפן מעל חור המחט ולהחזיק דקות 1 כדי למנוע כל ASO מ דולף החוצה. לתפור את העור סגור, להחיל משחה אנטיביוטית, ומקום עכבר על משטח מחומם התאוששות. בהתאם לריכוז ASO, זה עלול לקחת 20 דקות לכמה שעות כדי להתאושש באופן מלא. בדיוק כמו עם השתלת המשאבה, לפקח על העכברים יומיים לאחר הניתוח כדי לבדוק אם כאב / אי נוחות וזיהומים. פנק עם Carprofen ואנטיביוטיקה כהכרחי.